CN115414380A - 坛紫菜低聚糖的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物化学技术领域，具体公开了一种坛紫菜低聚糖的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。制备方法包括如下步骤：将坛紫菜粉碎后进行水提取，过滤，向滤液中添加乙醇并静置，再次过滤，向沉淀中加水，冻干得到坛紫菜粗多糖；经过纯化，洗脱，透析，再次冻干后制得坛紫菜多糖；在坛紫菜多糖中加入酸溶液，封口沸水浴后使用碱溶液中和，加入乙醇，静置后得上清液，取离心后的上清液旋蒸获得浓缩液；对浓缩液进行透析、干燥浓缩得坛紫菜低聚糖。本发明制备的坛紫菜低聚糖是一种功能性低聚糖，能够提高细胞增殖活性，并降低作为炎症介质的一氧化氮、TNF‑α，IL‑6，IL‑1β的炎症因子水平，具有抗炎作用。
Description
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种坛紫菜低聚糖的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用。
背景技术
炎症为常见的疾病症状，在致炎过程中，由炎症细胞产生和释放的炎症介质参与并引发连锁的病理生理过程。目前，临床上针对炎症的治疗药物主要包括甾体类和非甾体类两种。然而这些药物不仅对人体健康产生一定影响，还需要较大的经济投入。鉴于对长时间使用这些药物的副作用的担忧，以功能性多糖作为抗炎药物的替代品成为了研究热点，前景广阔。
多糖发挥抗炎作用，主要依靠抑制趋化因子与粘附因子的表达，并且不断调节多种细胞因子的产生，防止白细胞向炎症区域的募集、粘附以及渗出。有文献报道，含有3-葡聚糖结构的多糖具有调节机体免疫功能的作用；有学者提出，化学结构具有1，3-连接的的β-D-葡聚糖能够与小肠上皮细胞表面的特异性受体相结合，从而激活小肠上皮细胞并且产生炎症因子。
坛紫菜俗称紫菜、乌菜，属红藻纲，红毛菜科，主要在我国浙江、福建等南部沿海地区种植。坛紫菜多糖是坛紫菜中的活性成分之一，是一种多组分的水溶性多糖，属于半乳聚硫酸酯，由1，3-β-D-半乳糖和1，4-α-L-3，6-内醚半乳糖交替连接的二糖重复单位组成。
对多糖进行化学修饰和将其水解为分子量较小的组分都可使多糖的生物活性得到提高，但化学修饰可能会带来安全性问题。其中酶法降解的优点是作用条件温和，缺点是不易得到水解效率高的酶。目前对坛紫菜多糖的高效酶法降解尚未见报道，但水解的方法较多。
此前研究表明，坛紫菜多糖具有抗氧化、抗肿瘤、免疫调节及调节肠道菌群等多种生物活性，而坛紫菜低聚糖(PHO)在抗炎中的应用尚未见报道。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种坛紫菜低聚糖的制备方法及其在制备抗炎药物中的应用，该制备方法可解决现有酶法技术无法酶解具有复杂多糖结构的原料的问题，所制备的坛紫菜低聚糖能够提高细胞增殖，并降低作为炎症介质的一氧化氮、肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-6的炎症因子水平，具有良好的抗炎作用。
为克服上述技术问题，本发明的第一方面提供了一种坛紫菜低聚糖的应用。
具体地，一种坛紫菜低聚糖在制备抗炎药物中的应用。
作为上述方案的进一步改进，所述抗炎包括抗小肠上皮细胞炎症。
作为上述方案的进一步改进，所述抗小肠上皮细胞炎症包括提高小肠上皮细胞的增殖活性、降低所述小肠上皮细胞中一氧化氮(NO)的释放量和降低损伤所述小肠上皮细胞中炎症因子水平。
作为上述方案的进一步改进，所述炎症因子包括肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)。
作为上述方案的进一步改进，所述坛紫菜低聚糖主要由半乳糖和内醚半乳糖的重复单元构成。
本发明中的坛紫菜低聚糖可以从红藻门红毛菜科紫菜属坛紫菜中提取得到，该坛紫菜低聚糖具有良好的抗炎作用，尤其可抗小肠上皮细胞炎症。具体能够提高小肠上皮细胞的增殖活性，降低小肠上皮细胞中NO的释放量和降低损伤小肠上皮细胞中炎症因子水平(如TNF-α、IL-1β和IL-6)。
