CN110669149B - 半乳寡糖及衍生物和在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物或保健品中的应用 - Google Patents

半乳寡糖及衍生物和在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物或保健品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种含有D‑半乳糖和L‑半乳糖的寡糖及其衍生物和在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物或保健品中的应用。以含有D‑/L‑半乳糖的红藻多糖为原料，经物理法、化学法、生物酶法或上述方法的任意组合进行降解，制备获得不同聚合度的半乳寡糖及其衍生物，其分子骨架中含有D‑半乳糖和L‑半乳糖及其衍生物。本发明产品的原料来源于红藻多糖，具有资源丰富、制备工艺简单、安全性高，靶点明确和易于产业化等优点，用于改善线粒体功能，在防治胰岛素抵抗新药及在降血糖、降血脂和降血压等特医食品的开发领域，具有广阔的应用前景。

Description

半乳寡糖及衍生物和在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗 相关疾病药物或保健品中的应用
技术领域
本发明属于海洋药物领域，具体涉及一种含有D-半乳糖和L-半乳糖的寡糖及其衍生物和在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物或保健品中的应用。
背景技术
研究发现，长期血糖、血脂、血压异常，均会对全身脏器造成损害进而导致其功能减退，最终导致高血糖、高血脂和高血压等疾病的产生。线粒体是细胞生命活动的重要能量代谢细胞器，如线粒体功能有障碍将会导致各种代谢性疾病的产生和发展，如Shulman提出了线粒体功能障碍是胰岛素抵抗的重要机制，该观点得到了很多实验结果的支持。胰岛素抵抗状态包括肥胖、2型糖尿病等都存在线粒体功能紊乱。临床研究表明，胰岛素抵抗患者肌细胞内线粒体DNA表达下降，且线粒体数量和密度也降低，也说明线粒体功能障碍与胰岛素抵抗相关疾病关系密切。线粒体在产生ATP同时也不断产生ROS，过量的ROS对蛋白质、DNA有很强毒性。ROS在线粒体内不能被及时消除，将会增加氧化应激，损伤线粒体功能，因此氧化应激是引起线粒体功能障碍的重要因素。线粒体功能障碍激动了多种多样的丝氨酸激酶，比如JNK、IKK、PKC等。最新研究发现，与ROS相关的线粒体功能紊乱可能与IRS-1有关，表明通过调节线粒体功能的紊乱或许可以成为新的治疗胰岛素抵抗的方法。
研究表明，海藻多糖和寡糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎和增强免疫等功能。本团队在该领域作了大量研究，发现琼胶寡糖(公开号CN105168232A)具有降血脂等活性，岩藻糖硫酸酯具有抑制α-糖苷酶活性(公开号CN103288978A)，褐藻胶寡糖及其衍生物具有改善胰岛素抵抗及降血糖活性(公开号CN101649004A，公开号CN101691410A)等，但还没有发现含有D-半乳糖和L-半乳糖的寡糖及其衍生物具有靶向改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病的报道。红藻来源的半乳聚糖主要有卡拉胶系列、琼胶系列和紫菜胶系列，其中，卡拉胶系列的多糖与寡糖均由D-半乳糖及其硫酸酯衍生物组成(公开号CN1513880A，公开号CN101012249A，公开号CN101279991A)，而琼胶和紫菜胶系列的多糖与寡糖则是由D-半乳糖和L-半乳糖二种糖残基及其硫酸酯衍生物组成，琼胶与紫菜胶的不同在于前者含有较多的L-AnG，而后者含有较多6-硫酸-L-Gal，但糖组成不同则理化性质和生物学功能不同。虽然卡拉胶及其寡糖作为喷剂具有抗病毒活性(公开号CN102516323A，公开号CN104546895A)，但口服却有一定的安全隐患(Shang Q.，Toxicol Let.，2017,279:87-95)，琼胶和紫菜胶多糖与寡糖口服则安全性很高，是药物及功能食品开发的优质原料。