CN112458126B - 一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，紫菜琼胶提取物依次经过稀酸降解、酶降解和稀酸降解，分离纯化后得到半乳糖硫酸酯化合物。具体为，将紫菜琼胶提取物溶液加入稀酸至终浓度为0.01~0.1%，60~70℃降解1~3h；用碱溶液调节pH值至6.0~8.0，加入半乳聚糖糖链降解酶，30~40℃下搅拌或震荡反应3~5h；再加入稀酸至终浓度0.01%~0.1%，30~40℃温和反应1~3h；使用阴离子交换色谱柱层析进行单糖分离纯化。本方法可高效地将紫菜多糖聚合物完全降解为单糖化合物，并得到了一种具有优异抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物D半乳糖‑4‑硫酸酯，非常适合应用于研发制备抗炎药物及具备抗炎功效的护肤品、保健品等领域。

Description

一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法及其 应用

技术领域

本发明涉及生物化学领域，具体是一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法及其应用。

背景技术

海洋藻类来源丰富，具备巨大的科研价值和经济价值潜力。过去的几十年中，从海藻中分离出很多天然化合物，并且这些化合物已被证明具有很高的生物活性。这些化合物以多糖类物质为主，它们大多具备抗癌、抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗哮、免疫调节、抗凝血作用等多种功效，但也有其局限性。主要是由于多糖化合物为高分子化合物，大多在水中溶解度低，分子量大，不利于人体吸收。且天然的多糖物质多为杂聚多糖，除主要活性成份外，或多或少会存在其他单体成分，易带来安全性隐患。这都限制了其直接作为药物或作为药物合成原料、药物载体的应用范围。

以近年来的研究热点，岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)为例。其来源为褐藻，主要由含硫酸基岩藻糖(Fucose)组成，其次还伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、糖醛酸等，是一种水溶性的杂聚多糖。它具备抗凝血、降血脂、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种作用。但由于其相对分子质量较大，几十万甚至上百万不等，难于被人体直接吸收。本申请人研究团队通过降解，制备的低分子量岩藻聚糖硫酸酯LJSF4(104.3kDa)，使其具备了相对更好的吸收性。但是其在50ug/mL浓度下即对小鼠巨噬细胞RAW246.7表现出细胞毒性，细胞存活率下降到80％以下，同时该物质最多可将LSP处理过的RAW 264.7细胞NO释放量降低至59.32％，安全性和抗炎活性仍不够理想。

相比岩藻聚糖，主链为半乳聚糖的紫菜多糖理论上具有更好的生物相容性。紫菜多糖是一种硫酸化的多糖，是紫菜属的植物所特有的多糖成分，它存在于紫菜的细胞壁中，占紫菜干重的20-40％。它的主要结构单元是→3)β-D-半乳糖-(1→4)-α-L-6-硫酸基-半乳糖-(1→，其中部分α-L-6-硫酸基-半乳糖被L-3,6-内醚半乳糖代替，形成结构单元：→3)-β-D-半乳糖-(1→4)-α-L-3,6内醚半乳糖-(1→。紫菜多糖已被证实具备多种生物活性，但是它同样存在前述多糖物质的局限性。另外，现有文献证实，其理论上的功效点有多种，可能具备协同效应，但由于其聚合物的特性，难以更细致地对其有效结构进行定量研究。因此，进一步对紫菜多糖进行研究并提高其产业价值均需要对其进行降解分离纯化。但目前紫菜多糖的常规降解技术中，酸法或物理降解法产物分子量分布繁杂，活性基团(硫酸根等)损失大，有的方法还可能产生副产物；而酶法成本高、效率低，且也只能制备寡糖而无法进一步提纯。目前国内外仍未见能够对紫菜多糖进行彻底降解分离纯化并对其纯化产品进行活性表征的研究报道和产品技术。

发明内容

针对上述现有技术的问题，本发明提供了一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，紫菜琼胶提取物依次经过稀酸降解、酶降解和稀酸降解，分离纯化后得到半乳糖硫酸酯化合物。