本发明的第二方面提供了一种坛紫菜低聚糖的制备方法。
具体地，一种坛紫菜低聚糖的制备方法，包括以下步骤：
(1)将坛紫菜粉碎后进行水提取，过滤，向滤液中添加乙醇进行静置，得静置液；
(2)将所述静置液进行过滤，向沉淀中加水，冻干，得到坛紫菜粗多糖；
(3)将所述坛紫菜粗多糖进行纯化，洗脱，透析和冻干，得坛紫菜多糖；
(4)在所述坛紫菜多糖中加入酸溶液，封口后进行沸水浴，然后加碱溶液调节溶液的pH值，得中和溶液；
(5)在所述中和溶液中加入乙醇，进行冷藏静置；
(6)取冷藏静置后的上清液离心，取离心后的上清液进行旋蒸，得浓缩液；
(7)对所述浓缩液进行透析、干燥浓缩，得所述坛紫菜低聚糖。
本发明的坛紫菜低聚糖在制备时，先将坛紫菜粉碎后进行水提取，过滤，向滤液中添加乙醇并静置，再次过滤，向沉淀中加水，冻干得到坛紫菜粗多糖，经过纯化，洗脱，透析，再次冻干后制得坛紫菜多糖；取干燥的坛紫菜多糖，加入酸(如HCl)，封口沸水浴后使用碱(如NaOH)中和，加入乙醇，静置后得上清液，离心后弃沉淀，将离心后的上清液旋蒸获得浓缩液，经干燥浓缩(可采用真空冷冻干燥机)，获得坛紫菜低聚糖。该制备方法操作简单，且经济环保，所制得的坛紫菜低聚糖主要由半乳糖和内醚半乳糖的重复单元构成。
作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述坛紫菜与所述水的质量比为1：(1-5)；优选的，所述坛紫菜与所述水的质量比为1：(3-5)。
作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述水提取的条件为：温度80-100℃，搅拌浸提2-4小时；优选的，所述水提取的条件为：温度85-95℃，搅拌浸提2-3小时。
作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述滤液与所述乙醇的体积比为1：(1-5)，所述乙醇为95％乙醇；优选的，所述滤液与所述乙醇的体积比为1：(2-4)。
作为上述方案的进一步改进，步骤(1)中，所述静置的温度为0-10℃，所述静置的时间为12-24小时。
作为上述方案的进一步改进，步骤(3)中，所述纯化所采用的原料为DEAE离子交换树脂。
作为上述方案的进一步改进，步骤(4)中，所述酸溶液为盐酸，所述坛紫菜多糖与所述盐酸(浓度为1M)的质量体积比为1：(45-55)g/mL。
作为上述方案的进一步改进，步骤(4)中，所述沸水浴的时间为2-3小时。
作为上述方案的进一步改进，步骤(4)中，所述碱溶液为氢氧化钠，所述中和溶液的pH值为6-8。
作为上述方案的进一步改进，步骤(5)中，所述乙醇和所述中和溶液的体积比为1：(2-4)。
作为上述方案的进一步改进，步骤(6)中，所述旋蒸后的原液和所述浓缩液的体积比为(6-10)：1。
作为上述方案的进一步改进，步骤(6)中，所述旋蒸的温度为55-60℃。
作为上述方案的进一步改进，步骤(7)中，所述透析所采用的材料为200-500Da截留分子量的透析膜。
本发明的上述技术方案相对于现有技术，至少具有如下技术效果或优点：
本发明制备的坛紫菜低聚糖是一种功能性低聚糖，能够提高小肠上皮细胞增殖活性，抑制炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，具有抗炎作用。同时，还可显著提高小肠上皮细胞IEC-6的一氧化氮释放能力，表现免疫活性增强。可为坛紫菜低聚糖在肠道屏障损伤的保护和修复提供理论依据。
附图说明
图1为坛紫菜低聚糖傅里叶红外光谱图；
图2为CCK-8法测定坛紫菜低聚糖对IEC-6细胞增殖活性的影响图；
图3为坛紫菜低聚糖作为给药组、LPS作为造模组和正常IEC-6细胞作为对照组的NO含量图；
