KR20030066801A - α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드 - Google Patents

α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드 Download PDF

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Abstract

본발명은, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당의 제조에 사용할 수 있는 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA와 그 용도를 제공하는 것을 과제로 하고, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성하는 폴리펩티드, 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA, 이 폴리펩티드를 코우드하는 DNA와 자율 복제 가능한 벡터를 함유해서 되는 복제 가능한 재조합 DNA, 이 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입해서 되는 형질 전환체, 이 폴리펩티드의 제조 방법과 그 용도를 확립함으로써 상기 과제를 해결한다.

Description

α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드{POLYPEPTIDE HAVING α-ISOMALTOSYLGLUCOSACCHARIDE SYNTHASE ACTIVITY}
글루코오스를 구성당으로 하는 당질, 예를 들면, 전분을 원료로 하여 제조되는 전분 부분 분해물로서는, 아밀로오스, 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올리고당, 이소말토올리고당 등이 알려져 있다. 이들 당질은, 통상, 분자의 양단의 어느 한쪽이 비환원 말단이고 다른 쪽이 환원 말단이며, 환원성을 나타내는 것이 알려져 있다. 일반적으로 전분 부분 분해물은 고형물당(當)의 환원력의 크기를 덱스트로오스 이퀴벌렌트 (Dextrose Equivalent = DE)로서 나타내어진다. 이 값이 큰 것은, 통상, 저분자, 저점도, 단 맛이 있고, 반응성이 강하여 아미노산이나 단백질 등의 아미노기를 가진 물질과 아미노카르보닐 반응을 일으키기 쉽고, 갈변해서 악취를 발생하므로 얻어지는 제품의 품질을 열화하기 쉽다는 결점이 있는 것이 알려져 있다. 이와 같은 결점을 개선하기 위해서, 전분 부분 분해물의 구성당인 글루코오스를 변경함이 없이 그 환원력을 저감, 혹은 소멸시키는 방법이 오래전부터 요망되고 있었다. 예를 들면, 『Journal of American Chemical Society』, 제71권, 353 내지 358 페이지 (1949년)에 개시되어 있는 바와 같이, 전분에 마세란스 아말라아제(macerans amylase)를 작용시킴으로써, 6 내지 8 분자의 글루코오스가 α-1,4 글루코실 결합한 α-, β- 또는 γ-환상 덱스트린을 생성시키는 방법이 알려져 있다.
현재로서는, 전분으로부터 이들 환상 덱스트린이 공업적 규모로 생산되어, 그것들이 가진 비환원성, 무미성, 포접(包接) 능력 등의 특성을 살려 각종 용도에 이용되고 있다. 또한, 먼저 본 출원인이 일본국의 특개평7-143876호 공보 및 특개평7-213283호 공보 등에 개시한 바와 같이, 말토올리고당 등의 전분 부분 분해물에 비환원성 당질생성 효소 및 트레할로오스 유리 효소를 작용시킴으로써, 2 분자의 글루코오스가 α,α-결합한 트레할로오스를 생성시키는 방법도 알려져 있다. 현재로서는, 이 트레할로오스는 전분으로부터 공업적 규모로 생산되어, 그 비환원성이고 온화해서 고품질의 단 맛 특성 등을 살린 용도에 이용되고 있다. 이와같이, 글루코오스를 구성당으로 하는 비환원성 당질로서, 글루코오스 중합도가 2인 α,α-트레할로오스, 글루코오스 중합도가 6 내지 8인 α-, β-, γ-환상 덱스트린이 공업적 규모로 생산되어, 그것들의 특성을 살려서 각종 용도에 이용되고 있지만, 이와 같은 비환원성 당질의 종류에는 한계가 있고, 또한 다종다양한 비환원성 당질 내지 저환원성 당질의 확립이 기대되고 있다.
한편, 최근, 글루코오스를 구성당으로 하는 새로운 환상의 4당류가 보고되었다. 즉, 『European Journa1 of Biochemistry』, 제226권, 641 내지 648(1994년)에는, 주로 글루코오스 잔기가 α-1,3 결합과 α-1,6 결합이 교대로 연결되어 있는알테르난(alternan)에, 가수분해 효소 알테르나나아제(alternanase)를 작용시킴으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당 (본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한, 이 당질을 「환상 4당」이라고 약칭한다.)이 생성하고, 이것을 메탄올 공존하에서 결정석출시키는 것이 나와 있다.
이와 같은 환상구조를 가진 환상 4당은 비환원성의 당질이고, 포접 능력을 나타내며, 휘발성 유기물을 안정화하는 작용이나 아미노카르보닐 반응을 일으키지 않아, 갈변, 열화를 우려함이 없이 각종 용도에 이용, 가공할 수 있는 것으로 기대되고 있다.
그러나, 환상 4당의 제조에 필요한 원료인 알테르난이나 효소인 알테르나나아제의 입수가 곤란할 뿐만 아니라, 이와 같은 효소를 생산하는 미생물도 용이하게 입수할 수 있는 상태는 아니다.
이와 같은 상황하에서 본 발명자들은, 먼저, 국제특허출원 공개 제 W0 01/90338 Al호에 개시한 바와 같이, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질 (본 명세서에서는 이 당질을 「α-이소말토실글루코 당질」이라고 약칭할 경우도 있다.)을 원료로 해서 여기에, 이 당질의 α-이소말토실 부분과 그 이외의 글루코 당질 부분을 특이적으로 절단하고, 이 α-이소말토실 부분을 전이해서 환상 4당을 생성하는 α-이소말토실 전이 효소를 작용시켜서 환상 4당을 생성시키는 것에 성공하였다. 이 α-이소말토실 전이 효소는, α- 이소말토 글루코 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써 환상 4당을 생성하는 효소이며, 상세히는, 아래의 이화학적 성질을 가진 α-이소말토실 전이 효소이다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상의 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실―(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성한다.
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에 의해, 약 82,000 내지 약 136,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
(3) 등전점
앰폴라인 함유 전기 영동법에 의해, pI 약 3.7 내지 약 8.3의 범위에서 등전점을 가진다.
(4) 최적 온도
pH 6.0, 30분간 반응의 반응 조건하에서 약 45 내지 약 50℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
(5 ) 최적 pH
35℃, 30분간 반응의 반응 조건하에서 pH 약 5.5 내지 약 6.5의 온도범위내에서 최적 pH를 가진다.
