KR101743421B1 - ３，６―안하이드로―ｌ―갈락토오스의 항충치 용도 - Google Patents

３，６―안하이드로―ｌ―갈락토오스의 항충치 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 항충치 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 구강 세균의 성장을 저해하고, 구강 세균의 탄소원 소비에 의한 산의 생성을 저해하는 항충치 활성을 가지고 있어 구강 세균에 의한 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 등의 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약, 식품, 구강 위생제 등에 사용할 수 있다.

Description

３，６―안하이드로―Ｌ―갈락토오스의 항충치 용도{Anticariogenic use of 3,6-anhydro-L-galactose}
본 발명은 구강 세균의 성장을 억제하고, 산 생성을 억제하는 활성을 나타내는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 항충치 용도에 관한 것이다.
치아우식증은 사람들이 치과를 찾는 주 원인 중의 하나인 구강 질환으로 인류가 설탕을 감미료로 사용하게 됨에 따라 발병률이 증가하게 되었다. 치아우식증의 주 원인균으로 뮤탄스균(Streptococcus mutans)을 들 수 있다(Loesche WJ et al. (1975) Infect Immun. 11(6): 1252-60). 뮤탄스균은 구강 내에서 당을 분해하고, 글루코실트랜스퍼라제(glucosyltransferase, GTF)를 분비하여 불용성 글루칸(glucan)을 치면에 형성해 뮤탄스균 또는 다른 각종세균들을 치아표면에 부착하여 증식하게 한다. 치면의 세균들이 당질 대사 산물인 젖산과 같은 유기산에 의해 치아표면의 법랑질이 탈회되면서 충치를 유발하게 되는 것이다(Dashper SG et al. (1996) Microbiol. 142, 33-29). 치아우식증을 예방하기 위한 물질로 치면세균막 내 뮤탄스균의 수를 감소시켜 치아우식증을 예방하는 불소화합물과 자일리톨(xylitol)이 대표적으로 알려져 있다(Trahan L et al. (1985) Caries Res. 19: 53-63). 자연계에 존재하는 5탄당 알코올인 자일리톨은 설탕과 비슷한 단맛과 청량감의 장점으로 인해 껌으로 제조되어 널리 사용되고 있지만 고농도의 자일리톨의 경우에서만 뮤탄스균의 성장을 억제할 수 있다는 단점이 있다.
현재 뮤탄스균에 대한 항균력이 있는 천연물질에 대한 연구와 항우식성 감미료로서 천연당에 대한 관심이 높아지고 있지만 자일리톨 만큼의 항충치 효과가 있는 천연당의 연구결과는 미약한 실정이다. 자일리톨의 경우 뮤탄스균이 자일리톨을 섭취하였을 때 포스포엔올피루브산 자일리톨 포스포트랜스퍼라제 시스템(phosphoenolpyruvate-xylitol phosphotrasferase system, PEP-xylitol PTS)의 활성에 의해 자일리톨-5-인산을 형성한다. 이는 당분해효소의 활성을 저해하고 더 이상 대사가 되지 않아 다시 자일리톨의 형태로 세포 외로 배출되어 에너지를 생성하지 못하고 소비만 하는 무익회로 과정을 통해 세균증식과 산 생성을 억제하게 된다. 이때 10 g/L 농도 이상의 자일리톨에서만 뮤탄스균의 성장을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 자일리톨을 함유한 배지에서 지속적인 배양을 하면 자일리톨에 의한 성장이 저해되지 않는 내성균주가 형성된다는 연구결과도 있다(Trahan L et al. (1985) Caries Res. 19: 53-63, Trahan L et al. (1987) J Dent Res. 66: 982-988).
따라서, 내성균주 형성없이 저 농도에서도 효과적으로 구강 세균의 성장을 억제할 수 있는 항충치제의 개발이 필요한 실정이다.
Loesche WJ et al. (1975) Infect Immun. 11(6): 1252-60 Trahan L et al. (1985) Caries Res. 19: 53-63 Dashper SG et al. (1996) Microbiol. 142, 33-29 Trahan L et al. (1987) J Dent Res. 66: 982-988
본 발명의 목적은 구강세균의 성장 억제 활성과 산 생성 저해 활성이 있는 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 유효성분으로 포함하는 항충치 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 구강 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 하기 화학식 1로 표시될 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112015100209990-pat00001
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는,
전처리된(pretreated) 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,
전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 얻은 반응 산물을 분리 정제하여 수득한 것일 수 있다.
상기 전처리는 아가로스와 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 5분 내지 6시간 동안 반응시키는 것일 수 있다.
상기의 효소 반응은 20 내지 40 ℃의 온도 범위에서 30분 내지 7일간 실시하는 것일 수 있다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 구강세균의 성장을 저해하고, 구강 세균의 탄소원 소비에 의한 산의 생성을 저해할 수 있다.
상기 구강 질환은 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 구강 세균의 성장을 저해하고, 구강세균의 탄소원 소비에 의한 산의 생성을 저해하여 항충치 활성을 가지고 있다.
따라서, 구강세균에 의한 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 등의 구강 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 의약, 식품, 구강 위생제 등에 사용할 수 있다.
도 1은 탄소원으로 10g/L의 글루코오스, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 자일리톨이 첨가된 액체 최소배지에서 고체 최소배지에서 뮤탄스균 성장에 대한 단일 탄소원의 효과를 나타낸 것이다(기질조건: 10g/L의 글루코오스; 10g/L의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스; 10g/L의 자일리톨. 희석 배수: 10배, 100배, 1,000배, 10,000배, 100,000배).
도 2는 탄소원으로 10g/L의 글루코오스, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 및 자일리톨이 첨가된 액체 최소배지에서 뮤탄스균 성장에 대한 단일 탄소원의 효과를 나타낸 것이다.
도 3은 탄소원으로 10g/L의 글루코오스를 함유하는 최소배지에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(A)와 자일리톨(B)의 농도별 뮤탄스균 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 4는 탄소원으로 10g/L의 글루코오스를 함유하는 최소배지에 자일리톨을 20g/L(A) 및 40g/L(B)을 첨가하여 뮤탄스의 성장, 잔존하는 탄소원의 농도, 및 산(젖산, 포름산, 아세트산) 생성량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 탄소원으로 10g/L의 글루코오스를 함유하는 최소배지에 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 0g/L(A), 5g/L(B), 10g/L(C)를 첨가하여 뮤탄스균의 성장, 잔존하는 탄소원의 농도, 산 (젖산, 포름산, 아세트산) 생성량 분석 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 아가로스를 전처리하고, 세가지 효소를 이용한 효소적 가수분해를 통해 단당체인 갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산한 다음 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만 분리 정제하여 뮤탄스균에 대한 탄소원으로 사용하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에 대한 뮤탄스균의 성장과 산 생성 저해를 관찰하여 항충치 효과를 분석하였고, 대조군으로 글루코오스와 자일리톨을 탄소원으로 사용하여 비교 실험하였다.