图4为坛紫菜低聚糖作为给药组、LPS作为造模组和正常IEC-6细胞作为对照组的TNF-α、IL-1β和IL-6的炎症因子水平图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行具体描述，以便于所属技术领域的人员对本发明的理解。有必要在此特别指出的是，实施例只是用于对本发明做进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，所属领域技术熟练人员，根据上述发明内容对本发明作出的非本质性的改进和调整，应仍属于本发明的保护范围。同时下述所提及的原料未详细说明的，均为市售产品；未详细提及的工艺步骤或制备方法为均为本领域技术人员所知晓的工艺步骤或制备方法。
实施例1
实施例1为坛紫菜低聚糖的制备，包括以下步骤：
(1)将坛紫菜干燥后，粉碎，加入4倍于坛紫菜质量的蒸馏水中，在90℃条件下，搅拌浸提2小时，过滤分离滤液；然后向滤液中加入3倍于滤液体积的95％乙醇，静置于4℃冰箱中20小时，得静置液；
(2)将步骤(1)制得的静置液进行过滤，以蒸馏水溶解沉淀并冻干后，得坛紫菜粗多糖；
(3)将步骤(2)制得的坛紫菜粗多糖采用DEAE离子交换树脂进行纯化，收集组分液体，洗脱，透析，冻干，得坛紫菜多糖(PHP)；
(4)将步骤(3)制得的坛紫菜多糖干燥，加入50倍坛紫菜多糖干燥体积的1M HCl，封口后沸水浴3小时；然后加入1M NaOH中和，得pH值为7的中和溶液；
(5)在步骤(4)制得的中和溶液中加入4倍于中和溶液体积的95％乙醇，放置于4℃冰箱中静置过夜；
(6)取经步骤(5)静置后溶液的上清液，以4000rpm/min离心5分钟后，将离心后的上清液置于1L旋蒸瓶中，55℃下进行旋蒸，得浓缩液；
(7)对步骤(6)制得的浓缩液采用真空冷冻干燥机进行透析、干燥浓缩48小时，得本实施例的坛紫菜低聚糖。
实施例2
实施例2为实施例1制得的坛紫菜低聚糖的结构分析。
取干燥坛紫菜低聚糖粉末与少量干燥溴化钾粉末混匀，在玛瑙研钵中进行充分的研磨并压制成薄片。利用傅里叶红外光谱仪在扫描范围400-4000cm-1内进行吸收光谱扫描，分析样品中不同官能团的吸收波带。
图1为实施例1制得的坛紫菜低聚糖的傅里叶红外光谱图，图1中横坐标Wavenumbers表示波峰数量，纵坐标Transmittance表示透过率。由图1可知，基于傅里叶红外光谱图分析得：3365cm-1处出现强吸收峰，为低聚糖分子中羟基-OH的伸缩吸收峰。2923cm-1处出现的峰为烷基C-H的伸缩振动峰。以上两组峰是判断该类化合物为糖类化合物的其中一个理论支撑。1411cm-1处的弱吸收峰为烷基C-H的振动吸收峰。1252cm-1处出现的为硫酸酯键S＝O伸缩振动引起的吸收峰。1070cm-1处为吡喃糖环的醚键C-O-C的吸收峰，说明其中有3，6-内醚半乳糖。在768cm-1附近的弱吸收峰可能是吡喃糖环的对称伸缩振动所引起。结果表明：坛紫菜低聚糖的结构主要是由半乳糖和內醚半乳糖重复单元构成。
实施例3
实施例3为CCK-8法测定坛紫菜低聚糖对大鼠小肠上皮细胞(IEC-6细胞)增殖活性的影响。
使用实施例1制得的坛紫菜低聚糖，对IEC-6细胞的增殖活性影响进行测定，取对数生长期大鼠小肠上皮细胞IEC-6，消化后获得细胞悬液，以2×104个/mL、100μL/孔接种于96孔板中，共接种7组，每组设置4个复孔。7组中，其中一组为空白对照组，其余6组均为实验组。培养24小时后，空白对照组每孔更换100μL无血清培养液，其他6组每孔均添加5ng/mLLPS无血清培养液各100μL，进行损伤造模。培养24小时后，空白对照组每孔更换100μL无血清培养液，实验组弃去LPS无血清培养液，加入不同浓度的PHO溶液，各降解多糖的最终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL，进行损伤修复。培养24小时后，每孔加入10μL的CCK-8溶液(5mg/mL)，轻轻混匀后，在37℃、5％CO2细胞培养箱中继续孵育2小时，在酶标免疫检测仪450nm处测定OD值。