(6) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 약 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
(7）pH 안정성
4℃, 24시간 유지하는 조건하에서 pH 약 3.6 내지 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
그러나, 환상 4당 원료당질에 대해서 보면, 풍부하고 염가로 공급되는 전분으로부터의 생산이 기대되지만, 실제로는 α-이소말토실 전이 효소가 전분에 직접 작용하지 않으므로 미리, 전분을 앞서 설명한 특정 구조를 가진 α-이소말토실글루코 당질, 예를 들면, 파노오스나 이소말토실말토오스 등의 비교적 저분자의 이소말토올리고당으로 변환시키고, 이어서, 여기에 α-이소말토실 전이 효소를 작용시켜서 환상 4당을 생성시키는 수법이 채용되고 있다. 한편, 원료로부터의 환상 4당의 수율에 대해서 보면 파노오스를 이용할 경우 원료 파노오스 중량당의 수율은 약 44％이다. 마찬가지로, 이소말토실말토오스를 사용할 경우의 수율은 약 31％인 것에 대해서, 전분을 사용할 경우에는 미리, α-아밀라아제, 전분 지절(枝切) 효소, β-아밀라아제 및 α-글루코시다아제 등을 작용시켜서 파노오스 등의 비교적 저분자의 이소말토올리고당을 생성시킬 필요가 있을 뿐만 아니라, 환상 4당의 수율도 약 15％로서 극히 낮은 것이 밝혀지고 있다. 전분으로부터의 환상 4당의 생산은, 이와 같이 낮은 생성율에서도 가능하지만 고비용의 우려가 있어, 전분을 원료로 하여 환상 4당의 수율을 향상시킨 신규의 제조 방법의 확립이 요망되고 있었다.
이와 같은 상황하에서 본 발명자들은 전분을 원료로 해서 전분으로부터 환상 4당의 수율을 현저하게 향상시킬 수 있는 α-이소말토실글루코 당질을 생성하는 신규의 효소에 기대를 걸고 미생물을 널리 검색해 왔다. 그 결과, 의외로 국제특허출원 공개 제 WO Ol/90338 Al호에 개시한 토양으로부터의 분리균 바실루스(Bacillus)속(屬) 및 아르드로박터(Arthrobacter) 속(屬)에 속하는 α-이소말토실 전이 효소 생산 미생물 C9주, Cll주, N75주 및 A19주가 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소도 아울러 생산하는 것을 발견하고, 전분 부분 분해물을 비롯한 비교적 고분자의 글루코 당질에 이 신규의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소와 α-이소말토실 전이 효소를 작용시킴으로써 목표로 하고 있었던 환상 4당의 수율을 현저하게 향상시킬 수 있는 것을 발견하여, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 여러 가지 성질을 밝힘과 아울러 그 제조 방법을 확립하고, 더욱이는 이 효소에 의한 α-글루코실 전이반응 방법, α-이소말토실글루코 당질의 제조 방법, 및 이 효소와 α-이소말토실 전이 효소를 병용한 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질 및 그 제조 방법, 아울러 이들 방법에 의해 얻어지는 환상 4당, 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시킨 음식물, 화장품, 의약품 등의 조성물을 확립하였다.
그러나 이들 미생물은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 생산 능력이 충분하지 않아, α-이소말토실글루코 당질이나 환상 4당을 대규모로 제조할 경우, 이와 같은 이 효소의 공급원으로서의 미생물을 대량으로 배양해야만 한다는 문제가 있다.
이 점, 오늘에서는 분자 생물학이 진전되고, 효소의 본질이 폴리펩티드이며, 그것을 구성하는 아미노산 서열이 그 효소 활성의 발현을 좌우하는 것이고, 그 아미노산 서열은 유전자 DNA에 암호화되어 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 폴리펩티드를 코우드하는 유전자를 단리하여 그 염기서열을 해명할 수 있으면, 그 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하는 재조합 DNA를 작제하고, 이것을 적당한 미생물이나 동식물 세포에 도입하고, 얻어지는 형질 전환체를 적당한 영양배지 중에서 배양
함으로써, 비교적 용이하게 소망량의 폴리펩티드를 취득할 수 있게 되었다. 이와 같은 상황을 감안하여 상기 효소의 본질인 폴리펩티드를 코우드하는 유전자를 밝혀 내고, 그 염기서열을 해명하는 것이 급선무로 되어 있다.
본 발명은, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드 (이하, 별달리 명시하지 않는 한, 「본 발명의 폴리펩티드」라고 한다.) 및 유전자 재조합 기술에 의한 이 폴리펩티드의 제조 방법과 그 용도에 관한 것이다.
도 1은 말토테트라오스에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 작용시켰을 때에 생성하는 생성물 X의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 2는 말토펜타오스에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 작용시켰을 때에 생성하는 생성물 Y의1H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 3은 말토테트라오스에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 작용시켰을 때에 생성하는 생성물 X의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 4는 말토펜타오스에 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 작용시켰을 때에 생성하는 생성물 Y의13C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도 5는 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
도 6은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
도 7은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
도 8은 바실루스 글로비스포루스 C9주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.
도 9는 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.
도 10은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 효소 활성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.
도 11은 본 발명의 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
도 12는 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
도 13은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 온도 안정성을 나타내는 도면이다.
도 14는 바실루스 글로비스포루스 C11주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
도 15는, 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
도 16은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 pH 안정성을 나타내는 도면이다.
도 17은 본 발명에 의한 재조합 DNA 『pBGC2』의 제한 효소 지도를 나타내는 도면이다. 도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은 바실루스 글로비스포루스 Cll 유래의 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 코우드하는 DNA이다.
도 18은 본 발명에 의한 재조합 DNA의 『pBGN2』의 제한 효소지도를 나타내는 도면이다. 도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은, 바실루스 글로비스포루스 N75 유래의 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 코우드하는 DNA이다.
도 19는 본 발명에 의한 재조합 DNA의 『pAGAl』의 제한 효소지도를 나타내는 도면이다. 도면 중에서, 검은 굵은 선으로 나타낸 부분은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 본 발명의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 코우드하는 DNA이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
본 발명의 폴리펩티드라 함은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하는 효소 활성을 가진 폴리펩티드 전반을 의미한다. 본 발명의 폴리펩티드는, 통상, 해명된 아미노산 서열을 가지고 있고, 그 한가지 예를 들면, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열, 혹은 그 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산, 즉,1개 또는 2개 이상, 경우에 따라서는,1개 내지 50개, 혹은,1개 내지 30개, 혹은,1개 내지 10개의 아미노산이 결실했거나, 다른 아미노산으로 치환되었거나, 더욱이는 부가된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 예시할 수 있다. 그리고 같은 DNA이더라도 그것을 도입하는 숙주나, 그 DNA를 함유하는 형질 전환체의 배양에 사용하는 영양배지성분, 조성이나 배양 온도, pH 등에 따라서는 숙주내외 효소에 의한 DNA 발현후의 수식 등에 의해 소기의 이화학적 성질은 유지하고 있기는 하지만, 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열에 있어서의 N 말단 부근의 아미노산이 1개 혹은 복수개, 즉,1개 또는 2개 이상, 경우에 따라서는,1개 내지 50개,1개 내지 30개, 혹은,1개 내지 20개, 혹은,1개 내지 10개 결실했거나, 다른 아미노산과 치환되었거나, 더욱이는 N 말단에 1개 또는 2개 이상, 경우에 따라서는 1개 내지 30개, 혹은,1개 내지 20개, 혹은,1개 내지 10개의 아미노산이 새롭게 부가한 변이체가 생성할 경우가 있다. 이와 같은 변이체이어도, 그것이 소기의 이화학적 성질을 구비하고 있는 한, 당연히 본 발명의 폴리펩티드에 포함되는 것은 말할 필요도 없다.