그 결과, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 자일리톨 조건에서는 글루코오스 조건에 비해 콜로니 형성이 저해되고, 탄소원의 희석배율이 높은 경우 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 조건에서 콜로니가 형성되지 않았다. 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 뮤탄스균의 성장 촉진에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 자일리톨처럼 뮤탄스균에 대해 비발효성 당이고, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 자일리톨보다 훨씬 높은 성장 저해 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 글루코오스의 혼합 탄소원 조건에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 저농도에서는 뮤탄스균의 성장을 저해하나 고농도에서는 세포 성장이 일어나지 않았다. 자일리톨은 농도가 증가할수록 뮤탄스균의 성장을 저해하지만 고 농도에서도 상당한 세포 성장이 관찰되었다. 또한, 혼합 탄소원 조건에서, 저농도(5g/L)의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 뮤탄스균의 지연기가 길어지고, 성장속도가 감소되며, 생성된 산의 농도가 감소되어 뮤탄스균의 세포 성장과 산 생성 저해 효과가 약하게 있음을 확인할 수 있고, 고 농도(10g/L)의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 뮤탄스균의 성장과 산 생성이 전혀 관찰되지 않았고, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 농도 변화가 없어 뮤탄스균은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 탄소원으로 사용할 수 없음을 알 수 있었다. 반면, 충치를 예방하는 당으로 알려진 자일리톨은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스보다 훨씬 높은 농도인 40g/L의 조건에서도 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 10g/L의 조건의 결과처럼 뮤탄스균의 성장과 산 생성을 완전히 저해 하지는 못했다. 이는 자일리톨보다 낮은 농도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에서도 뮤탄스균에 대한 성장과 산 생성 저해 효과가 훨씬 크다는 것을 의미한다.
따라서, 본 발명은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물의 제조를 위한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 용도를 제공한다.
상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 홍조류 바이오매스를 구성하는 대표적인 탄수화물 성분인 한천의 구성 단당으로,
화학적 합성을 통해 얻거나;
전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시켜 얻거나;
전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 얻은 반응 산물을 분리 정제하여 수득한 것을 사용할 수 있다.
상기 아가로스의 전처리는 아가로스와 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 5분 내지 6시간 동안 반응시키는 것일 수 있다. 상기 범위 내일 경우 약산에 의한 아가로스의 과분해산물 및 잔존한 아세트산을 최소화할 수 있다.
상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 또는 옥살산(Oxalic acid) 등을 단독 또는 2종 이상 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 약산은 생산단가 및 약산 중화 후 생성되는 염의 분리를 고려하여 0.5 내지 60%(w/v)의 농도로 사용하는 것이 좋다. 보다 구체적으로 20 내지 40% (w/v)의 농도로 사용할 수 있다.
상기에서 전처리 후 생성된 아가로올리고당을 이당체를 생산하는 엑소-타입(exo-type)의 아가로스 분해효소와 반응시켜 아가로트리오스와 네오아가로바이오스를 생산한다.
상기 아가로트리오스에 대해 비환원말단의 β-1,4 결합의 분해효소인 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)를 처리하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 네오아가로바이오스를 생산하고, 마지막으로 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 사용하여 네오아가로바이오스를 단당체인 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해한다.
상기 효소 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다.
상기 효소 반응을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
우선, 아가로올리고당을 분해하여 이당체인 네오아가로바이오스를 생산하는 아가로스 분해효소는 아가로스의 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 사이의 베타-1,4-글리코사이드 결합을 절단하는 효소(Aga50D'라고도 함)를 사용할 수 있다.
상기 아가로스 분해효소는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로올리고당 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 아가로스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagusdegradans) 2-40T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 아가로스 분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)2-40T의 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다.
재조합 기술을 이용하는 경우, 통상적인 재조합 단백질 발현의 용이함을 위하여 사용되는 인자들, 예컨대 항생제 저항성 유전자, 친화성 컬럼 크로마토그래피에 사용될 수 있는 리포터 단백질 또는 펩타이드를 사용할 수 있으며, 이러한 기술은 본원발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 용이하게 실시 가능한 범주에 해당된다. 예컨대 상기 아가로스 분해효소는 식용균주, 예컨대 효모에 형질전환시켜 형질전환된 효모의 배양물 상등액을 대체하여 이용할 수 있다. 보다 구체적인 제조 기술은 대한민국 공개특허 제2010-0040438호(2010.04.20)를 참조할 수 있다.
상기 아가로올리고당 및 아가로스 분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로, 25 내지 35℃의 온도 범위에서 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
다음으로, 아가로올리고당 가수분해 산물인 아가로트리오스를 네오아가로바이오스와 D-갈락토오스로 가수분해하는 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)('VejABG'라고도 함)는 종래기술에서는 가수분해되지 않고 잔존하는 아가로트리오스를 효과적으로 분해하여 아가로스로부터 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산 효율을 현저히 개선할 수 있다.
상기 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 GH family 2에 속하는 효소로, 다른 GH family 2에 속하는 베타-갈락토시다제들과의 활성을 비교할 경우, 종래의 보고된 베타-갈락토시다제는 아가로트리오스를 분해하여 D-갈락토오스 및 네오아가로바이오스를 생산하는 활성을 나타내지 않으나, 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 유래의 상기 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 아가로트리오스 분해 활성을 나타낼 수 있다. 또한, 다양한 아가로올리고당(n), 예컨대, 아가로펜타오스, 아가로헵타오스의 비환원성말단에 작용하여 아가로올리고당을 D-갈락토오스와 네오아가로바이오스(n-1)로 가수분해할 수 있다.
상기 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 효소의 코딩 영역 전 및 후의 영역뿐만 아니라 개별 코딩 분절 사이의 개재 서열이 포함된 폴리펩티드를 생산하는데 연관된 DNA 분절, 즉 코딩 유전자를 통해 전사 및 번역될 수 있다. 예컨대, SEQ ID NO:2에 기재된 서열로부터 전사 및 번역될 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 아가로트리오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO:2에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 배양물의 상등액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 비브리오 속(Vibrio sp.) EJY3 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다. 재조합 기술을 이용하는 경우, 대장균에 형질전환시켜 형질전환된 대장균의 배양물 상등액 또는 상청액을 대체하여 이용할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다. 보다 구체적인 제조 기술은 대한민국 공개특허 제2015-0043040호(2015.04.22)를 참조할 수 있다.
상기 아가로트리오스 및 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 30분 내지 7일간 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
상기 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 아가로트리오스에 대해 약 30 내지 40℃에서, 약 pH 5 내지 9.6에서 최적 활성을 나타낼 수 있다.
마지막으로, 상기 네오아가로바이오스를 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 D-갈락토오스로 분해할 수 있는 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소('sdNABH'라고도 함)는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열 뿐만 아니라 상기 효소의 하나 이상의 치환, 결손, 전위, 첨가 등의 변이 단백질로서 상기 네오아가로바이오스 가수분해 활성을 가지는 단백질도 본 발명의 효소의 권리범위에 포함되며, 바람직하게는 SEQ ID NO: 4에 개시된 아미노산 서열과 서열 동일성이 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 및 99% 이상인 아미노산 서열을 포함한다.