由于半乳多糖溶解性较差，结构序列不明确，致使质量难控制，所以寡糖的制备与应用是近年来研究开发的重点。在琼胶寡糖制备技术方面，主要有酸法、酶法与化学法降解，但不同方法能获得结构与活性不同的寡糖，例如酸法降解可以得到奇数琼胶寡糖(公开号CN1513860A)，酶法降解得到新琼胶寡糖(公开号CN102827899A；公开号CN109576328A)，还原酸降解得到偶数糖醇(公开号CN100999537A)，自由基降解制备混合琼胶寡糖(公开号CN109400756A)；紫菜胶采用酸法降解(LiuY.,et al,Mar Drugs.2018,16(3).pii:E82)或者酶法降解(Zhang Y.,et al,J.Agr.Food Chem.2019,67,9307-9313)均能获得紫菜胶寡糖等。本发明在已有的降解技术基础上，进一步对所制备的各种寡糖进行定向还原和氧化反应，得到了结构与序列不同且还原端含有糖醇或糖酸结构的寡糖衍生物，并通过实验证明了这些寡糖及其衍生物具有显著改善线粒体功能的作用，可用做制备防治胰岛素抵抗和抗2型糖尿病、抗脂肪肝、抗高脂血症和抗代谢综合征的药物及其功能制品。
发明内容
本发明的目的是提供一种半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，从海洋红藻多糖中获得系列半乳寡糖及其衍生物，并证明其具有改善线粒体功能在防治胰岛素抵抗相关疾病中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
一种半乳寡糖及其衍生物，寡糖结构通式如下：
Figure BDA0002215444110000031
式中，R＝-H或-SO3Na，n＝0～30；
Figure BDA0002215444110000032
所述的半乳寡糖及其衍生物的制备方法，以富含D-/L-半乳糖及其衍生物的红藻多糖为原料，经物理降解、化学降解、酶法降解之一种或两种以上降解方法的组合，制备不同聚合度的寡糖及其衍生物，所制备的化合物结构中同时含有β-1,3-D-半乳糖(D-Gal)残基和α-1,4-L-半乳糖(L-Gal)残基，或同时含有D-Gal与α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(L-AnG)残基；在D-Gal与L-Gal糖残基的C6位羟基含有不同程度的硫酸酯化(Gal6S)修饰；所制备寡糖的非还原端是Gal，Gal6S或AnG，还原端是Gal或糖醇(Gal-OH)与糖酸(Gal-OOH)或AnG糖醇(AnG-OH)，或Gal6S及其糖醇(Gal6S-OH)与糖酸(Gal6S-OOH)。
所述半乳寡糖及其衍生物的制备方法，该半乳寡糖及其衍生物采用下述制备工艺：
琼脂糖溶于60℃热水，用缓冲液配成10mg/mL溶液，放置于30℃水浴锅内添加β-琼胶酶(CAS#37288-57-6)并搅拌降解4小时，冷却后离心，收集上清液，加2倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心，收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥，得到新琼寡糖混合物，并进一步采用硼氢化钠还原得到新琼胶寡糖醇，或者用本尼迪克试剂氧化得到新琼胶寡糖酸；或者，将琼脂糖用60℃热水溶解，采用0.1M稀盐酸配成10mg/mL溶液，于80℃搅拌降解0.5小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加2倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，进一步采用硼氢化钠还原得到琼胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到琼胶寡糖酸；或者，将硫琼胶用0.1M稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到60℃后搅拌降解1.5小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，之后旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