본 발명의 폴리펩티드는, 본 발명의 DNA를 적당한 숙주에 도입하여 얻어지는 형질 전환체의 배양액으로부터 채취할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 형질 전환체로서는, 예를 들면, 서열표에 있어서의 서열 번호 4, 5, 또는 6에 나온 5' 말단으로부터의 염기서열 혹은, 그것들의 염기서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가한 염기서열, 또는, 그것들에 상보적인 염기서열 혹은 그것들의 염기서열에 있어서의 1개 혹은 복수개를, 유전자의 축중에 근거하여 그것이 코우드하는 아미노산 서열을 변경함이 없이 다른 염기로 치환한 염기서열로 된 DNA를 함유하는 형질 전환체를 예시할 수 있다. 또한, 상기 염기서열로서, 유전자 코우드의 축중을 이용하여 코우드하는 아미노산 서열을 변경함이 없이 염기의 1개 혹은 복수개, 즉,1개 또는 2개 이상, 경우에 따라서는 1개 내지 150개,1개 내지 90개,혹은 1개 내지 60개, 혹은 1개 내지 30개를 다른 염기로 치환한 것을 예시할 수 있다.
본 발명의 DNA는, 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 염기서열인 한, 천연유래의 것이어도 좋고 인위적으로 합성된 것이어도 좋으며 그 유래는 묻지 않는다. 천연의 공급원으로서는, 예를 들면, 평성12년 4월 25일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1 중앙 제6 소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7143으로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스 C9주, 평성12년 4월 25일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1 중앙 제6 소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허생물기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7144로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스 Cll주, 및 평성13년 5월 16일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1 중앙 제6 소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허생물기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7591로서 기탁되어 있는 바실루스 글로비스포루스 N75주를 포함하는 바실루스 속(屬), 또는, 평성13년 5월 16일자로 일본국 이바라키현 쯔쿠바시 동1정목 1번지 1 중앙 제6 소재의 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허생물기탁 센터에 수탁 번호 FERM BP-7590로서 기탁되어 있는 아르드로박터 글로비포르미스 A19주를 포함하는 아르드로박터 속(屬)의 미생물을 들 수 있다.
이들 미생물의 균체로부터는 본 발명의 DNA를 함유하는 유전자가 얻어진다. 즉, 이와 같은 미생물을 영양배지에 접종하여 호기적 조건하에서 약 1 내지 약 3일간 배양후, 배양물로부터 균체를 채취하고, 리소자임이나 β-굴루카나아제 등의 세포벽 용해효소나 초음파로써 처리함으로써 이 DNA를 함유하는 유전자를 균체 밖으로 용출시킨다. 이 때, 프로테아제 등의 단백질 분해 효소를 이용하거나, SDS 등의 계면 활성제의 존재하에서 동결 융해할 수도 있다. 이렇게 해서 얻어지는 처리물에, 예를 들면, 페놀 추출, 알코올 침전, 원심분리, 리보누클레아제처리 등, 이 분야에 있어서의 통상 일반적인 방법을 적용함으로써 목적의 DNA를 얻을 수 있다. 한편, 본 발명의 DNA를 인위적으로 합성하기 위해서는, 예를 들면, 서열표에 있어서의 서열 번호 4, 5, 또는 6에 나온 염기서열에 근거해서 화학합성하면 좋다. 또한, 이 DNA를 함유하는 유전자를 주형으로 하고, 적당한 프라이머가 될 수 있는 화학합성 DNA를 이용하여 PCR 합성하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
이들 DNA를 이용해서 본 발명의 폴리펩티드를 공업적으로 대량으로, 염가로 용이하게 제조할 수 있다. 즉, 이 DNA를, 통상, 자율 복제 가능한 적당한 벡터에 삽입해서 재조합 DNA로 하고, 이것을 적당한 숙주에 도입하여 얻어지는 형질 전환체를 적당한 영양배지 중에서 배양하여 그 배양물로부터 균체를 채취하고, 그 균체로부터 이 DNA를 함유하는 재조합 DNA를 얻고, 이것을, 통상, 용이하게 증식시킬 수 있는 적당한 숙주에 도입해서 형질전환하고, 얻어지는 형질 전환체를 적당한 영양배지 중에서 배양함으로써, 본 발명의 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 상기 재조합 DNA는, 본 발명의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 입수할 수 있기만 하면, 보통 일반적인 재조합 DNA 기술에 의해 비교적으로 용이하게 조제할 수 있다. 그리고 상기한 벡터로서 예를 들면, pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), pUBllO, pTZ4, pC194, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7 등의 플라스미드 벡터나 λgt·λC 및 λgt·λB, ρ11, φ1, φ105 등의 파아지 벡터를 들 수 있다. 이 중에서, 본 발명의 DNA를 대장균에서 발현시키기 위해서는, pBR322, pUC18, Bluescript II SK(+), λgt·λC 및 λgt·λB가 적합하고, 한편, 고초균에서 발현시키기 위해서는, pUBllO, pTZ4,pC194, ρ11, φ1, φ105가 적합하다. pHV14, TRp7, YEp7 및 pBS7은 재조합 DNA를 2종 이상의 숙주내에서 복제시킬 경우에 유용하다.
본 발명에 관계되는 DNA를 상기 벡터에 삽입하기 위해서는, 이 분야에서 통상 일반적인 방법이 채용된다. 구체적으로는, 우선, DNA를 함유하는 유전자와 자율 복제 가능한 벡터를 제한 효소 및/또는 초음파에 의해 절단한 다음에, 생성한 DNA 단편과 벡터 단편을 연결한다. 유전자 및 벡터의 절단에 뉴클레오티드에 특이적으로 작용하는 제한 효소, 특히, II형의 제한 효소, 상세하게는, Sau 3Al, Eco Rl, Hind lll, Bam HI, Sal I, Xba l, Sac I, Pst I 등을 사용하면, DNA 단편과 벡터 단편을 연결하는 것이 용이하다. 필요에 따라서, 양자를 어닐링한 후, 생체내 또는 생체외에서 DNA 리가아제를 작용시키면 좋다. 이렇게 해서 얻어지는 재조합 DNA는, 대장균, 고초균, 방선균, 효모 등의 적당한 숙주에 도입해서 형질 전환체로 하고, 이들 형질 전환체로부터 소망의 형질 전환체를 클로닝 하여, 이것을 배양함으로써 용이하게 대량으로 복제 가능하다. 상기 클로닝시에는, 콜로니 하이브리다이제이션법을 적용하거나, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질을 함유하는 영양배지에서 배양하고, 그 당질로부터 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성하는 형질 전환체를 선택하면 좋다.