具体的，包括以下几个步骤：

S1，以紫菜为原料，经乙醇除杂，制备提取紫菜琼胶提取物；

S2，向1～5％的PA溶液中加入稀酸至终浓度为0.01～0.1％，60～70℃降解1～3h；在不破坏硫酸根的前提下，将高分子多糖分解为分子量相对更小的寡糖，便于后续处理；

S3，用碱溶液调节pH值至6.0～8.0，加入半乳聚糖糖链降解酶，30～40℃下搅拌或震荡反应3～5h，半乳聚糖糖链降解酶能够将小分子寡糖进一步降解至二糖；

S4，向S3制备的溶液中加入稀酸至终浓度0.01％～0.1％，30～40℃温和反应1～3h，从而将二糖进一步完全降解为单糖；

S5,将S4产物使用阴离子交换色谱柱层析进行单糖分离纯化，收集第三个色谱峰的组分，除盐，减压浓缩，冷冻干燥，得半乳糖硫酸酯化合物。

具体的，所述紫菜为条斑紫菜，优选的，为江苏以北山东产的条斑紫菜。北方海水温度低于南方，其所产紫菜生长周期长，琼胶多糖结构与南方紫菜不同，琼胶中分离所得硫酸半乳聚糖的硫酸根含量高。

具体的，所述稀酸为稀盐酸、稀硫酸、稀磷酸、柠檬酸中的一种或几种组合。适中浓度的稀酸能够破坏聚合结构，同时不会造成硫酸根的大量解离。

具体的，所述半乳聚糖糖链降解酶为α琼胶酶、β琼胶酶、紫菜多糖降解酶、卡拉胶酶的一种或几种组合。半乳聚糖糖链降解酶能够将琼胶分子进行内切或外切，将寡糖进一步分解得到新琼二糖。但是其制备效率低，且无法进一步制备单糖，必须与酸法相互结合多步降解。

优选的，所述半乳聚糖糖链降解酶用量为500～1000U。

具体的，所述调节pH值的碱溶液可以为氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。

具体的，S1紫菜琼胶提取物的制备步骤具体为：

S11，将紫菜粉碎过筛，用95％乙醇在40℃搅拌2h，除去多酚、色素等脂溶性小分子杂质；

S12，脱脂后的紫菜粉末加入纯水于高压灭菌锅中120℃加热提取2h,冷却至室温，浓缩过滤；

S13,向浓缩液中加入数倍体积的95％乙醇，并于4℃下醇沉，离心后将沉淀物复溶于水，冻干，得紫菜琼胶提取物。

这样，通过乙醇处置，去除杂质，高温水提取，不会破坏硫酸根等有效结构，也不会引入其他物质。

具体的，所述S5单糖分离纯化具体设备和工艺为：

S51，采用阴离子交换色谱柱对单糖进行分离；

S52，收集第三个色谱峰的组分，除盐；

S53，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到纯品。

主要收集含有硫酸根结构的第三个色谱峰组分。

此外，本发明通过提取活性组分，提供了一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物，并提供其在药物和护肤品、保健品中的抗炎应用。具体的，其为D半乳糖-4-硫酸酯，结构式为：

经RAW264.7细胞试验验证，此种单糖硫酸酯可在50～400μg/mL的浓度下均未表现出细胞毒性，可在较高浓度下安全使用。使用浓度在400μg/ml的D半乳糖-4-硫酸酯干预LPS诱导的巨噬细胞后，细胞中iNOS蛋白表达量降低到29.17％，COX-2表达量降低了41.51％，NO释放量降低至33.86％，证明此种化合物具备非常优异的抗炎效果。相比岩藻聚糖硫酸酯等现有藻类活性提取物，安全性和抗炎活性都有显著提升。

因此，此种化合物可作为药物或与其他成分组合作用的药物载体、药物合成原料，也可作为安全的抗炎有效成分添加到护肤品、保健品中。

本发明的有益效果是，首创性地实现了从紫菜原料中将多糖组分高效地完全降解为单糖，并由此进行分离纯化，得到了单糖抗炎活性成分。此活性成分安全、高效，且作为小分子单一组分便于定量使用，也便于合成应用，具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明所制备的D半乳糖-4-硫酸酯的结构式