图2为CCK-8法测坛紫菜低聚糖作用细胞对其增殖活性的影响图，图2中横坐标Concentration of PHO表示坛紫菜低聚糖的浓度，纵坐标Cell viability表示细胞活性。由图2可知，当坛紫菜低聚糖浓度为300μg/mL时，IEC-6细胞的增殖活性最强。另外，与空白对照组相比，当坛紫菜低聚糖浓度高于400μg/mL时对IEC-6细胞的增殖活性具有抑制作用。
相对于高分子量的坛紫菜多糖，本发明的坛紫菜低聚糖，由于进行了酸解，经纯化分离获得，其分子量更小，生物活性发挥更充分。经研究发现，在24小时内，高浓度的坛紫菜多糖对损伤细胞的增殖活性影响明显低于坛紫菜低聚糖，过高浓度(400ug/ml)的坛紫菜多糖甚至对细胞增殖活性有抑制作用，不利于抗炎应用。
实施例4
实施例4为检测坛紫菜低聚糖对IEC-6细胞的释放NO能力的影响。
对实施例1得到的坛紫菜低聚糖对IEC-6细胞释放NO能力的影响进行测定，取处于对数生长期的大鼠小肠上皮细胞IEC-6，消化后获得细胞悬液，以2×104个/mL、1mL/孔接种于24孔板中，共接种5组，每组设置3个复孔；5组中，其中一组为空白对照组，另外一组为LPS对照组(最终浓度为5ng/mL)，其余三组为PHO实验组。培养24小时后，空白对照组每孔更换1mL无血清培养液，细菌脂多糖(LPS)对照组和坛紫菜低聚糖实验组每孔均添加5ng/mL LPS无血清培养液各1mL，进行损伤造模。培养24小时后，5组每孔均更换1mL无血清培养液，PHO实验组加入不同浓度的PHO溶液，各PHO的最终浓度分别为300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL，进行损伤修复。在37℃、5％CO2下分别继续培养24小时后，根据一氧化氮试剂盒说明书操作，测定细胞内一氧化氮浓度。随后代入浓度标准曲线，计算各组一氧化氮浓度。
图3为坛紫菜低聚糖作为给药组、LPS作为造模组和正常IEC-6细胞作为对照组的NO含量图，由图3可知，加入PHO后损伤的IEC-6细胞NO释放量均降低；中浓度(400μg/mL)的PHO修复作用最为显著，NO释放量明显减少。
实施例5
实施例5为检测坛紫菜低聚糖对LPS诱导的IEC-6细胞炎症因子分泌的影响。
对实施例1得到的坛紫菜低聚糖对LPS诱导的IEC6细胞分泌炎症因子的影响进行测定，其中一组为空白对照组，另外一组为LPS对照组(最终浓度为5ng/mL)，其余组为PHO实验组。培养24小时后，空白对照组每孔更换1mL无血清培养液，LPS对照组和PHO实验组每孔均添加5ng/mL LPS无血清培养液各1mL，进行损伤造模。培养24h后，5组每孔均更换1mL无血清培养液，PHO实验组加入PHO溶液(PHO最终浓度为300mg/mL)，进行损伤修复。继续培养24小时，收集培养细胞的上清液。使用ELISA试剂盒分别测量炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。准备所有的试剂和梯度稀释的标准品。板条加入300μL 1×洗液静置浸泡30秒。标准品孔加入100μL的2倍倍比稀释的标准品，空白孔加入100μL标准品稀释液，样本孔加入80μL的1×检测缓冲液和20μL样本。每孔加入50μL的1：100稀释的检测抗体，封膜，室温孵育2小时，洗涤6次。每孔加入100μL的1：100稀释的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，封膜，室温孵育45分钟，洗涤6次，然后每孔加入100μL显色底物，避光室温孵育5-30分钟，加入100μL终止液。使用酶标仪检测，在450nm波长检测OD值，以570nm作为参考波长。
图4为坛紫菜低聚糖作为给药组、LPS作为造模组和正常IEC-6细胞作为对照组的TNF-α、IL-1β和IL-6的炎症因子水平图，图4中纵坐标relative protein expression表示相对蛋白表达。由图4可知，PHO实验组中LPS诱导的IEC-6损伤细胞在坛紫菜低聚糖溶液的修复作用下，其分泌的TNF-α，IL-6，IL-1β炎症因子水平与LPS对照组的相比均显著减少，甚至和空白对照组的炎症因子水平持平，可见PHO能有效降低损伤IEC-6细胞中炎症因子水平。