이들 클로닝에 의해 얻어지는 형질 전환체는 영양배지에서 배양하면 균체 내외에서 이 폴리펩티드를 생산한다. 영양배지로서는, 통상, 탄소원, 질소원, 미네랄, 더욱이는, 필요에 따라서, 아미노산이나 비타민 등의 미량 영양소를 보충한 통상 일반적인 액체배지가 사용되고, 각각의 탄소원으로서는, 예를 들면, 전분, 전분 가수 분해물, 글루코오스, 과당, 수크로오스, 트레할로오스 등의 당원(糖原)이, 또한, 질소원으로서는, 예를 들면, 암모니아 내지 암모니아 염, 뇨소, 질산염, 펩톤, 효모 엑기스, 탈지 대두, 콘 스티프 리커, 육류 엑기스 등의 함(含)질소 무기 내지 유기물을 들 수 있다. 형질 전환체를 이와 같은 영양배지에 접종하고, 영양배지를 온도 20 내지 40℃, pH 2 내지 10으로 유지하면서, 통기(通氣) 교반 등에 의한 호기적 조건하에서 약 1 내지 약 6일간 배양하면, 이 폴리펩티드를 함유하는 배양물이 얻어진다. 이 배양물은 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조(粗)폴리펩티드로 해서 그대로 사용가능하지만, 통상은 사용에 앞서, 필요에 따라서, 침투압 쇼크나 계면 활성제에 의해 균체로부터 추출하거나, 초음파나 세포용해 효소에 의해 균체를 파쇄한 후, 여과, 원심분리 등에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 균체 또는 균체 파쇄물로부터 분리하고, 정제한다. 정제에는 이 분야에 있어서 폴리펩티드를 정제하기 위해서 이용되는 통상의 방법을 채용할 수 있고, 예를 들면, 균체 또는 균체 파쇄물을 제거한 배양물에 농축, 염석, 투석, 분별 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동, 등전점 전기영동 등으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 방법을 적당히 조합시켜서 적용하면 좋다. 본 발명의 폴리펩티드는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성하는 효소 활성을 가지고 있는데, 상세하게는 아래의 이화학적 성질을 가진다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성한다
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에 의해 약 74,000 내지 약 160,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
(3) 최적 온도
pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 약 40 내지 약 50℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 45 내지 약 55℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는,
pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 65℃에서 최적 온도를 가진다.
(4) 최적 pH
35℃, 60분간 반응의 조건하에서 pH 약 6.0 내지 8.4의 온도범위내에서 최적 pH를 가진다.
(5) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건하에서 약 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
pH 8.0, 60분간 반응의 조건하에서 55℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다. 또는, pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
(6）pH 안정성
4℃, 24시간 유지하는 조건하에서 pH 약 5.0 내지 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
본 발명의 폴리펩티드가 작용하는 기질로서는, 전분, 아밀로펙틴, 아밀로오스, 글리코겐 등의 α-1,4 글루코실 결합을 가진 다당이나, 그것들을 아밀라아제 또는 산 등에 의해 부분적으로 가수분해해서 얻어지는 아밀로덱스트린, 말토덱스트린, 말토올리고당 등의 부분 분해물이 사용된다. 이들 α-1,4 결합을 가진 글루코당질을, 다시 브랜칭 엔자임 등의 가지붙임 효소(EC 2.4.1.18)로써 처리한 당질을 사용하는 것도 마음대로이다. 아밀라아제로써 분해한 부분 분해물로서는, 예를 들면, 『Handbook of Amylases and Related Enzymes』, 퍼가몬·프레스사 (동경) (1988년)에 기재되어 있는 α-아밀라아제(EC 3.2.1.1), β-아밀라아제(EC 3.2.1.2), 말토트리오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.116), 말토테트라오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.60), 말토펜타오스 생성 아밀라아제, 말토헥사오스 생성 아밀라아제(EC 3.2.1.98) 등의 아밀라아제로써 분해한 부분 분해물을 사용할 수 있다. 더욱이는, 부분 분해물을 조제할 때, 풀룰라나아제(3.2.1.41), 이소아밀라아제(EC 3.2.1.68) 등의 전분 지절 효소를 작용시키는 것도 마음대로이다. 기질로서의 전분은, 옥수수, 밀, 쌀 등의 곡류에서 유래하는 지상 전분이어도 좋고, 또한 감자, 고구마, 타피오카 등의 지하 전분이어도 좋은데, 바람직하게는, 전분을 호화(糊化) 및/또는 액화한 용액으로 하여 사용한다. 그 전분의 부분 분해의 정도는 낮을 수록 환상 4당의 생성율이 높아지므로, DE 약 20 이하, 바람직하게는 약 12 이하, 더욱 바람직하게는 약 5 이하가 적합하다. 기질농도는 특히 한정되지 않는다. 예를 들면, 기질농도 0.1％(w/w) (이하, 본 명세서에서는 별달리 명시하지 않는 한,「％(w/w)」을 간단히 「％」로 약칭한다)의 저농도 용액으로 하여 사용했을 경우에도 본 발명의 효소반응은 진행하지만, 공업적으로는 1％ 이상이 적합하다. 또한, 기질용액 중에 완전히 용해하지 않은 불용성 기질을 함유하는 것이어도 좋다. 바람직하게는, 농도 40％ 이하, 더욱 바람직하게는 20％ 이하가 적합하다. 반응 온도는 반응이 진행하는 온도, 즉, 65℃ 부근까지의 온도, 바람직하게는 30 내지 55℃ 부근의 온도에서 실시하면 좋다. 반응 pH는, 통상, 4.5 내지 8의 범위로 조정하면 좋다. 바람직하게는 pH 약 5.5 내지 7의 범위로 조정한다. 반응 시간은 효소반응의 진행에 따라 적당히 선택한다.
본 발명의 폴리펩티드를 그 기질에 작용시켜서 생성한 α-이소말토실글루코 당질에 α-이소말토실 전이 효소를 작용시킴으로써, 이 분야에 있어서 유용한 환상 4당을 대량으로 용이하게 제조할 수 있다. α-이소말토실 전이 효소를 작용시키는 시기는, 본 발명의 폴리펩티드를 작용시켜 이 폴리펩티드를 실활시킨 후에 작용시켜도 좋다. 그러나 적절하게는 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소를 병용해서 작용시키는 것이 좋다. 구체적으로는, 전분 또는 그 부분 분해물이나 글리코겐의 수용액에 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소를 병용함으로써, 전분 또는 그 부분 분해물로부터는 환상 4당이 고형물당 약 30％ 이상의 수율로, 또한, 글리코겐의 경우는 고형물당 약 80％ 이상의 수율로 환상 4당이 얻어진다. 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소를 병용할 경우의 환상 4당의 생성 메커니즘은 양자의 반응 특성으로부터 아래와 같이 추측된다.
(1) 본 발명의 폴리펩티드는, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질, 예를 들면, 전분, 글리코겐, 또는 이들의 부분 분해물 등의 당질의 비환원 말단의 α-1,4 글루코실기에 작용하여 글루코오스기를 다른 비환원 말단 글루코오스기의 6 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜 비환원 말단에 α-이소말토실기를 가진 당질이 생성한다.