，然后进一步经硼氢化钠还原得到硫琼胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到硫琼胶寡糖酸；或者，将紫菜胶用0.1M稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到80℃后搅拌降解2小时，冷却后用2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，之后旋蒸浓缩并冷冻干燥得到寡糖混合物，进一步采用硼氢化钠还原得到紫菜胶寡糖醇，或者采用本尼迪克试剂氧化得到紫菜胶寡糖酸。
所述的半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，具有这些结构特征的半乳寡糖及其衍生物可靶向线粒体并对其功能进行调节和保护，作为防治胰岛素抵抗相关疾病的药物或保健品。
所述的半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，该半乳寡糖及其衍生物可靶向与线粒体结合并调节其及下游信号通路功能。
所述的半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，该半乳寡糖及其衍生物能显著降低脂质积累，用做制备缓解胰岛素抵抗、抗2型糖尿病、抗代谢综合征、抗脂肪肝、抗高脂血症、保护肝脏、降血糖或降血脂的药物。
所述的半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，该半乳寡糖及其衍生物用于抗糖尿病、抗脂肪肝、保护肝脏、降血糖或降血脂的保健品；或者用于饮料、啤酒、饮食补充剂，或者与其它抗糖尿病的药物联用，或者与降血脂的药物联用；或者包含该半乳寡糖及其衍生物的复配制剂；或以该半乳寡糖及其衍生物为母核制备的衍生物用于抗糖尿病、抗脂肪肝、抗胰岛素抵抗、抗代谢综合征、抗高脂血症的药物、功能食品或者生物制品中。
所述的半乳寡糖及其衍生物在作为改善线粒体功能防治胰岛素抵抗相关疾病药物中的应用，该半乳寡糖及其衍生物与二甲双胍、达格列净、卡格列净或阿卡波糖相关临床药物形成复配制剂。
本发明的优点及有益效果是：
1、本发明含D-和L-半乳糖残基的寡糖及其衍生物能靶向线粒体，通过调节线粒体的功能缓解胰岛素抵抗。
2、本发明含D-和L-半乳糖残基的寡糖及其衍生物具有显著的降血脂效果，可用于脂肪肝、高血脂症的防治。
3、本发明产品原料来源于海洋多糖，具有资源丰富、制备工艺简单、产品稳定性好，易于产业化，安全有效等优点，用于改善线粒体功能，在防治胰岛素抵抗新药及在降血糖、降血脂和降血压等特医食品的开发领域，具有广阔的开发应用前景。
4、本发明寡糖具有抑制高脂饮食引起的高血糖，脂质积累，胰岛素抵抗、线粒体功能紊乱的作用。
5、本发明采用棕榈酸纳(PA)诱导构建的HepG2胰岛素抵抗细胞模型对所制备的系列寡糖进行缓解胰岛素抵抗等相关功能评价。研究结果表明，含D-和L-半乳糖残基及其衍生物的寡糖能靶向结合线粒体进而对其功能进行调节，具有明显降低甘油三酯、胆固醇，增加葡萄糖消耗，改善氧化应激状态，显著增加胰岛素敏感性，从而改善胰岛素抵抗，具有治疗糖尿病、脂肪肝和高血脂症的作用。
附图说明
图1为新琼四糖(a)及其糖醇(b)、糖酸(c)高分辨质谱图及结构式。图中，横坐标m/z代表质荷比，纵坐标Relative Abundance代表相对丰度。
图2为硫琼胶寡糖混合物定位于线粒体图。图中，λex＝578nm代表激发光波长为578nm，λex＝488nm代表激发光波长为488nm，SAOs代表异硫氰酸荧光素标记硫琼胶寡糖处理组，Control代表空白对照组。
图3为SAOs促进HepG2细胞线粒体增殖图。SAOs代表硫琼胶寡糖。*P<0.05，与FFA-free BSA处理组相比；#P<0.05，与PA处理组相比；@P<0.05，SAOs高剂量组与SAOs低剂量组相比。其中，(a)图为SIRT1蛋白免疫印迹图，SIRT1代表去乙酰化酶1，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(b)图为PGC1a蛋白免疫印迹图，PGC1a代表过氧化物酶体增殖激活受体1a，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(c)图为NAD+/NADH比值图，纵坐标NAD+/NADH代表氧化态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸与还原态酰胺腺嘌呤二核苷酸的比值，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理。