상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagusdegradans)2-40T에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
상기 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans)의 배양물의 상등액 또는 상청액으로부터 분리 및 정제할 수 있으며, 유전공학적 재조합 기술을 이용하여 사카로파거스 데그라단스(Saccharophagus degradans) 이외 균주 또는 인공적인 화학적 합성법 등에 의하여 생산 및 분리할 수 있다. 보다 구체적인 제조 기술은 대한민국 공개특허 제2013-0085017호(2013.07.26)를 참조할 수 있다.
상기 네오아가로바이오스와 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 반응은 20 내지 40℃의 온도 범위에서 30분 내지 7일 동안 실시할 수 있다. 보다 구체적으로 25 내지 35℃의 온도 범위에서 1일 내지 4일 동안 실시할 수 있다.
상기 네오아가로바이오스의 분해 산물에 대해 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피 및 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 순차적으로 실시하여 대략 95%의 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 분리 정제할 수 있다.
본 명세서에서 "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 발명에서 폴리펩티드가 또 다른 서열에 대하여 특정 비율(예컨대, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99%)의 서열 동일성을 가진다는 것은, 상기 두 서열을 정렬시킬 때, 상기 서열들의 비교시 상기 비율의 아미노산 잔기가 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 상동성 또는 동일성은, 당업계에 공지된 임의의 적당한 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols in Molecular Biology(F. M. Ausubel 등 (eds) 1987 Supplement 30 Section 7.7.18)]에 기재된 것들을 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램으로는, GCG Pileup 프로그램, FASTA(Pearson 등 1988 Proc . Natl . Acad. Sci USA 85:2444-2448), 및 BLAST(BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Lib. Med.(NCIB NLM NIH), Bethesda, MD, 및 Altschul 등 1997 NAR25:3389-3402)이 있다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 ALIGN Plus(Scientific and Educational Software, PA)로서, 바람직하게는 기본 매개변수를 사용하는 것이다. 사용 가능한 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Software Package Version 6.0(Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)에서 이용 가능한 TFASTA Data Searching Program 이다.
본 발명에서 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터와 관련하여 사용될 때 용어 "재조합"은, 상기 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입 또는 본래적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 변형되었거나, 또는 상기 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래한 것을 가리킨다. 즉, 예를 들어, 재조합 세포는 상기 세포의 본래적(비(非)재조합) 형태 내에서는 발견되지 않는 유전자를 발현하거나 또는, 다르게는 발현 시 비정상적으로 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 본래적 유전자를 발현한다.
본 명세서에서 "핵산"은 단일가닥 또는 이중가닥의 DNA, RNA, 및 이들의 화학적 변형체를 포괄한다. "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 유전 암호가 축퇴되어 있기 때문에, 특정 아미노산을 인코딩하기 위해서 하나 이상의 코돈을 사용할 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포괄한다.
핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 용어 "도입"은 "트랜스펙션(transfection)", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입(transduction)"을 의미하며, 핵산 서열의 진핵 또는 원핵 세포 내로의 통합에 대한 언급이 포함되고, 이때 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예컨대, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 통합되어, 자율 레플리콘으로 전환되거나, 또는 일시적으로 발현된다.
상기의 효소 반응 후 생산된 산물 중에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만을 분리 정제하기 위해 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피와 젤 투과 크로마토그래피인 바이오 젤 P2크로마토그래피를 사용하고, GC/MS 분석을 통해 정량할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다.
상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 의약 분야에서 통상 사용되는 담체 및 비히클을 포함하며, 구체적으로 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질(예, 사람 혈청 알부민), 완충 물질(예, 각종 인산염, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 포화 식물성 지방산의 부분적인 글리세라이드 혼합물), 물, 염 또는 전해질(예, 프로타민 설페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소캄륨, 염화나트륨 및 아연 염), 교질성 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 또는 양모지 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
한 양태로서, 본 발명에 따른 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여를 위한 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있다.
상기 경구 투여용 제제의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴(Amylopectin), 셀룰로오스(Cellulose) 또는 젤라틴(Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트(Dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘(Magnesium stearate), 스테아르산 칼슘(Calcium stearate), 스테아릴 푸마르산 나트륨(Sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스(Polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 사용할 수 있으며, 감미제, 방향제, 시럽제 등도 사용할 수 있다.
나아가 캡슐제의 경우에는 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 사용할 수 있다.
상기 비경구용 제제의 비제한적인 예로는, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 구강용 스프레이제, 구강용 세정제, 치약제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물을 비경구 투여용으로 제제화하기 위하여, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 외용제 등을 사용할 수 있으며, 상기 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또한, 보다 구체적으로 본 발명의 상기 약학 조성물을 주사액으로 제제화하는 경우, 본 발명의 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알(vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 또한, 본 발명의 상기 약학적 조성물을 에어로졸제로 제제화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 약학 조성물을 연고, 크림 등으로 제제화하는 경우에는, 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화 아연 등을 담체로 사용하여 제제화할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 상기 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 상기 약학 조성물의 투여로 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 투여 대상이 되는 개체의 종류, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 질병의 증세나 정도, 성별, 식이, 배설, 해당 개체에 동시 또는 다른 시기에 함께 사용되는 약물 기타 조성물의 성분 등을 비롯한 여러 인자 및 의약 분야에서 잘 알려진 유사 인자에 따라 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 상기 약학 조성물의 투여는 하루에 1 회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여 방식은 각각 독립적일 수 있으며, 그 방식에 있어 특별히 제한되지 아니하며, 목적하는 해당 부위에 상기 약학 조성물이 도달할 수 있는 한 임의의 투여 경로 및 투여 방식에 따를 수 있다. 상기 약학 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다.
상기 비경구 투여하는 방법으로는, 예를 들어 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 경피 투여 또는 피하 투여 등을 이용할 수 있으며, 상기 조성물을 질환 부위에 도포하거나 분무, 흡입하는 방법 또한 이용할 수 있으나 이들에 제한되지 아니한다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 바람직하게는 경구 투여되거나 주사 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명의 상기 약학 조성물을 개체에 투여하여 구강 질환의 발병을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 약학 조성물을 개체에 투여하여 구강 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 구강 질환은 구강에 발생하는 질환이라면 그 병증에 관계없이 모두 포함하는 개념이며, 예컨대, 스트렙토코커스 뮤탄스(Steptococcusmutans), 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonasgingivalis), 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia), 액티노바실러스 액티노마이세템코미탄스(Actinobacillus actinomycetemcomitans), 칸디다 알비칸스(Candidaalbicans) 등과 같은 병원성 미생물을 포함하는, 칸디다속(Candida spp.)의 구강 병원균으로부터 주로 야기되는 구강 질환, 또는 구강 면역 저하에 의한 구강 질환을 의미할 수 있다. 상기 구강 질환의 비제한적인 예로는 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강 내 점막 궤양, 구취, 구강건조증 등을 들 수 있다.