(2) α-이소말토실 전이 효소는, 비환원 말단에 이소말토실기를 가진 당질에작용하여 그 이소말토실기를, 다른 비환원 말단에 위치하는 이소말토실기를 가진 당질의 비환원 말단 글루코오스기의 3 위치 히드록실기에 분자간 전이시켜 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 당질을 생성한다.
(3) α-이소말토실 전이효소는, 그 비환원 말단에 이소말토실-1,3-이소말토실기를 가진 당질에 작용하여, 분자내 전이작용에 의해 이소말토실-1,3-이소말토실기를 당질로부터 떼어버리고, 이것을 환상화해서 환상 4당을 생성한다.
(4) (3)에 있어서, 이소말토실-1,3-이소말토실기를 떼어버린 후의 당질은, 다시, (1)로부터 (3)의 반응을 경유함으로써 환상 4당을 생성하고, 더욱 이들 반응이 되풀이되어서 현저한 량의 환상 4당이 생성하여 축적된다.
이상, 설명한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소의 병용에 의해, 상기한 바와 같이 양자가 각각의 기질에 반복해서 작용하여 환상 4당의 수율이 현저하게 향상하는 것이라고 추측된다.
또한, 이 환상 4당의 생성반응에 있어서, 다른 전이 효소를 더욱 병용하여 환상 4당의 수율을 향상시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 즉, 예를 들면, 농도 약 15％의 전분 부분 분해물에 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소를 병용해서 작용시킴으로써, 기질 고형물당 약 55％의 수율로 환상 4당이 얻어지고, 동일한 조건으로 본 발명의 폴리펩티드와 α-이소말토실 전이 효소 및 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제의 ３자를 병용해서 작용시킴으로써 기질 고형물당의 환상 4당의 수율을 더욱 약 5 내지 약 10％ 향상시켜서 약 60 내지 약 65％까지 높일 수 있다.
상기의 반응에 의해 얻어진 용액은 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유하는 용액으로서 이대로 사용하는 것도 가능하다. 그러나, 일반적으로는 이들 당질은 적당한 수법에 의해 정제해서 사용된다. 정제 방법으로서는 공지의 방법을 적절히 채용하면 좋고, 예를 들면, 활성탄에서의 탈색, 정제, H형, OH형 이온교환 수지에서의 탈염, 박층 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피, 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 활성탄 칼럼 크로마토그래피, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피 등의 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획, 알코올 및 아세톤 등의 유기용매에 의한 분별, 적당한 분리 성능을 가진 막에 의한 분리, 더욱이는 아밀라아제, 예를 들면, α-아밀라아제, β-아밀라아제, 글루코아밀라아제(EC 3.2.1.3) 등이나 α-글루코시다아제(EC 3.2.1.20) 등의 효소를 이용해서 잔존하는 기타의 당질을 분해하는 방법, 효모에 의한 발효 처리, 알칼리 처리 등에 의한 잔존하는 환원성 당질의 분해 제거 등의 각종 정제방법을 1종 또는 2종 이상 조합하여 정제할 수 있다. 특히, 공업적 대량생산 방법으로서는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피가 적합한데, 예를 들면, 일본국의 특개소58-23799호 공보, 특개소58-72598호 공보 등에 개시되어 있는 강산성 캐타이온 교환 수지를 이용하는 칼럼 크로마토그래피에 의해 협잡 당류를 제거함으로써, 고순도의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 유리하게 제조할 수 있다. 이 경우, 고정상 방식, 이동상 방식, 의사(疑似) 이동상 방식 중의 어느 방식을 채용하는 것도 마음대로이다.
이렇게 하여 얻어진 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 더욱 농축하여 시럽상 제품으로 하거나, 건조해서 비정질의 환상 4당 또는 이것을 함유하는 분말상 당질제품으로 하는 것도 마음대로이다.
그리고 환상 4당 결정을 제조하기 위해서는, 예를 들면, 유기용매 존재하 또는 비존재하에 고형물 순도 약 50％ 이상, 고형물 농도 약 30％ 내지 약 90％의 환상 4당 고함유액을 조정관(助晶罐)에 넣고, 고형물당, 0.1 내지 20％의 환상 4당 종결정 공존하에서, 온도 95℃ 이하, 바람직하게는 10 내지 90℃의 범위에서, 교반조건하에서 고온으로부터 저온으로 서냉하여 환상 4당 결정을 함유하는 매스키트를 제조한다. 이 매스키트로부터 환상 4당 결정 또는 이것을 함유하는 당질을 제조하는 방법으로서는, 예를 들면, 블록 분쇄 방법, 유동 조립(造粒)방법, 분무건조 방법 등의 공지의 방법, 또는 함밀(含蜜)결정을 제조하는 방법으로서는 분밀(分蜜)방법 등을 적절히 채용하면 좋다.
이렇게 해서 얻어지는 환상 4당은 상품으로서 낮은 감미를 가진 비환원성의 백색분말 또는 시럽이고, 안정하며, 다른 소재, 특히 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 등의 아미노산 함유 물질과 혼합하고, 가공해도, 갈변하는 일도 없고, 이상한 냄새를 발생하는 일도 없으며, 또한, 혼합한 기타의 소재의 물성을 손상하는 일도 거의 없다. 또한, 환상 4당은 포접 능력을 가지고 있으므로, 향기성분, 유효성분 등의 휘산, 품질열화를 방지하고, 향기성분, 유효성분의 안정화 유지에 극히 우수하다. 이 경우, 필요하면, 시클로(환상)덱스트린류, 분기 시클로 덱스트린류, 시클로덱스트란류, 시클로푸락탄류 등의 기타의 환상 당질을 병용함으로써, 포접 능력에 의한 각종 성분의 안정화를 더욱 향상시키는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 상기 환상 4당 이외에 시클로덱스트린류 등의 환상 당질은 고순도의 것일 필요는 없고, 저순도의 환상 당질, 예를 들면, 다량의 말토덱스트린과 함께 각종의 시클로 덱스트린을 함유한 전분 부분 분해물이어도 사용할 수 있다.