图2为本发明半乳糖硫酸酯化合物制备方法步骤S5中DEAE-Sepharose阴离子交换色谱柱分离色谱图；

图3为本发明制备的半乳糖硫酸酯化合物F3活性组分的红外光谱分析图；

图4为本发明制备的半乳糖硫酸酯化合物F3活性组分的高分辨质谱分析图谱；

图5为不同浓度的半乳糖硫酸酯化合物作用于RAW 264.7细胞时细胞存活率的影响；

图6为不同浓度的半乳糖硫酸酯化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生量的影响；

图7为不同浓度的半乳糖硫酸酯化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞iNOS和COX-2蛋白表达影响的蛋白质免疫印迹法(WB)实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。

制备实施例1

(1)一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，包括以下步骤：

S1，琼胶的制备。以山东产条斑紫菜为原料，将干燥的条斑紫菜经粉碎机粉碎后，过60目筛，准确称取紫菜粉末15g于1L烧杯中，加入300mL 95％乙醇，40℃搅拌2h，以除去多酚，色素等脂溶性小分子杂质。脱脂后的紫菜粉末加入450mL的纯水于高压灭菌锅中120℃，提取2h。冷却至室温，提取液经过滤、浓缩，向浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇。浓缩液于4℃醇沉过夜后，于3500r/min离心15min，所得沉淀复溶于水后冻干，得到紫菜琼胶提取物(以下命名为PA)。

S2，琼胶的初步降解。向2％的PA溶液中加入稀盐酸至终浓度0.01％，60℃降解2h。

对寡糖得率及硫酸根解离率进行检验：对降解产物进行3000Da超滤分级，收集滤过液。滤过液组分的分子量<3000Da,即为聚合度大约<20DP的寡糖。用总糖测定方法测定滤过液及PA溶液的糖含量，计算寡糖得率(％)＝滤过液的糖含量/PA溶液的糖含量×100％。用硫酸钡比浊法测定滤过液及PA溶液的硫酸根含量，计算硫酸根解离率(％)＝滤过液的硫酸根含量/PA溶液的硫酸根含量×100％。

得到此制备条件下，寡糖得率为63.62％，硫酸根解离率为2.08％。

S3，用氢氧化钠溶液调节pH值至约7.0，加入500U AgarioransalbusYKW-34产β琼胶酶AgaA34，在40℃温度下200rpm搅拌或震荡反应3h。

其中，取少量上清液测定新琼二糖的得率。对上清液进行HPLC分析，由峰面积测定新琼二糖的质量，新琼二糖得率(％)＝新琼二糖的质量/PA溶液的糖含量×100％。

得到此制备条件下，新琼二糖得率为55.62％，硫酸根解离率为2.58％。

S4，向溶液中加入稀盐酸至终浓度为0.02％，30℃温和反应1h。

S5，在Akta Pure纯化仪上采用DEAE-Sepharose阴离子交换色谱柱对单糖进行分离，分离色谱图见图2。经分子量测定及结构表征可知F1为3,6内醚-L-半乳糖，F2为L-半乳糖或D-半乳糖，F3为含有硫酸根的D-半乳糖。由此可知，多糖已完全降解为单糖。

收集F3组分，在Akta Pure纯化仪上采用Bio-gel P2进行除盐，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到纯品。

经测定，F3组分得率为5.30％。

(2)结构判断及表征：

依据图3红外光谱分析，F3组分结构特征分析如下：

3419：O-H伸缩振动；2930：C-H变角振动；1668、1606：H₂O；1525：C-O伸缩振动；1395：C-H伸缩振动；1250：S＝O键的总和；1137：C-O-C键；1021：吡喃环；850：C-4位上S的直立键(由此判断是4-硫酸酯)；787：骨架六元环C-C。