본 발명은 또한 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하여 구강 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유 동물을 비롯한 모든 동물을 의미한다.
본 발명의 상기 구강 질환의 예방 또는 치료 방법에서, 상기 약학 조성물의 투여량, 투여 경로, 투여 방식 등에 관한 설명은, 본 발명의 상기 약학 조성물과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 구강 질환 및 예방에 관한 설명은, 본 발명의 상기 약학 조성물과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 상기 구강 위생용 조성물은 구강의 위생을 위하여 사용할 수 있는 모든 종류 및 제형을 포함한다. 상기 구강 위생용 조성물의 비제한적인 예로는, 치약, 구강 세정제, 구강용 스프레이, 구강용 연고제, 검 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 구강 위생용 조성물은 경구 투여 또는 비경구 투여에 적합한 다양한 제형으로 제제화되어 사용될 수 있으며, 이에 관한 설명은 본 발명의 상기 약학 조성물과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명은 또한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 구강 질환, 예방, 및 개선에 관한 설명은, 본 발명의 상기 약학 조성물과 관련하여 상기에서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 특별히 제한되지 아니하며, 건강기능식품 조성물을 포함한다.
용어, "건강기능식품"이란, 상기 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미한다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물이 음료 조성물인 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비제한적인 예로 포도당, 과당과 같은 단당류; 말토스, 수크로스와 같은 이당류; 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 상기 첨가되는 추가 성분의 비율은 당업자의 선택에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 음료 또는 야채 음료 등의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 사용되거나 2 이상을 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가물의 비율 또한 당업자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아가로스의 전처리
3N의 아세트산에 7%(w/v) 농도의 아가로스가 되도록 녹여 microwave digester를 이용하여 130℃에서 10분간 반응한 후 1.5L의 94% 에탄올로 두 번 워싱하여 잔존한 아세트산 및 과분해산물을 제거하였다. 반응산물을 24시간 동안 동결 건조하여 분말상태의 아가로올리고당을 얻었다.
<실시예 2> 아가로올리고당의 효소적 가수분해에 의한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 생산
실시예 1로부터 생산한 산 가수분해물(아가로올리고당)을 단당체인 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스로 분해하기 위하여 엑소-타입(exo-type)의 베타-아가라제인 Aga50D(대한민국 공개특허 제2010-0040438호, 2010.04.20 참조)와 반응시켰으며, 반응산물로 아가로트리오스와 네오아가로바이오스를 생산하였다.
Aga50D 반응이 끝난 후에 아가로트리오스를 비환원말단의 β1-4결합의 분해효소인 VejABG(대한민국 공개특허 제2015-0043040호, 2015.04.22 참조)를 처리하여 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 네오아가로바이오스를 생산하였다.
네오아가로바이오스로부터 단당체인 D-갈락토오스와 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 생산하기 위하여 VejABG 반응 산물을 sdNABH 효소(대한민국 공개특허 제2013-0085017호, 2013.07.26 참조)와 반응시켰다.
이 세 가지 재조합 효소는 대장균(Escherichia coli) BL21(DE3)에 발현시켰고, HisTrap 컬럼으로 정제하였다. 효소 반응 조건은 200mL의 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)에 5%(w/v) 아가로올리고당을 부가하여 30℃에서 Aga50D, VejABG, SdNABH 순으로 3일간 반응시켰다. 효소 반응시 사용한 효소의 양은 총 200mL 당 Aga50D는 20mg, VejABG는 1mg, SdNABH는 2mg이었다.
<실시예 3> 실리카 젤 크로마토그래피와 바이오 젤 P2 크로마토그래피를 이용한 분리 정제
실시예 2에서 생산된 반응산물 중에서 3,6-안하이드로-L-갈락토오스만을 분리 정제하기 위하여 크로마토그래피를 실시하였다. 반응산물을 셀라이트에 흡착시켜 파우더 형태의 샘플을 만든 후에 흡착 크로마토그래피인 실리카 젤 크로마토그래피를 실시하였다. 이동상은 클로로포름: 메탄올: 물을 각각 78:20:2(v/v/v)의 비율로 혼합한 용매를 사용하였으며 전체 이동상의 용매의 볼륨은 4L였다. 한 분획의 볼륨은 20mL였으며 총 200 분획의 샘플을 TLC로 분석한 후 그 중 3,6-안하이드로-L-갈락토오스가 있는 분획을 모아 회전진공농축기로 유기용매를 제거하였다.
<실시예 4> GC/MS 분석을 통한 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 정성 및 정량
실시예 3을 통해 생산한 고순도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 GC/MS로 분석하여 정량하였다. GC/MS 분석을 위한 유도체화 과정은 다음과 같다. 정제한 샘플을 스피드 백으로 건조시킨 후에 10㎕의 4%(w/v)농도의 피리딘에 녹인 O-메틸하이드록실아민 하이드로클로라이드(O-methylhydroxylamine hydrochloride in pyridine)을 넣고 30℃에서 120분간 반응시켰다. 그리고 45㎕의 N-methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide를 넣고 37℃에서 30분간 반응을 실시하였다. GC/MS 분석을 위한 기기 조건은 다음과 같다. 분석 시 사용한 컬럼은 DB5-MS capillary column이며 GC 컬럼 온도 조건은 먼저 100℃에서 3.5분간 유지하고 160℃까지 승온시킨 후 20분간 유지하였다. 그 후 200℃까지 승온한 후 15분간 유지하고 마지막으로 280℃까지 승온한 후에 5분간 유지하였다. 1㎕의 샘플을 9.6의 split ratio로 분석하였다.
<실시예 5> 세포배양 조건
본 실험에서 사용한 균주는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) ATCC 25175이다. 뮤탄스균을 Brain-heart infusion(BHI) 배지에 12시간 동안 전 배양(pre-culture)하고, 2mM 인산칼륨 버퍼로 두 번 워싱한 뒤 이전에 보고된 문헌을 참고하여 만든 최소배지에서(Fujiwara et al (1978) Arch Oral Biol. 23, 601-602) 본 배양(main culture)을 37℃, 180rpm 조건에서 진행하였다. 최소배지의 조성은 5mL의 50mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.4)에 10mg의 L-글루탐산, 1mg의 시스테인 염산염, 4.5mg의 L-류신, 5mg의 염화암모늄, 17.5mg의 인산수소칼륨, 7.5mg의 인산이수소칼륨, 21mg의 탄산염, 6mg의 황산마그네슘7수화물, 0.1mg의 염화망간4수화물, 3mg의 피루브산나트륨, 5㎍의 리보플라빈, 2.5㎍의 티아민염산염, 0.5㎍의 비오틴, 5㎍의 니코틴산, 0.5㎍의 p-아미노벤조산, 2.5㎍의 판토텐산 칼슘, 5㎍의 피리독신염산염을 포함한다.