더욱이 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당은 아밀라아제나 α-글루코시다아제에 의해 실질적으로 분해되지 않아 경구섭취해도 소화 흡수되지 않고, 또한, 장내 세균에 의해 발효되기 어려우므로, 극히 저칼로리의 수용성 식물(食物)섬유로서 이용할 수 있고, 충치 유발균 등에 의해도 발효되기 어려우므로 충치를 일으키기 어려운 감미료로서, 더욱이는 분말상물의 부착, 고결 방지제로서도 사용할 수 있다. 더욱이 이와 같은 환상 4당 자체는 무독, 무해한 천연 감미료이어서 안전하고 안정한 감미료이다. 환상 4당 결정 제품의 경우에는, 풀룰란, 히드록시에틸 스타치, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제와 병용해서 정제, 당의정에 이용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 그리고 침투압 조절성, 부형성, 광택 부여성, 보습성, 점성, 기타 당의 결정 방지성, 난(難)발효성 등의 유용한 성질도 구비하고 있다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 감미료, 정미(呈味) 개량제, 품질 개량제, 안정제, 변색 방지제, 부형제 등으로 하여 음식물, 기호물, 사료, 모이료, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 그대로 단 맛 부여를 위한 조미료로서 사용할 수 있다. 필요하면, 예컨대, 가루엿, 포도당, 과당, 락토오스, 이성화당, 설탕, 맥아당, 트레할로오스(α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스, β,β-트레할로오스), 벌꿀, 메이플 슈거, 소르비톨, 말티톨, 디히드로칼콘, 스테비오시드, α-글리코실스테비오시드, 라칸카 감미물, 글리시리진, 소마틴, L-아스파르틸페닐알라닌메틸 에스테르, 사카린, 아세술팜 K, 수크라로오스, 글라이신, 알라닌 등의 기타 감미료와 병용할 수도 있고, 또한, 덱스트린, 전분, 락토오스 등과 같은 증량제와 병용할 수도 있다. 특히, 에리드리톨, 크실리톨, 말티톨 등의 저칼로리 감미료나 α-글리코실스테비오시드, 소마틴, L-아스파르틸-L-페닐알라닌메틸 에스테르, 사카린, 아세술팜 K, 수크라로오스 등의 1종 또는 2종 이상의 고감미도 감미료와 병용하여 저칼로리 감미료 또는 다이어트 감미료 등으로서 적절하게 이용할 수 있다.
더욱이 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질은, 그대로로, 또는 필요에 따라서, 다른 증량제, 부형제, 결합제 등과 혼합하여 과립, 원형, 단봉상, 판상, 입방체, 정제 등 각종 형상으로 성형해서 이용하는 것도 마음대로이다.
또한 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질의 단 맛은, 신 맛, 짠 맛, 떫은 맛, 감미로움, 쓴 맛 등의 다른 맛을 가진 각종의 물질과 잘 조화하고, 내산성, 내열성도 크므로, 일반 음식물의 단 맛 부여, 정미 개량에, 또한 품질 개량 등에 유리하게 이용할 수 있다. 예를 들면, 간장, 분말간장, 된장, 분말된장, 모로미, 히시오, 후리카케, 마요네즈, 드레싱, 식초, 초간장, 초밥용 분말초, 츄카노모토, 텐츠유, 멘츠유, 소오스, 케첩, 불고기용 소오스, 커리 루우, 스튜 믹스, 수프 믹스, 우려낸 국물 믹스, 복합 조미료, 미린,신미린, 테이블 슈거, 커피 슈거 등의 각종 조미료에 대한 감미료, 더욱이는 정미 개량제, 품질 개량제 등으로서 사용하는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
그리고 예를 들면, 센배이, 아라레, 오코시, 규우히, 떡류, 만두, 우이로, 팥소류, 양갱, 물양갱, 멘다마, 젤리, 카스테라, 눈깔사탕 등의 각종 일본식 과자, 빵, 비스켓, 크래커, 쿠키, 파이, 푸딩, 버터 크림, 카스터드 크림, 슈크림, 와플, 스펀지 케이크, 도넛, 초콜렛, 츄잉검, 캬라멜, 누가, 캔디 등의 각종 양과자, 아이스 크림, 샤베트 등의 빙과, 과실의 시럽절임, 수밀도 등의 시럽류, 플라워 페이스트, 땅콩 페이스트, 후루츠 페이스트 등의 페이스트류, 잼, 마마레이드, 시럽절임, 당과 등의 과실, 야채의 가공 식품류, 후쿠진 츠케, 베타라 츠케, 센마이 츠케, 라쿄 츠케 등의 절인 야채류, 단무지 믹스, 배추절임 믹스 등의 절인 야채용 믹스, 햄, 소세지 등의 축육제품류, 어육 햄, 피시 소시지, 가마보코, 치쿠와, 튀김 등의 어육제품, 섬게, 물오징어의 젓, 슈콘부, 말린 오징어, 미린 조미한 복어 말림, 대구, 타이, 새우 등의 각종 진미류, 김, 산채, 말린 오징어, 작은 물고기, 조개 등으로 제조되는 해산물 조림류, 콩자반, 포테이토 샐러드, 다시마 말이 등의 반찬식품, 유제품, 어육, 축육, 과실, 야채의 병조림, 통조림류, 합성술, 증양주, 청주, 과실주, 발포주, 맥주 등의 주류, 커피, 코코아, 쥬스, 탄산음료, 락트산 음료, 유산균 음료 등의 청량 음료수, 푸린 믹스, 핫케이크 믹스, 즉석 쥬스, 즉석 커피, 즉석 팥죽, 즉석 수프 등의 즉석식품, 더욱이는 이유식, 치료식, 드링크제, 펩티드 식품, 냉동 식품 등의 각종 음식물에의 단 맛 부여에, 정미 개량에, 품질 개량 등에 유리하게 실시할 수 있다.
또한, 가축, 집에서 기르는 새, 기타는 꿀벌, 누에, 물고기 등의 사육 동물을 위한 사료, 이료 등의 기호성을 향상시킬 목적으로 사용할 수도 있다. 그 외에, 담배, 치약, 입술 연지, 립 크림, 내복액, 정제, 트로치, 간유 드롭, 입안 청량제, 입안 향기제, 양치질제 등의 각종 고형물, 페이스트상, 액상 등으로서 기호물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에의 감미제로서, 또는 정미 개량제, 교미제(矯昧劑)로서, 더욱이 품질 개량제, 안정제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
품질 개량제, 안정제로서는, 유효성분, 활성 등을 상실하기 쉬운 각종 생리활성 물질 또는 이것을 함유하는 건강식품, 의약품 등에 유리하게 적용할 수 있다. 예를 들면, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사 인자-α, 종양 괴사 인자-β, 매크로파아지 유주(遊走)저지 인자, 콜로니 자극 인자, 트란스퍼 팩터, 인터류킨 II 등의 림포카인 함유액, 인슐린, 성장 호르몬, 프롤락틴, 에리트로포이에틴, 난세포 자극 호르몬 등의 호르몬 함유 액, BCG 백신, 일본 뇌염 백신, 홍역 백신, 폴리오 생 왁찐, 두묘, 파상풍 톡소이드, 허브 항독소, 인간 면역 글로블린 등의 생물제제 함유액, 페니실린, 에리드로마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린, 스트렙토마이신, 황산 가나마이신 등의 항생물질 함유액, 티아민, 리보플라빈, L-아스코르브산, 간유, 카로티노이드, 에르고스테롤, 토코페롤 등의 비타민 함유액, EPA, DHA, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 또는 그 에스테르 유도체, 리파아제, 에스테라아제, 우로키나아제, 프로테아제, β-아밀라아제, 이소아밀라아제, 굴루카나아제, 락타아제 등의 효소 함유액, 약용 인삼 엑기스, 자라 엑기스, 클로렐라 엑기스, 알로에 엑기스, 프로폴리스 엑기스 등의 엑기스류 또는 로얄 젤리 등의 각종 생리활성 물질, 더욱이 바이러스, 유산균, 효모 등의 생균 페이스트 등의 유효성분이나 활성을 상실함이 없고, 안정하며 고품질의 액상, 페이스트상 또는 고상의 건강식품이나 의약품 등을 용이하게 제조할 수 있게 된다.