图4为SAOs调节胰岛素抵抗HepG2细胞线粒体功能图。*P<0.05，与FFA-free BSA处理组相比；#P<0.05，与PA处理组相比；@P<0.05，SAOs高剂量组与SAOs低剂量组相比。其中，(a)图为细胞线粒体复合物活性图，横坐标ComplexⅠ、ComplexⅢ、ComplexⅣ分别代表线粒体复合物I、III、Ⅳ，纵坐标Complex enzymatic activity代表相应的线粒体复合物活性；(b)图为细胞呼吸耗氧图，横坐标Time代表时间(分钟)，纵坐标Fluorescence intensity(a.u.)代表荧光强度；(c)图为胞内ADP/ATP图，ADP/ATP ratio代表二磷酸腺苷和三磷酸腺苷的含量比值，纵坐标Fold change代表与对照组相比各组的ADP/ATP比值改变，PA(0.2mM)代表表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(d)图为JC-1荧光探针聚合体和单体的含量比值图，纵坐标Ratio of JC-1 polymer/monomer代表荧光探针JC-1聚合体和单体的含量比值，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理。
图5为SAOs改善胰岛素抵抗HepG2细胞氧化应激状态图。*P<0.05，与FFA-free BSA处理组相比；#P<0.05，与PA处理组相比；@P<0.05，SAOs高剂量组与SAOs低剂量组相比。其中，(a)图为各种氧化指标含量图，横坐标SOD(U/mg)、CAT(U/mg)、MDA(nmol/mg)分别代表超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和丙二醛，纵坐标Content代表各种氧化指标含量；(b)图为ROS活性氧含量图，Control代表空白对照组，Model代表0.2mM棕榈酸钠处理组，SAOs-L代表0.2mM棕榈酸钠和10μM SAOs处理组，SAOs-H代表0.2mM棕榈酸钠和50μM SAOs处理组；(c)图为JNK蛋白磷酸化水平图，JNK代表c-Jun氨基端激酶，pJNK代表磷酸化的c-Jun氨基端激酶，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(d)图为c-Jun蛋白磷酸化水平图，c-Jun为一种核内原癌基因，p-c-Jun代表磷酸化的c-Jun蛋白，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理。
图6为SAOs增加胰岛素抵抗HepG2细胞胰岛素敏感性图。*P<0.05；NS:nostatistically significant difference表示无统计学显著差异。其中，纵坐标Glucoseconsumption fold of control代表与对照组相比各组的葡萄糖消耗量变化，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理，Insulin(1μM)代表加入1μM的胰岛素处理。