<실시예 6> 단일 탄소원 조건에서 뮤탄스균의 성장 저해 효과
단일 탄소원 조건에서 뮤탄스균의 성장 저해 효과를 보기 위해 10g/L의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 글루코오스, 자일리톨을 각각 함유하는 고체 최소배지와 액체 최소배지에 뮤탄스균을 배양하였다. 전 배양(pre-culture)한 뮤탄스균을 2mM의 인산칼륨 버퍼에 10배, 102배, 103배, 104배, 105배 희석하여 고체배지에 스포팅(spotting)하고 30시간 배양하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스와 자일리톨 조건에서는 글루코오스 조건에 비해 콜로니 형성이 저해되었다. 특히 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 경우에는 104배, 105배 희석한 조건에서 콜로니가 전혀 관찰되지 않았다.
또한, 10g/L의 각각의 탄소원(3,6-안하이드로-L-갈락토오스, 글루코오스, 자일리톨)을 포함하는 액체 최소배지에 뮤탄스균을 배양하여 세포 성장 저해 효과를 관찰하였다. 실시예 5의 방법으로 35시간 동안 본 배양(main-culture)하여 5시간 마다 600nm의 파장에서 배양액의 흡광도를 측정하여 세포 성장의 정도를 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 글루코오스의 조건에서는 뮤탄스균이 정지기(stationary phase)에 접어드는 20시간 경과후의 건조균체량(dry cell weight, DCW)이 4.05g/L 농도가 측정되었고, 자일리톨의 경우에는 건조균체량이 훨씬 감소하여 1.46g/L 농도가 측정되었으며, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 경우에는 뮤탄스균의 성장이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 자일리톨처럼 뮤탄스균에 대해 비발효성 당이고, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는 자일리톨보다 훨씬 높은 성장 저해 효과가 있음을 확인하였다.
<실시예 7> 혼합 탄소원 조건에서 뮤탄스균의 성장 저해 효과
실시예 5의 방법으로 10g/L의 글루코오스와 농도별 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 또는 자일리톨을 포함하는 200㎕의 액체 최소 배지에 뮤탄스균을 96-웰 플레이트에 소량으로 배양하고 시간별로 600nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 성장 저해 효과를 관찰하였다. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 농도는 0g/L에서 20g/L, 자일리톨은 0g/L에서 40g/L 사이의 농도로 각각 처리하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 1.3 및 2.5g/L 농도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에서는 뮤탄스균의 성장에 큰 변화가 없었고, 5 및 10g/L 농도에서부터 상당한 세포 성장 저해 효과를 관찰하였으며, 20g/L의 농도에서는 세포 성장이 일어나지 않았다. 자일리톨의 경우에는 자일리톨의 농도를 높게 처리할수록 뮤탄스균의 성장이 저해되었지만, 상당히 높은 농도인 40g/L의 농도에서도 상당한 세포 성장이 관찰되었다. 따라서, 자일리톨보다 낮은 농도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에서도 세포 성장 저해 효과가 더 크다는 결과를 확인하였다.
<실시예 8> 혼합 탄소원 조건에서 뮤탄스의 성장과 산 생성 저해 효과
3,6-안하이드로-L-갈락토오스 또는 자일리톨이 뮤탄스균의 성장과 산 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 5의 방법으로 10g/L의 글루코오스와 0, 5, 10g/L의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스 또는 20, 40g/L의 자일리톨을 각각 포함하는 5mL의 액체 최소 배지에 뮤탄스균을 35시간 동안 배양하고 5시간 마다 흡광도를 이용하여 세포 성장, HPLC를 이용하여 세포 외 기질 농도와 산 생성 농도를 확인하였다. 글루코오스만 첨가한 조건은 음성 대조군, 글루코오스와 자일리톨을 첨가한 조건은 양성 대조군으로 설정하였다. 분석 시 사용한 컬럼은 Aminex HPX-87H이며, 이동상으로 0.01N 황산을 65℃에서 0.5mL/min의 속도로 흘려주었다.
도 4A에 나타난 바와 같이, 탄소원으로 글루코오스만 포함하는 조건에서는 건조 균체량이 3.34g/L로 측정되었고, 비성장속도는 0.086h- 1 이었다. 글루코오스는 30시간만에 모두 소비되었으며 젖산의 농도는 5.24g/L로 측정되었다. 그 외에도 소량 생성된 포름산과 아세트산의 농도는 각각 0.82, 0.71g/L 이었다.
10g/L의 글루코오스에 5g/L의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 조건에서는 뮤탄스균의 최종 건조 균체량의 농도 감소는 없었지만 지연기(lag phase)가 길어지고, 비성장속도의 값이 0.075h-1로 감소한 점과 생성된 산의 농도가 줄어든 결과를 통해 세포 성장과 산 생성 저해 효과가 약하게 있다는 것을 확인하였다(도 4B).
10g/L의 글루코오스에 10g/L의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 포함하는 조건에서는 뮤탄스균의 성장과 산 생성이 전혀 관찰되지 않았다. 또한 두 조건 모두 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 농도변화가 없었으며, 이 사실을 통해 뮤탄스균은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스를 탄소원으로 이용할 수 없다는 점을 확인하였다(도 4C).
또한, 양성대조군으로서 10g/L의 글루코오스에 20g/L의 자일리톨을 포함하는 조건에서는 최종 건조균체량이 1.42g/L로 뮤탄스균 성장 저해가 일어났지만 비성장속도 값은 0.087h-1로 음성대조군의 0.086h- 1와 비교했을 때 변화는 없었다. 글루코오스는 총 5.28g/L가 소비되었고, 생성된 젖산과 아세트산의 농도는 각각 3.67, 0.55g/L로 음성대조군에 비해 감소되었다(도 5A). 10g/L의 글루코오스에 40g/L 고농도의 자일리톨을 포함하는 조건에서는 20g/L의 자일리톨에 비해 지연기(lag phase)가 길어진 것을 관찰할 수 있었고, 소비된 글루코오스의 농도는 5.42g/L로 비슷하게 측정이 되었다. 글루코오스의 소비로 인해 생성된 젖산과 아세트산의 농도는 각각 3.67, 0.55g/L로 측정이 되었다(도 5B).
또한, 뮤탄스균의 발효 과정 중의 자일리톨의 농도는 일정하게 유지되는 점을 통해 뮤탄스균에 대한 자일리톨의 비발효 성질을 확인하였다.
이 결과를 통해 충치를 예방하는 당으로 알려진 자일리톨은 3,6-안하이드로-L-갈락토오스보다 훨씬 높은 농도인 40g/L의 조건에서도 3,6-안하이드로-L-갈락토오스의 10g/L의 조건의 결과처럼 뮤탄스균의 성장과 산 생성을 완전히 저해하지는 못했다. 이는 자일리톨보다 낮은 농도의 3,6-안하이드로-L-갈락토오스에서도 뮤탄스균에 대한 성장과 산 생성 저해 효과가 훨씬 크다는 것을 의미한다.