이상 설명한 바와 같은 각종 조성물에, 본 발명의 폴리펩티드를 사용해서 얻어지는 환상 4당 또는 이것을 함유하는 당질을 함유시키는 방법으로서는, 그 제품이 완성될 때까지의 공정에서 함유시키하면 좋고, 예를 들면, 혼화, 혼날, 용해, 융해, 침지, 침투, 살포, 도포, 피복, 분무, 주입, 결정석출, 고화 등의 공지의 방법이 적당히 선택된다. 함유시키는 환상 4당의 양은, 보통 0.1％ 이상, 바람직하게는 1％ 이상으로 하는 것이 적합하다.
이하, 바실루스 글로비스포루스 C1l주(FERM BP-7144), 바실루스 글로비스포루스 N75주(FERM BP-7591), 및 아르드로박터 글로비포르미스 A19주(FERM BP-7590)이 생산하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 이화학적 성질의 해명, 및 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 코우드하는 DNA의 해명, 더욱이 그 DNA를 이용한 재조합형 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 조제 방법을 실험예에 근거해서 설명한다.
실험예 1 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 조제
실험예 1-1 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히미스트』 1.8％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염 0.06％ (w/v),황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v), 및 물로 된 액체배지를, 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하고, 냉각하여 바실루스 글로비스포루스 Cll주를 접종하여 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30 L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20 리터 넣고, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1％ (v/v)을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후, 배양물중의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 0.55 단위/ml이고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 약 1.8 단위/ml이었다. 이 배양물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 0.51 단위/ml (총 활성 약 9,180 단위)이고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 약 1.7 단위/ml (총 활성 약 30,400 단위)이며, 양쪽 효소 활성 모두가 주로 배양 상청중에 검출되어, 양쪽 효소 모두 배양액에 분비되는 분비형 효소인 것이 밝혀졌다.
한편, 상기한 종류의 효소 활성은 다음과 같이 해서 측정하였다. 즉, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성의 측정은, 말토트리오스를 농도 2％ (w/v)가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가해서 35℃에서 60분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응액 중의 말토오스 함량을 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC법)으로 정량 함으로써 실시하였다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성 1 단위는 상기한 조건하에서 1분간에 1 μ몰의 말토오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
한편, HPLC는 『Shodex KS-801』 칼럼[일본국의 昭和電工(주)제]를 사용하여 칼럼 온도 60℃, 용리액으로서 물의 유속 0.5ml/min 물의 조건에서 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』 [일본국의 Tosoh(주)제]를 이용해서 하였다.
그리고 α-이소말토실 전이 효소 활성의 측정은, 파노오스를 농도 2% (w/v)가 되도록 100mM 아세트산 완충액(pH 6.0)에 용해시켜 기질액으로 하고, 그 기질액 0.5ml에 효소액 0.5ml을 가해서, 35℃에서 30분간 효소반응하고, 그 반응액을 10분간 펄펄 끓여서 반응을 정지시킨 후, 그 반응 정지액 중의 글루코오스량을 글루코오스 옥시다아제법으로 정량함으로써 실시하였다. α-이소말토실 전이 효소의 활성 1 단위는, 상기한 조건하에서 1분간에 1 μ몰의 글루코오스를 생성하는 효소량으로 정의하였다.
실험예 1-2 부분 정제 효소 표품의 조제
실험예 1-1의 방법으로 얻은 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간) 해서 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.5)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 416ml을 얻었다. 이 조(粗)효소액은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 약 8,440 단위, α-이소말토실 전이 효소 활성을 약 28,000 단위 함유하고 있었다.
이 조(粗)효소액을 『Sepabeads FP-DA13』 겔 [일본국의 三菱학(주)제]을 이용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성성분, α-이소말토실 전이 효소 활성성분은 모두 『Sepabeads FP-DA13』 겔에는 흡착하지 않고, 양쪽 효소 활성은 비흡착 획분에서 검출되었다. 이 비흡착 획분을 회수하고, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔 [Amersham Pahrmacia Biotechnology(주)제]를 사용한 어피니티 크로마토그래피 (겔의 양 500ml)에 사용하였다. 효소 활성 성분은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도저하하는 리니어 그래디언트, 이것에 계속하여 말토테트라오스 OmM로부터 100mM로 농도상승하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실 전이 효소 활성성분과 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성성분은 분리해서 용출하고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 황산 암모늄 리니어 그래디언트 농도가 약 0.3M 부근인 획분에서 검출되고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트 농도가 약 30mM 부근인 획분에서 검출되었다. 따라서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성획분과 α-이소말토실 전이 효소 활성획분을 개별로 회수하고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품, α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품으로서 각각 회수하고, 이들 효소표품을 따로따로 정제하였다.
실험예 1-3 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 정제
실험예 1-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『ButytlToyopearl 650M』 겔 [일본국의 Tosoh(주)제]을 이용한 소수 크로마토그래피 (겔의 양 350ml)에 사용하였다. 이 효소 활성성분은, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 O M로 농도저하하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소 활성성분이 용출하여, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 회수하였다. 다시, 이 회수 획분을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 이용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 효소 표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 비활성(단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 9,180 0.14 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 8,440 0.60 91.9
이온교환 칼럼 용출액 6,620 1.08 72.1
어피니티 칼럼 용출액 4,130 8.83 45.0
소수 칼럼 용출액 3,310 11.0 36.1
어피니티 칼럼 용출액 2,000 13.4 21.8
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 폴리펩티드이었다.
실험예 1-4 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 정제
실험예 1-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔[일본국의 Tosoh(주)제]을 사용한 소수 크로마토그래피 (겔의 양 350ml)에 사용하였다. 이 효소 활성성분은, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 O M로 농도감소하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 효소 표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 2에 나타낸다.
[표 2]
공 정 α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 비활성(단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 30,400 0.45 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 28,000 1.98 92.1
이온교환 칼럼 용출액 21,800 3.56 71.7
어피니티 칼럼 용출액 13,700 21.9 45.1
소수 칼럼 용출액 10,300 23.4 33.9
어피니티 칼럼 용출액 5,510 29.6 18.1
정제한 α-이소말토실 전이 효소 활성 가진 효소표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 그 순도를 검정한 결과, 그 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 폴리펩티드이었다.
실험예 2 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 조제
실험예 2-1 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염 0.06％ (w/v), 황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v), 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 N75주를 접종하여 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣어서 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1％ (v／v)을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 8.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후, 배양물 중의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 0.34 단위/ml이고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 약 1.1 단위/ml이었다.