结合图4质谱分析，其负离子模式[M-H]^-分子量为259，故其分子量[M]为260，解析的结构如下：

为D半乳糖-4-硫酸酯。

制备实施例2

S2中向2％的PA溶液中加入稀盐酸至终浓度0.05％，65℃降解2.5h。S4中采用0.05％的稀盐酸40℃条件下反应2小时，其余制备方法和条件与实施例1一致。

经测定：

S2后寡糖得率为78.73％，硫酸根解离率为3.26％。相比实施例1，硫酸根解离率略有上升，但是降解效率大幅提高。

S3后新琼二糖得率为62.73％，硫酸根解离率为3.92％，产率得到提升。

最终F3组分得率6.56％。较实施例1有较高提升。

制备实施例3

S2中向2％的PA溶液中加入稀盐酸至终浓度0.1％，70℃降解3h。S4中采用0.1％的稀盐酸35℃条件下反应3小时，其余制备方法和条件与实施例1一致。

经测定：

S2后寡糖得率为85.66％，硫酸根解离率为4.83％。相比实施例2，硫酸根解离率上升，降解效率提升幅度相对实施例2对实施例1的提升幅度较小。

S3后新琼二糖得率为75.66％，硫酸根解离率为5.20％，产率得到提升，但硫酸根解离率也较高。

最终F3组分得率6.81％。相对实施例2提升较小。

制备对比例1

仅采用实施例3的S1、S2两步对琼脂进行一步酸解。然后对产物进行HPLC分析，产物分子量范围很宽，包括聚合度超过20DP的寡糖在内，硫酸根解离率为4.83％，组成非常复杂。由HPLC峰面积测定单糖含量低，仅占寡糖总量的5％左右，且难以提纯。

制备对比例2

采用实施例1中S1的方法制备琼脂后，向2％的PA溶液中加入500UAgarioransalbusYKW-34产β琼胶酶AgaA34，在40℃温度下200rpm搅拌或震荡反应12h。测定新琼二糖得率为36.55％，硫酸根解离率4.25％。

在长时间的酶降解后，产率和硫酸根解离率都不理想，且无单糖成分检出。

制备对比例3

采用实施例1的方法制备琼脂后，向2％的PA溶液中加入1000UAgarioransalbusYKW-34产β琼胶酶AgaA34，在40℃温度下200rpm搅拌或震荡反应12h。测定新琼二糖得率为45.20％，硫酸根解离率3.87％。

大幅增加酶用量，效率提升有限。且同样无法产出单糖。

活性测试例

(1)细胞毒性评估。

将D半乳糖-4-硫酸酯以不同浓度作用于RAW 264.7细胞24h后，利用MTT法检测各组分细胞存活率。如图5可知，LPS处理细胞后，细胞存活率降至80％以下，但经F3组分处理后，与空白组(细胞存活率为100％)相比，添加D半乳糖-4-硫酸酯浓度为50、100、200和400μg/mL时细胞活力均显著增加，且细胞存活率均在90％以上。该结果表明，D半乳糖-4-硫酸酯在上述浓度范围内未表现任何细胞毒性。

(2)抗炎活性表征。

不同浓度梯度D半乳糖-4-硫酸酯干预RAW 264.7细胞24h后，取上清液，对其NO含量进行测定。结果如图6所示，正常状态下，细胞的NO分泌水平极低。当细胞在50～400μg/mLF3的作用下培养24h后，与LPS组比较，NO释放量明显降低。随着样品浓度的增加，细胞NO释放量呈明显的下降趋势，且具有一定的剂量依赖性。且在D半乳糖-4-硫酸酯添加量为400μg/mL时，与LPS组相比，NO释放量降低至33.86％。该实验结果表明，D半乳糖-4-硫酸酯具有良好的NO抑制作用，表现出良好的抗炎活性。