图7为SAOs激活HepG2细胞胰岛素信号通路并调节糖代谢图。*P<0.05，与FFA-freeBSA处理组相比；#P<0.05，与PA处理组相比；@P<0.05，SAOs高剂量组与SAOs低剂量组相比。其中，(a)图为IRS-1蛋白磷酸化水平图，IRS-1代表胰岛素受体底物1，pIRS-1代表磷酸化的胰岛素受体底物1，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(b)图为AKT蛋白磷酸化水平图，AKT代表蛋白激酶B，pAKT代表磷酸化的蛋白激酶B，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(c)图为GSK-3β蛋白磷酸化水平图，GSK-3β代表糖原合成酶激酶-3，pGSK-3β代表磷酸化的糖原合成酶激酶-3，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(d)图为GS蛋白磷酸化水平图，GS代表糖原合成酶，pGS代表磷酸化的糖原合成酶，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理。
图8为SAOs减少胰岛素抵抗HepG2细胞脂质合成和积累图。*P<0.05，与FFA-freeBSA处理组相比；#P<0.05，与PA处理组相比；@P<0.05，SAOs高剂量组与SAOs低剂量组相比。其中，(a)图为HMGCR蛋白磷酸化水平图，HMGCR代表羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，pHMGCR代表磷酸化的羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(b)图为ACC蛋白磷酸化水平图，ACC代表乙酰辅酶A羧化酶，pACC代表磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(c)图为SREBP-1C蛋白前体与成熟体表达水平图，SREBP-1C代表固醇调节元件结合蛋白-1C，β-actin代表β-肌动蛋白，PA(0.2mM)代表0.2mM棕榈酸钠，SAOs(μM)代表不同浓度SAOs处理；(d)图为细胞内TC和TG含量图，TC代表总胆固醇，TG代表甘油三酯，纵坐标Content(μg/mg protein)代表每毫克细胞蛋白中TC和TG的含量。
具体实施方式
下面，结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
实施例1：含有6-O-硫酸-β-1,3-D-半乳糖(Gal6S)和α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)硫琼胶寡糖(SAOs)、寡糖醇(SAOs-OH)及寡糖酸(SAOs-OOH)的制备。
将1000mg硫琼胶多糖用摩尔浓度0.1M的稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到60℃，搅拌降解1.5小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加入3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，减压旋蒸去除乙醇后，用200Da透析袋透析脱盐，经旋蒸浓缩、冷冻干燥得到SAOs。取100mg SAOs，将其溶于10毫升摩尔浓度100mM的NaBH4水溶液(含摩尔浓度100mM的NaOH)于4℃过夜反应，加入醋酸调pH至7.0，经透析脱盐，冷冻干燥得寡糖醇SAOs-OH。再取200mg SAOs，将其溶于5毫升新配制的本尼迪克试剂中，55℃加热反应至无砖红色沉淀产生，离心取上清液，经阳离子交换树脂去除残余铜离子，调pH至中性，经透析脱盐，冷冻干燥，得到寡糖酸SAOs-OOH。
所制得的SAOs系列硫琼胶寡糖醇、寡糖酸和寡糖的结构式如下：
Figure BDA0002215444110000091
式中，R＝-SO3Na；n＝0-30；
Figure BDA0002215444110000092
实施例2：含有β-1,3-D-半乳糖(Gal)和6-O-硫酸-α-1,4-半乳糖(Gal6S)的紫菜胶寡糖(POs)、寡糖醇(POs-OH)和寡糖酸(POs-OOH)的制备。