<110> Korea University Industrial & Academic Collaboration Foundation <120> Anticariogenic use of 3,6-anhydro-L-galactose <130> P15U13C0777 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 747 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-agarase <400> 1 Met Leu Phe Asp Phe Glu Asn Asp Gln Val Pro Ser Asn Ile His Phe 1 5 10 15 Leu Asn Ala Arg Ala Ser Ile Glu Thr Tyr Thr Gly Ile Asn Gly Glu 20 25 30 Pro Ser Lys Gly Leu Lys Leu Ala Met Gln Ser Lys Gln His Ser Tyr 35 40 45 Thr Gly Leu Ala Ile Val Pro Glu Gln Pro Trp Asp Trp Ser Glu Phe 50 55 60 Thr Ser Ala Ser Leu Tyr Phe Asp Ile Val Ser Val Gly Asp His Ser 65 70 75 80 Thr Gln Phe Tyr Leu Asp Val Thr Asp Gln Asn Gly Ala Val Phe Thr 85 90 95 Arg Ser Ile Asp Ile Pro Val Gly Lys Met Gln Ser Tyr Tyr Ala Lys 100 105 110 Leu Ser Gly His Asp Leu Glu Val Pro Asp Ser Gly Asp Val Asn Asp 115 120 125 Leu Asn Leu Ala Ser Gly Leu Arg Ser Asn Pro Pro Thr Trp Thr Ser 130 135 140 Asp Asp Arg Gln Phe Val Trp Met Trp Gly Val Lys Asn Leu Asp Leu 145 150 155 160 Ser Gly Ile Ala Lys Ile Ser Leu Ser Val Gln Ser Ala Met His Asp 165 170 175 Lys Thr Val Ile Ile Asp Asn Ile Arg Ile Gln Pro Asn Pro Pro Gln 180 185 190 Asp Glu Asn Phe Leu Val Gly Leu Val Asp Glu Phe Gly Gln Asn Ala 195 200 205 Lys Val Asp Tyr Lys Gly Lys Ile His Ser Leu Glu Glu Leu His Ala 210 215 220 Ala Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Leu Asp Gly Lys Pro Met Pro Ser 225 230 235 240 Arg Ser Lys Phe Gly Gly Trp Leu Ala Gly Pro Lys Leu Lys Ala Thr 245 250 255 Gly Tyr Phe Arg Thr Glu Lys Ile Asn Gly Lys Trp Met Leu Val Asp 260 265 270 Pro Glu Gly Tyr Pro Tyr Phe Ala Thr Gly Leu Asp Ile Ile Arg Leu 275 280 285 Ser Asn Ser Ser Thr Met Thr Gly Tyr Asp Tyr Asp Gln Ala Thr Val 290 295 300 Ala Gln Arg Ser Ala Asp Asp Val Thr Pro Glu Asp Ser Lys Gly Leu 305 310 315 320 Met Ala Val Ser Glu Lys Ser Phe Ala Thr Arg His Leu Ala Ser Pro 325 330 335 Thr Arg Ala Ala Met Phe Asn Trp Leu Pro Asp Tyr Asp His Pro Leu 340 345 350 Ala Asn His Tyr Asn Tyr Arg Arg Ser Ala His Ser Gly Pro Leu Lys 355 360 365 Arg Gly Glu Ala Tyr Ser Phe Tyr Ser Ala Asn Leu Glu Arg Lys Tyr 370 375 380 Gly Glu Thr Tyr Pro Gly Ser Tyr Leu Asp Lys Trp Arg Glu Val Thr 385 390 395 400 Val Asp Arg Met Leu Asn Trp Gly Phe Thr Ser Leu Gly Asn Trp Thr 405 410 415 Asp Pro Ala Tyr Tyr Asp Asn Asn Arg Ile Pro Phe Phe Ala Asn Gly 420 425 430 Trp Val Ile Gly Asp Phe Lys Thr Val Ser Ser Gly Ala Asp Phe Trp 435 440 445 Gly Ala Met Pro Asp Val Phe Asp Pro Glu Phe Lys Val Arg Ala Met 450 455 460 Glu Thr Ala Arg Val Val Ser Glu Glu Ile Lys Asn Ser Pro Trp Cys 465 470 475 480 Val Gly Val Phe Ile Asp Asn Glu Lys Ser Phe Gly Arg Pro Asp Ser 485 490 495 Asp Lys Ala Gln Tyr Gly Ile Pro Ile His Thr Leu Gly Arg Pro Ser 500 505 510 Glu Gly Val Pro Thr Arg Gln Ala Phe Ser Lys Leu Leu Lys Ala Lys 515 520 525 Tyr Lys Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ala Trp Gly Leu Lys Leu Ser 530 535 540 Ser Trp Ala Glu Phe Asp Leu Gly Val Asp Val Lys Ala Leu Pro Val 545 550 555 560 Thr Asp Thr Leu Arg Ala Asp Tyr Ser Met Leu Leu Ser Ala Tyr Ala 565 570 575 Asp Gln Tyr Phe Lys Val Val His Gly Ala Val Glu His Tyr Met Pro 580 585 590 Asn His Leu Tyr Leu Gly Ala Arg Phe Pro Asp Trp Gly Met Pro Met 595 600 605 Glu Val Val Lys Ala Ala Ala Lys Tyr Ala Asp Val Val Ser Tyr Asn 610 615 620 Ser Tyr Lys Glu Gly Leu Pro Lys Gln Lys Trp Ala Phe Leu Ala Glu 625 630 635 640 Leu Asp Lys Pro Ser Ile Ile Gly Glu Phe His Ile Gly Ala Met Asp 645 650 655 His Gly Ser Tyr His Pro Gly Leu Ile His Ala Ala Ser Gln Ala Asp 660 665 670 Arg Gly Glu Met Tyr Lys Asp Tyr Met Gln Ser Val Ile Asp Asn Pro 675 680 685 Tyr Phe Val Gly Ala His Trp Phe Gln Tyr Met Asp Ser Pro Leu Thr 690 695 700 Gly Arg Ala Tyr Asp Gly Glu Asn Tyr Asn Val Gly Phe Val Asp Val 705 710 715 720 Thr Asp Thr Pro Tyr Gln Glu Met Val Asp Ala Ala Lys Glu Val Asn 725 730 735 Ala Lys Ile Tyr Thr Glu Arg Leu Gly Ser Lys 740 745 <210> 2 <211> 806 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Beta-agarooligosaccharide hydrolase <400> 2 Met His Asn Ser Pro Arg Ser Thr Thr Leu Phe Asn Asp Asn Trp Leu 1 5 10 15 Phe Gln Leu Ala Lys Asp Lys Pro Asn Thr Lys Gln Trp Ser Thr Val 20 25 30 Thr Leu Pro His Asp Trp Ser Val Ala Ser Ala Phe Ser Pro Gln Tyr 35 40 45 Asp Gly Ala Thr Gly Tyr Leu Pro Gly Gly Ile Gly Trp Tyr Lys Lys 50 55 60 Gln Phe Lys Asn Pro Leu Asn Lys His Tyr Ser Arg Cys Ile Leu Val 65 70 75 80 Phe Asp Gly Ile Tyr Asn Asn Ala Thr Ile Asn Ile Asn Gly Tyr Asp 85 90 95 Ile His Phe Gln Ala Tyr Gly Tyr Ala Pro