现有技术中(如CN107149609A)，坛紫菜多糖作用与损伤细胞需第三天IL-6和TNF-α方呈上升趋势，第七天炎症因子IL-6和TNF-α水平才显著降低，对炎症病理损伤响应速度慢，不利于抗炎应用。而本发明的坛紫菜低聚糖对损伤细胞进行仅24小修复后，其分泌的TNF-α，IL-6，IL-1β炎症因子水平相对于LPS对照组均显著减少，这主要是由于低聚糖的低分子量和高生物活性的作用，使其可以达到快速修复炎症损伤的效果。
对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下还可以做出若干简单推演或替换，而不必经过创造性的劳动。因此，本领域技术人员根据本发明的揭示，对本发明做出的简单改进都应该在本发明的保护范围之内。上述实施例为本发明的优选实施例，凡与本发明类似的工艺及所作的等效变化，均应属于本发明的保护范畴。
Claims (10)
1.一种坛紫菜低聚糖在制备抗炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗炎包括抗小肠上皮细胞炎症。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗小肠上皮细胞炎症包括提高小肠上皮细胞的增殖活性、降低小肠上皮细胞中一氧化氮的释放量和降低损伤小肠上皮细胞中炎症因子水平。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括肿瘤坏死因子-α、白介素-1β和白介素-6。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述坛紫菜低聚糖主要由半乳糖和内醚半乳糖的重复单元构成。
6.权利要求1至5任意一项所述的坛紫菜低聚糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将坛紫菜粉碎后进行水提取，过滤，向滤液中添加乙醇进行静置，得静置液；
(2)将所述静置液进行过滤，向沉淀中加水，冻干，得到坛紫菜粗多糖；
(3)将所述坛紫菜粗多糖进行纯化，洗脱，透析和冻干，得坛紫菜多糖；
(4)在所述坛紫菜多糖中加入酸溶液，封口后进行沸水浴，然后加碱溶液调节溶液的pH值，得中和溶液；
(5)在所述中和溶液中加入乙醇，进行冷藏静置；
(6)取冷藏静置后的上清液离心，取离心后的上清液进行旋蒸，得浓缩液；
(7)对所述浓缩液进行透析、干燥浓缩，得所述坛紫菜低聚糖。
7.根据权利要求6所述的坛紫菜低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述坛紫菜与所述水的质量比为1：(1-5)；所述水提取的条件为：温度80-100℃，搅拌浸提2-4小时；所述滤液与所述乙醇的体积比为1：(1-5)；所述静置的温度为0-10℃，所述静置的时间为12-24小时。
8.根据权利要求6所述的坛紫菜低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述纯化所采用的原料为DEAE离子交换树脂。
9.根据权利要求6所述的坛紫菜低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述酸溶液为盐酸，所述坛紫菜多糖与所述盐酸的质量体积比为1：(45-55)g/mL；所述沸水浴的时间为2-3小时；所述碱溶液为氢氧化钠，所述中和溶液的pH值为6-8。
10.根据权利要求6所述的坛紫菜低聚糖的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述乙醇和所述中和溶液的体积比为1：(2-4)；步骤(6)中，所述旋蒸后的原液和所述浓缩液的体积比为(6-10)：1，所述旋蒸的温度为55-60℃；步骤(7)中，所述透析所采用的材料为200-500Da截留分子量的透析膜。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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