将紫菜胶用摩尔浓度0.1M的稀硫酸配成10mg/mL水溶液，加热到80℃，搅拌降解2.0小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，加入4倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，减压旋蒸去除乙醇后，用200Da透析袋脱盐，经旋蒸浓缩、冷冻干燥得到紫菜胶寡糖POs。取POs寡糖150mg，将其溶于15毫升摩尔浓度150mM的NaBH4水溶液(含摩尔浓度150mM的NaOH)于4℃过夜反应，加入醋酸调pH至7.0，经透析脱盐，冷冻干燥，得紫菜胶寡糖醇POs-OH。再取100mg的POs，将其溶于3mL新配制的本尼迪克试剂中，55℃加热搅拌反应，至无转红色沉淀产生后，离心取上清液，经阳离子交换树脂去除残余铜离子，调pH至中性，经透析脱盐，冷冻干燥，得到紫菜胶寡糖酸POs-OOH。
所制备的紫菜胶POs寡糖醇、寡糖酸及其寡糖的结构式如下：
Figure BDA0002215444110000093
式中，R＝-H,或-SO3Na；n＝0-30；
Figure BDA0002215444110000094
实施例3：含有β-1,3-D-半乳糖(Gal)和α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)的琼胶寡糖及其寡糖醇和寡糖酸的制备。
将琼脂糖用热水溶解，采用摩尔浓度0.1M的稀盐酸配成10mg/mL溶液，于80℃搅拌降解0.5小时，冷却后用摩尔浓度2M的NaOH水溶液中和，离心收集上清液，然后加2.5倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到琼寡糖AOs，进一步采用硼氢化钠还原得到琼胶寡糖醇AOs-OH，或者采用本尼迪克试剂氧化得到琼胶寡糖酸AOs-OOH。琼胶寡糖醇、寡糖酸及其寡糖的化学结构式如下：
Figure BDA0002215444110000101
式中，n＝0-30；
Figure BDA0002215444110000102
实施例4：含有α-1,4-L-3,6-内醚半乳糖(AnG)和β-1,3-D-半乳糖(Gal)新琼胶寡糖及其糖醇和寡糖酸的制备。
将琼脂糖用60℃热水溶解，配成10mg/mL水溶液，放置30℃水浴锅内，加入β-琼胶酶，恒温搅拌酶解4小时，立即置于95℃水浴锅使酶变性10分钟后冷却到室温，离心收集上清液，然后加3倍体积95％医用乙醇于4℃过夜，离心收集上清，旋蒸去除乙醇，用200Da透析袋透析脱盐，旋蒸浓缩并冷冻干燥得到新琼寡糖NAOs，进一步采用硼氢化钠还原得到新琼胶寡糖醇NAOs-OH，或者采用本尼迪克试剂氧化得到新琼胶寡糖酸NAOs-OOH。所制备的新琼胶寡糖醇、寡糖酸及寡糖的化学结构式如下：
Figure BDA0002215444110000103
式中，n＝0～30；
Figure BDA0002215444110000111
为了验证所得寡糖醇的序列结构，可以将酶解得到的新琼胶寡糖用Superdex 30柱分离纯化，得到新琼四糖纯品(图1a),采用碱性硼氢化钠还原方法制得新琼四糖糖醇，所得产品的高分辨质谱(ESI-MS)分析结果如图1b所示。同样，将所得新琼四糖采用本尼迪克定向氧化方法获得新琼四糖酸产品，其高分辨质谱(ESI-MS)分析结果如图1c所示。
实施例5：硫琼胶寡糖SAOs靶向线粒体实验
为了研究SAOs与线粒体的相互作用(图2)，用FITC标记SAOs，用MitoTracker RedCMXRos标记线粒体，再用FITC标记的SAOs与HepG2细胞共培养。激光共聚焦结果显示，FITC-SAOs(绿色)和Mito Tracker-Red CMxros(红色)结合后产生了橙黄色荧光，表明SAOs能定位于细胞线粒体。
实施例6：SAOs促进线粒体增殖实验
为了研究SAOs对线粒体增值效果设计了系列实验(图3)，从Western-blot结果可知，SAOs能上调胰岛素抵抗HepG2细胞SIRT1和PGC1α的表达，同时SAOs能显著增加NAD+/NADH比率。因此，SAOs处理的HepG2细胞中SIRT1的表达和活性均显著增加(P<0.05)(图3a和3c)并进一步上调PGC1α的表达量(图3b)。以上结果表明SAOs可能依赖于AMPK/SIRT1/PGC1α介导线粒体的产生，并缓解了PA诱导的线粒体功能障碍。
实施例7：SAOs调节胰岛素抵抗所致细胞线粒体功能实验
为了研究SAOs对线粒体功能的影响，我们分析了不同处理对HepG2细胞线粒体呼吸链复合物活性、细胞耗氧量、ADP:ATP比值、线粒体膜电位(Δψm)的影响(图4)。PA处理显著增加线粒体复合物I、III和IV的活性，但SAOs处理显著缓解了这一线粒体不良状态(图4a)，这进一步降低了细胞耗氧量。用