(3)抗炎机理验证。

NO的产生是由iNOS的表达介导的，并且iNOS参与炎症过程并起到主导作用。在LPS诱导的炎症细胞中，利用蛋白质免疫印迹法(WB)对iNOS蛋白表达进行分析，结果如图7(a)所示，与空白对照组相比，iNOS蛋白在LPS诱导的巨噬细胞中表达量明显增高，是空白组表达量的113.76倍。但当用浓度为50～400μg/mL的D半乳糖-4-硫酸酯预处理后，iNOS的表达随浓度的增加而降低，抑制过程表现出浓度依赖性趋势。当F3浓度为400μg/mL时，与LPS处理组相比，iNOS蛋白的表达量降低到29.17％，抑制率与NO生成率相似。因此，D半乳糖-4-硫酸酯抑制NO的产生与其下调iNOS蛋白的表达相关。

此外，过量的COX-2表达可导致多种慢性疾病，而抑制COX-2的过表达可成为预防甚至治疗炎症和肿瘤的有效手段。实验中对LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞中COX-2的表达进行了分析，结果也如图7(b)所示。由WB条带可知，空白对照组的细胞中COX-2的表达量很少，但经LPS诱导后，其表达量明显升高，是空白组表达量的10.65倍。当用F3预处理后，COX-2的表达量以剂量依赖性方式显著降低。在最高试验浓度为400μg/mL时，与空白对照组相比COX-2的表达量为6.27，与LPS处理组相比分别降低了41.51％。因此，D半乳糖-4-硫酸酯可通过抑制iNOS和COX-2的表达，最终实现其抗炎作用。

通过以上制备例和测试例可得，本发明相比现有的一步酸解和酶解法，具备显著的效率优势，更重要的是能够将多糖完全降解为单糖，从而利于提纯。

而制备得到的为D半乳糖-4-硫酸酯在400μg/mL的高浓度下也未表现出细胞毒性，且此用量下的抗炎活性远好于背景技术中提及的岩藻聚糖硫酸酯等同类海洋藻类多糖，因此作为安全、高效的天然抗炎活性物质非常适合应用于药物、护肤品和保健品中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，紫菜琼胶提取物依次经过稀酸降解、酶降解和稀酸降解，分离纯化后得到半乳糖硫酸酯化合物；包括以下几个步骤：

S1，以紫菜为原料，经乙醇除杂，制备提取紫菜琼胶提取物；

S2，向1~5%的紫菜琼胶提取物溶液中加入稀酸至终浓度为0.01~0.1%，60~70℃降解1~3h；

S3，用碱溶液调节pH值至6.0~8.0，加入半乳聚糖糖链降解酶，30~40℃下搅拌或震荡反应3~5h；

S4，向S3制备的溶液中加入稀酸至终浓度0.01%~0.1%，30~40℃温和反应1~3h；

S5, 将S4产物使用阴离子交换色谱柱层析进行单糖分离纯化，收集第三个色谱峰的组分，除盐，减压浓缩，冷冻干燥，得半乳糖硫酸酯化合物；

所述稀酸为稀盐酸；

所述半乳聚糖糖链降解酶为β琼胶酶。

2.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，所述紫菜为条斑紫菜。

3.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，所述半乳聚糖糖链降解酶所用浓度范围为500~1000U。

4.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，所述碱溶液为氢氧化钠或氢氧化钾溶液。

5.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，所述S1紫菜琼胶提取物的制备步骤具体为：

S11，将紫菜粉碎过筛，用95%乙醇在40℃搅拌2h脱脂除杂；

S12，脱脂后的紫菜粉末加入纯水，于高压灭菌锅中120℃加热提取2 h，冷却至室温，浓缩过滤；

S13，向浓缩液中加入数倍体积的95%乙醇，并于4℃下醇沉，离心后将沉淀物复溶于水，冻干，得紫菜琼胶提取物。

6.如权利要求1所述的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物的制备方法，其特征在于，所述S5单糖分离纯化工艺为：

S51，在采用阴离子交换色谱柱对单糖进行分离；

S52，收集第三个色谱峰组分，除盐；

S53，收集含糖各管合并后减压浓缩，冷冻干燥得到纯品。

7.由权利要求1-6任一所述方法制备的一种具有抗炎活性的半乳糖硫酸酯化合物在制备抗炎药物中的应用。

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