Phe Asn Ile Glu Ile Thr 100 105 110 Asp Tyr Leu Lys Ser Asp Asn Val Ile Thr Ile His Val Asp Arg Arg 115 120 125 Arg Tyr Ile Asp Ser Arg Trp Tyr Thr Gly Ser Gly Ile Tyr Arg Asp 130 135 140 Ile Glu Met Val Leu Thr Lys Asp Val Phe Val Pro Ile Trp Glu Asn 145 150 155 160 His Ile Lys Ala Ser Val Ser Ser Asn Gln Ile Gly His Ile His Gln 165 170 175 Gln Leu Met Ile Glu Ala Lys Thr Lys Thr His Tyr Leu Thr Ile Val 180 185 190 Ser Arg Leu Leu Glu Pro Asn Ser Asp Asn Cys Val Ala Thr Ala Arg 195 200 205 Thr His Arg Ser Val Asn Asn Arg Glu Val Cys Asp Leu Glu Leu Thr 210 215 220 Cys Asp Gln Leu Ser Leu Trp Ser Pro Asp Ser Pro Ile Leu Tyr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Thr Gln Ile Tyr Glu Asn Gly Cys Val Ile Asp Lys Val Ser 245 250 255 Glu Asn Ile Gly Phe Arg Ser Ile Glu Phe Ser Pro Glu Gln Gly Phe 260 265 270 Phe Leu Asn Gly Met Pro Thr Lys Val Arg Gly Val Cys Leu His His 275 280 285 Asp Gly Gly Leu Val Gly Ala Ala Val Pro Asp Glu Ile Trp Ile Arg 290 295 300 Arg Leu Ser Lys Leu Lys Gln Cys Gly Val Asn Ala Ile Arg Ile Ala 305 310 315 320 His Asn Pro Ala Ser Lys Arg Leu Leu His Leu Cys Asp Thr Met Gly 325 330 335 Phe Leu Val Gln Asp Glu Phe Phe Asp Glu Trp Asp Tyr Pro Lys Asp 340 345 350 Lys Arg Leu Asn Met Gly Asn Gln His Asp Asp Phe Phe Ser Gln Cys 355 360 365 Tyr Thr Glu His Phe Gln Thr Arg Ala Lys Thr Asp Leu Cys Asn Thr 370 375 380 Leu Lys Cys His Ile Asn His Pro Ser Ile Phe Met Trp Ser Ile Gly 385 390 395 400 Asn Glu Ile Glu Trp Thr Tyr Pro Arg Asn Val Glu Ala Thr Gly Phe 405 410 415 Phe Asp Ala Ser Trp Asp Gly Asn Tyr Phe Trp Ser Leu Pro Pro Asn 420 425 430 Ser Pro Asp Glu Ile Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Pro Gln His Thr 435 440 445 Tyr Asp Ile Gly Lys Thr Ala Asn Lys Leu Ala Arg Trp Val Lys Ala 450 455 460 Ile Asp Gln Thr Arg Pro Ile Thr Ala Asn Cys Ile Leu Pro Ser Ser 465 470 475 480 Ser Tyr His Ser Gly Tyr Ala Asp Ala Leu Asp Val Ile Gly Phe Ser 485 490 495 Tyr Arg Arg Val Val Tyr Asp Tyr Gly His Glu Ile Arg Pro Asn Leu 500 505 510 Pro Ile Ile Gly Asn Glu Asn Leu Pro Gln Trp His Glu Trp Lys Ala 515 520 525 Val Leu Glu Arg Asn His Val Ser Gly Leu Phe Leu Trp Thr Gly Ile 530 535 540 Asn Tyr Met Gly Glu Ser His Gly Lys Trp Pro Val Arg Thr Thr Asp 545 550 555 560 Ser Gly Leu Leu Asp Thr Ala Gly Phe Glu Lys Pro Ser Tyr Ala Leu 565 570 575 Phe Lys Ser Leu Trp Thr Asp Glu Pro Tyr Val Lys Val Phe Thr Gln 580 585 590 Arg Ala Asp Leu Thr Gln Leu Lys Phe Asp Glu Gln Thr Phe Val Ala 595 600 605 Phe Glu His Asp Glu Asn Ala Trp Gln Lys Lys Leu Trp Val Trp Asp 610 615 620 Glu Arg Asn Ser His Trp Asn Tyr Glu Asn Glu Gln Trp Val Thr Ile 625 630 635 640 Glu Ala Tyr Ser Asn Cys Pro Gln Val Gln Leu Tyr Leu Asn Asp Glu 645 650 655 Leu Val Gly Thr Gln Gln Leu Glu Lys Gln Ile Asp Arg Val Phe Arg 660 665 670 Trp Ala Leu Pro Tyr Arg Ala Gly Lys Ile Ser Leu Val Gly Leu Lys 675 680 685 Asn Asp Val Glu Val Thr Arg Asp Glu Ile Val Thr Ser Gly Val Pro 690 695 700 Arg Lys Ile Ser Ile Val Asp Glu Thr His Glu Gly Ser Ser Ser Tyr 705 710 715 720 Arg Gln Leu Ile Val Gln Met Leu Asp Lys Asp Asn His Pro Val Ser 725 730 735 His Glu Glu Ala Leu Leu Glu Phe Arg Val Arg Gly Cys Glu Trp Ile 740 745 750 Gly Ala Asp Asn Gly Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Pro 755 760 765 Thr Ile Ala Thr Arg His Gly Arg Val Leu Ala Val Val Lys Ser Ser 770 775 780 Gln Gly Gln Ser Gly Asp Ile Glu Ile Tyr Ser Asn Ser Gly Val Lys 785 790 795 800 Ala Ser Phe Ser Leu Leu 805 <210> 3 <211> 368 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Alpha neoagarobiose hydrolase <400> 3 Met Ser Asp Ser Lys Val Asn Lys Lys Leu Ser Lys Ala Ser Leu Arg 1 5 10 15 Ala Ile Glu Arg Gly Tyr Asp Glu Lys Gly Pro Glu Trp Leu Phe Glu 20 25 30 Phe Asp Ile Thr Pro Leu Lys Gly Asp Leu Ala Tyr Glu Glu Gly Val 35 40 45 Ile Arg Arg Asp Pro Ser Ala Val Leu Lys Val Asp Asp Glu Tyr His 50 55 60 Val Trp Tyr Thr Lys Gly Glu Gly Glu Thr Val Gly Phe Gly Ser Asp 65 70 75 80 Asn Pro Glu Asp Lys Val Phe Pro Trp Asp Lys Thr Glu Val Trp His 85 90 95 Ala Thr Ser Lys Asp Lys Ile Thr Trp Lys Glu Ile Gly Pro Ala Ile 100 105 110 Gln Arg Gly Ala Ala Gly Ala Tyr Asp Asp Arg Ala Val Phe Thr Pro 115 120 125 Glu Val Leu Arg His Asn Gly Thr Tyr Tyr Leu Val Tyr Gln Thr Val 130 135 140 Lys Ala Pro Tyr Leu Asn Arg Ser Leu Glu His Ile Ala Ile Ala Tyr 145 150 155 160 Ser Asp Ser Pro Phe Gly Pro Trp Thr Lys Ser Asp Ala Pro Ile Leu 165 170 175 Ser Pro Glu Asn Asp Gly Val Trp Asp Thr Asp Glu Asp Asn Arg Phe 180 185 190 Leu Val Lys Glu Lys Gly Ser Phe Asp