Figure BDA0002215444110000112
Xtra荧光探针检测细胞耗氧量，结果表明SAOs以剂量依赖性方式逆转PA诱导的细胞耗氧量增加(图4b)。因此，SAOs显著增加PA诱导的胰岛素抵抗HepG2细胞中ADP:ATP比值(图4c)进而激活AMPK。同时补充SAOs可防止PA引起的Δψm降低(图4d)。因此，SAOs可通过对线粒体功能的保护和调节作用改善胰岛素抵抗。
实施例8：SAOs改善细胞氧化应激状态实验
为了研究SAOs的抗氧化能力，我们分析了不同处理对HepG2细胞氧化应激状态的影响(图5)。我们发现，与对照组相比，PA处理导致CAT和SOD酶活性降低，而MDA含量显著增加。SAOs可以有效的改善这种情况(图5a，其中蓝色代表空白对照组，红色代表PA处理组，绿色代表SAOs低剂量处理组，橙色代表SAOs高剂量处理组)。最后，我们利用DHE原位荧光染色评价了SAOs对HepG2细胞内活性氧水平的影响(图5b)。与对照组相比，PA处理可显著提高DHE氧化后的荧光强度和荧光面积，表明PA可提高HepG2细胞的活性氧水平。然而，SAOs治疗显著降低了ROS的生成水平，且作用呈剂量依赖性。我们进一步研究了在PA诱导的胰岛素抵抗细胞模型中，SAOs是否能抑制JNK/c-Jun通路活性。结果显示在PA诱导胰岛素抵抗HepG2细胞中JNK及其下游靶蛋白c-Jun的磷酸化显著增加(图5c和图5d)。SAOs处理可显著(P<0.05)逆转JNK和c-Jun的磷酸化水平的升高。这些结果表明，SAOs通过剂量依赖性抑制ROS/JNK/c-Jun途径有效地缓解胰岛素抵抗HepG2细胞中的氧化应激。
实施例9：SAOs增加细胞胰岛素敏感性实验
为了研究SAOs对胰岛素的敏感性，设计一下实验。在96孔板中以每孔接种2×104个HepG2细胞，培养24h后在无血清MEM中饥饿24h，然后用棕榈酸钠(PA)和/或SAOs处理24h，用FFA free-BSA作为空白对照。然后，在含有或者不含胰岛素的无酚红MEM培养基中孵育4h，随后收集培养基。用葡萄糖氧化酶过氧化物酶法检测培养基中葡萄糖残留。用无酚红MEM总葡萄糖减去培养基中的残余葡萄糖，计算不同处理HepG2细胞葡萄糖消耗量。从图6可知，PA处理使葡萄糖消耗降低30％(P<0.05)且PA处理组与PA/胰岛素处理组组葡萄糖消耗无显著性差异。这些结果表明0.2mM的PA能成功诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗。接下来，我们评价了SAOs对胰岛素敏感性和葡萄糖消耗的影响。SAOs/PA处理组的葡萄糖消耗量较PA处理组提高约20％(P<0.05)。此外，与PA处理组相比，胰岛素能显著(P<0.05)增加SAOs/PA处理组葡萄糖消耗。综上所述，SAOs显著提高了IR情况下HepG2细胞的胰岛素敏感性。
实施例10：SAOs激活细胞胰岛素信号通路实验
通过Western Blot实验研究SAOs对胰岛素信号通路的影响(图7)。实验结果表明，PA诱导胰岛素抵抗(IR)后，经SAOs处理，可显著提高IRS-1(S318)和Akt(S437)的磷酸化水平(P<0.05)(图7a和图7b)。SAOs处理后，IRS-1下游靶蛋白GSK-3β和GS的磷酸化显著降低(P<0.05)(图7c和图7d)，这能显著增加糖原的合成并减少糖异生。可见，SAOs通过激活胰岛素抵抗细胞中的IRS-1/Akt/GSK-3β/GS信号通路来上调胰岛素信号传导并增加胰岛素敏感性，进而发挥调节糖代谢功能。
实施例11：SAOs降低细胞脂质积累实验
通过研究SAOs对胰岛素抵抗细胞中AMPK的磷酸化水平及对AMPK下游靶点的影响，研究SAOs对细胞脂质代谢的影响，结果见图8。从图8a-c可知，SAOs显著逆转了PA诱导的pHMGCR和pACC水平的降低，并显著增加SREBP-1C前体与成熟体的比率，表明SAOs通过增加HMGCR的磷酸化降低其活性，从而快速降低胆固醇生物合成。与PA处理的细胞相比，SAOs显著增加了ACC磷酸化水平(P<0.05)，抑制脂肪酸的生物合成并增强脂肪酸的氧化。此外，SAOs降低了SREBP-1C成熟体(68kDa)与前体(125kDa)的比例，从而减TG积累和胆固醇的合成，增加脂肪酸β-氧化。SAOs处理后，IR细胞内TC和TG含量显著降低(P<0.05)，呈剂量依赖性(图8d中，蓝色代表空白对照组，红色代表PA处理组，绿色代表SAOs低剂量处理组，橙色代表SAOs高剂量处理组)。总之，SAOs通过调控AMPK及其下游靶蛋白(如HMGCR、ACC和SREBP-1C)调节胰岛素抵抗细胞的脂质代谢和脂质积累。
以上实验结果表明，半乳寡糖能明显增强棕榈酸钠(PA)诱导胰岛素抵抗HepG2细胞模型的胰岛素敏感性，缓解胰岛素抵抗。由激光共聚焦实验可知，SAOs在HepG2细胞中主要定位于线粒体。通过与线粒体的相互作用，SAOs调节线粒体的功能，进而起到抗糖尿病、缓解脂肪肝的作用。在PA诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗细胞模型中，SAOs能显著缓解IR细胞氧化应激状态，从而通过ROS/JNK/IRS-1信号通路增强胰岛素细胞敏感性；SAOs通过PKA/LKB1及线粒体调节的能量代谢通路激活AMPK及其下游靶蛋白(例如：ACC、HMGCR和SREBP-1C)，进而起到减少脂质的积累且增加脂质代谢的效果，表明SAOs能够减轻肝脏脂肪的积累，起到缓解脂肪肝的功效；SAOs通过激活IRS-1/AKT/GSK-3β/GS信号通路和AMPK/GS信号通路调节胰岛素抵抗HepG2细胞的糖元合成和糖异生，从而增加糖代谢，起到降血糖效果。
综上，本发明的寡糖能靶向线粒体，通过调节线粒体功能进而起到抗脂肪肝、缓解胰岛素抵抗、抗2型糖尿病、抗代谢综合征、抗高血脂症的效果，宜于作为缓解胰岛素抵抗、防治脂肪肝、降血糖、防治2型糖尿病、防治代谢综合征、治疗高血脂候选药物或保健品或复配制剂应用。实施例结果表明，本发明的硫琼胶寡糖(SAOs)对胰岛素抵抗具有显著的化解、对脂肪肝的保护作用以及对糖脂代谢的调节作用效果明显。SAOs能够显著增强胰岛素敏感性、缓解细胞脂质积累以及增加细胞糖脂代谢功能，从而实现对胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、脂肪肝、高脂血症的治疗作用。本发明产品来源于海洋红藻寡糖，具有资源丰富、易于产业化，安全有效等诸多优点，在防治胰岛素抵抗、2型糖尿病、代谢综合征、脂肪肝、高脂血症、高血压等方面具有广阔的开发应用前景。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例中所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种半乳寡糖及其衍生物，其特征在于，寡糖结构通式如下：
Figure 555030DEST_PATH_IMAGE001
式中，R =-SO3Na，n= 0~30；
Figure 69188DEST_PATH_IMAGE002
。
2.一种权利要求1所述的半乳寡糖及其衍生物的制备方法，其特征在于，以富含D-/L-半乳糖及其衍生物的红藻多糖为原料，经物理降解、化学降解、酶法降解之一种或两种以上降解方法的组合，制备不同聚合度的寡糖及其衍生物。
3.按照权利要求1所述的半乳寡糖及其衍生物，其特征在于，具有这些结构特征的半乳寡糖及其衍生物，作为防治胰岛素抵抗相关疾病的药物或保健品。
4.按照权利要求3所述的半乳寡糖及其衍生物，其特征在于，该半乳寡糖及其衍生物用做制备抗代谢综合征、保护肝脏、降血糖或降血脂的药物。
5.按照权利要求3所述的半乳寡糖及其衍生物，其特征在于，该半乳寡糖及其衍生物用于保护肝脏、降血糖或降血脂的保健品；或者用于饮料、啤酒、饮食补充剂，或者与其它抗糖尿病的药物联用，或者与降血脂的药物联用；或者包含该半乳寡糖及其衍生物的复配制剂；或以该半乳寡糖及其衍生物为母核制备的衍生物用于抗糖尿病、抗代谢综合征、抗高脂血症的药物、功能食品或者生物制品中。
6.按照权利要求3所述的半乳寡糖及其衍生物，其特征在于，该半乳寡糖及其衍生物与二甲双胍、达格列净、卡格列净或阿卡波糖相关临床药物形成复配制剂。
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