Ser His Lys Val His Asp Pro 195 200 205 Cys Leu Met Phe Phe Asn Asn Arg Phe Tyr Leu Tyr Tyr Lys Gly Glu 210 215 220 Thr Met Gly Glu Ser Met Asn Met Gly Gly Arg Glu Ile Lys His Gly 225 230 235 240 Val Ala Ile Ala Asp Ser Pro Leu Gly Pro Tyr Thr Lys Ser Glu Tyr 245 250 255 Asn Pro Ile Thr Asn Ser Gly His Glu Val Ala Val Trp Pro Tyr Lys 260 265 270 Gly Gly Met Ala Thr Met Leu Thr Thr Asp Gly Pro Glu Lys Asn Thr 275 280 285 Cys Gln Trp Ala Glu Asp Gly Ile Asn Phe Asp Ile Met Ser His Ile 290 295 300 Lys Gly Ala Pro Glu Ala Val Gly Phe Phe Arg Pro Glu Ser Asp Ser 305 310 315 320 Asp Asp Pro Ile Ser Gly Ile Glu Trp Gly Leu Ser His Lys Tyr Asp 325 330 335 Ala Ser Trp Asn Trp Asn Tyr Leu Cys Phe Phe Lys Thr Arg Arg Gln 340 345 350 Val Leu Asp Ala Gly Ser Tyr Gln Gln Thr Gly Asp Ser Gly Ala Val 355 360 365

Claims (19)

  1. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 얻은 반응 산물을 분리 정제하여 수득하며,
    상기 전 처리는 아가로스와 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 5분 내지 6시간 동안 반응시키는 것이고, 상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 삭제
  4. 제2항에 있어서,
    아가로스 분해효소는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제2항에 있어서,
    아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제2항에 있어서,
    알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 얻은 반응 산물을 분리 정제하여 수득하며,
    상기 전 처리는 아가로스와 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 5분 내지 6시간 동안 반응시키는 것이고, 상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    아가로스 분해효소는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물.
  12. 제9항에 있어서,
    아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물.
  13. 제9항에 있어서,
    알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 구강 위생용 조성물.
  14. 3,6-안하이드로-L-갈락토오스(3,6-anhydro-L-galactose)를 포함하는 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 3,6-안하이드로-L-갈락토오스는
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소의 효소 혼합물을 반응시키거나,
    전처리된 아가로스와, 아가로스 분해효소, 아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase) 및 알파-네오아가로바이오스 가수분해효소를 순차적으로 반응시켜 얻은 반응 산물을 분리 정제하여 수득하며,
    상기 전 처리는 아가로스와 약산을 40 내지 150℃의 온도 범위에서 5분 내지 6시간 동안 반응시키는 것이고, 상기 약산은 아세트산(Acetic acid), 포름산(Formic acid), 숙신산(Succinic acid), 시트르산(Citric acid), 말산(Malic acid), 말레산(Maleic acid) 및 옥살산(Oxalic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  16. 삭제
  17. 제15항에 있어서,
    아가로스 분해효소는 SEQ ID NO:1에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    아가분해능이 있는 베타-갈락토시다아제(agarolytic β-galactosidase)는 SEQ ID NO:2에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  19. 제15항에 있어서,
    알파-네오아가로바이오스 가수분해효소는 SEQ ID NO:3에 기재된 아미노산 서열로 표시되는, 치아우식증, 치은염, 치주염, 구강내 점막 궤양, 구취 또는 구강건조증 중에서 선택된 어느 하나의 구강 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102011721B1 (ko) 2017-11-28 2019-08-19 고려대학교 산학협력단 포도상구균의 생육을 억제하는 한천 유래 올리고당의 용도
SG11202102697XA (en) * 2018-10-19 2021-04-29 Avalon Hepapoc Ltd Galactose oral composition and use thereof

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090092565A1 (en) 2005-05-19 2009-04-09 Lotte Co., Ltd. Dental enamel recalcification accelerator and containing the same, oral composition and food or beverage

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20100040438A (ko) 2008-10-10 2010-04-20 고려대학교 산학협력단 신규한 아가레이즈 및 이를 이용한 아가로스로부터 아가로올리고사카라이드의 효소적 생산방법
JP5468680B2 (ja) * 2009-03-27 2014-04-09 コリア ユニバーシティ リサーチ アンド ビジネス ファウンデーション 新規なアルファ−ネオアガロビオース加水分解酵素及びそれを用いた単糖類の獲得方法
US9555269B2 (en) * 2009-08-07 2017-01-31 Fmc Corporation Carrageenan products and method for their production and use
KR101316084B1 (ko) * 2011-01-24 2013-11-13 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-ｌ-갈락토오스에 작용하는 신규한 3,6-안하이드로-ｌ-갈락토오스 데히드로게나제와 이 효소를 이용한 3,6-안하이드로 갈락토닉산의 생산
BR112014010899A2 (pt) * 2011-11-07 2017-05-16 Wrigley W M Jun Co base de goma de mascar que contém polissacarídeos substituídos e produtos de goma de mascar produzidos a partir da mesma
US20150216778A1 (en) * 2012-01-18 2015-08-06 Korea University Research And Business Foundation Method for Preparing 3,6-Anhydro-L-Galactose, And Use Thereof
KR101489732B1 (ko) * 2013-03-15 2015-02-04 고려대학교 산학협력단 3,6-안하이드로-l-갈락토오스를 포함하는 대장암 예방 또는 치료용 조성물
KR101521711B1 (ko) 2013-10-14 2015-05-19 고려대학교 산학협력단 신규한 아가로올리고당 분해효소 및 이를 이용한 아가로오스로부터 3,6-안하이드로-l-갈락토오스와 갈락토오스의 생산방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090092565A1 (en) 2005-05-19 2009-04-09 Lotte Co., Ltd. Dental enamel recalcification accelerator and containing the same, oral composition and food or beverage

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