이 배양물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 0.33 단위/ml (총 활성 약 5,940 단위)이고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 약 1.1 단위/ml (총 활성 약 19,800 단위)이며, 양쪽 효소 활성 모두가 주로 배양 상청 중에서 검출되어, 양쪽 효소 모두 배양액에 분비되는 분비형 효소인 것이 밝혀졌다.
실험예 2-2 부분 정제 효소 표품의 조제
실험예 2-1의 방법으로 얻은 배양 상청 약 18L을 80％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,000rpm, 30분간) 해서 회수하여 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.3)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 450ml을 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 약 4,710 단위, α-이소말토실 전이 효소 활성을 약 15,700 단위 함유하고 있었다. 이 조효소액을 『Sepabeads FP-DA』 겔 [일본국의 三菱학(주)제]을 사용한 이온 교환 크로마토그래피에 사용하였다. α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성성분은 『Sepabeads FP-DA13』 겔에는 흡착하고, α-이소말토실 전이 효소 활성성분은 『Sepabeads FP-DA13』 겔에는 흡착하지 않고 비흡착 획분에서 검출되었다. 계속해서, NaCl 농도 OM로부터 1M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성성분은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.25M 부근에서 용출하였다. 따라서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성획분과 α-이소말토실 전이 효소 활성획분을 개별로 회수하여, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품과 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품으로서 각각 회수함으로써 이들 효소표품을 따로따로 정제하였다.
실험예 2-3 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 정제
실험예 2-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품을 1M 황산 암모늄을 함유한 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔 [Amersham Pharmacia Biotechnology(주)제]을 사용한 어피니티 크로마토그래피 (겔의 양 500ml)에 사용하였다. 효소활성 성분은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도저하하는 리니어 그래디언트, 이것에 계속하여 말토테트라오스 OmM로부터 100mM로 농도상승하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 말토테트라오스의 리니어 그래디언트 농도가 약 30mM 부근의 획분에서 검출되었다. 여기서 이 효소활성 획분을 회수하였다. 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Butyl-Toyopeal-650M』 겔 [일본국의 Tosoh(주)제]을 사용한 소수 크로마토그래피 (겔의 양 350ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Butyl-Toyopeal-650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 흡착한 효소가 용출하고, 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집하여 회수하였다. 다시, 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 어피니티 크로마토그래피를 사용해서 정제하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 효소 표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 3에 나타낸다.
[표 3]
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 비활성(단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 5,940 0.10 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 4,710 0.19 79.3
이온교환 칼럼 용출액 3,200 2.12 53.9
어피니티 칼럼 용출액 2,210 7.55 37.2
소수 칼럼 용출액 1,720 10.1 29.0
어피니티 칼럼 용출액 1,320 12.5 22.2
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 효소 표품의 순도를 검정한 결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 폴리펩티드이었다.
실험예 2-4 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 정제
실험예 2-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔 [Amersham Pharmacia Biotechnology(주)제]을 사용한 어피니티 크로마토그래피 (겔의 양 500ml)에 사용하였다. 효소 활성계분은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도저하하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근의 획분에서 이 효소 활성이 검출되었다. 거기에서 이 효소 활성획분을 회수하였다. 이 회수액을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔 [일본국의 Tosoh(주)제]을 사용한 소수 크로마토그래피(겔의 양 350ml)에 사용하였다. 이 효소 활성성분은, 『Butyl-Toyopeal 650M』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도감소하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 이 효소 활성을 나타내는 획분을 수집해서 회수하였다. 이 회수액을 10mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Super Q-Toyopearl 650C』 겔 [일본국의 Tosoh(주)제]을 사용한 이온 교환 칼럼 크로마토그래피(겔의 양 380ml)에 사용하였다. 이 효소는, 『Super Q-Toyopearl 650C』 겔에 흡착하지 않고, 비흡착 획분에서 용출하며, 얻어진 용출획분을 회수하여 정제 효소 표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 효소 표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 4에 나타낸다.
[표 4]
공 정 α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 비활성(단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 19,000 0.33 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.64 82.6
이온교환 칼럼 용출액 12,400 3.56 65.3
어피니티 칼럼 용출액 8,320 11.7 43.8
소수 칼럼 용출액 4,830 15.2 25.4
이온교환 칼럼 용출액 3,850 22.6 20.3
정제한 α-이소말토실 전이 효소 활성 가지는 효소 표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 그 순도를 검정한 결과, 그 단백밴드는 단일이어서 순도가 높은 폴리펩티드이었다.
실험예 3 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 조제
실험예 3-1 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 4.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.8％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염 0.06％ (w/v), 황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v), 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 글로비포르미스 A19주를 접종하여 27℃, 230rpm에서 48시간 회전 진탕 배양한 것을 종배양으로 하였다. 용량 30L의 퍼멘터에 종배양의 경우와 동일 조성의 배지를 약 20L 넣어서, 가열 멸균, 냉각해서 온도 27℃로 한 후, 종배양액 1％ (v/v)을 접종하고, 온도 27℃, pH 6.0 내지 9.0으로 유지하면서 48시간 통기 교반 배양하였다. 배양후, 배양물 중의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 1.1 단위/ml이고, α-이소말토실 전이효소 활성은 약 1.7 단위/ml이었다.
이 배양물을 원심분리(10,000rpm, 30분간)해서 회수한 상청 약 18L의 효소 활성을 측정한 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 약 1.06 단위/ml (총 활성 약 19,100 단위)이고, α-이소말토실 전이 효소 활성은 약 1.6 단위/ml (총 활성 약 28,800 단위)이며, 양쪽 효소 활성 모두가 주로 배양 상청중에서 검출되어, 양쪽 효소 모두 배양액에 분비되어지는 분비형 효소인 것이 밝혀졌다.
한편, 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성측정은, 기질을 위한 완충액으로서 100mM 글라이신―NaOH 완충액(pH 8.4)을 사용한 이외는 실험예 1에 기재한 방법과 마찬가지로 하였다.
실험예 3-2 부분 정제효소 표품의 조제
실험예 3-1의 방법으로 얻은 배양 상청 약 18L을 60％ 포화 황산 암모늄액으로 염석해서 4℃, 24시간 방치한 후, 그 염석 침전물을 원심분리(10,00O rpm, 30분간)해서 회수하여 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.0)에 용해후, 이 완충액에 대하여 투석해서 조(粗)효소액 약 850ml를 얻었다. 이 조효소액은, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 약 8,210 단위, α-이소말토실 전이 효소 활성을 약 15,700 단위 함유하고 있었다. 이 조효소액을 『DEAE-Toyopearl 650S』 겔 [일본국의 Tosoh(주)제]을 사용한 이온 교환 크로마토그래피 (겔의 양 380ml)에 사용하였다. 양쪽 효소 활성은, 『DEAE-Toyopearl 650S』 겔에는 흡착하고, NaCl 농도 OM로부터 1M의 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성성분은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.2M 부근에서 용출하고, α-이소말토실 전이 효소 활성성분은 NaCl의 리니어 그래디언트에서 그 농도가 약 0.3M 부근에서 용출하였다. 거기에서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성획분과 α- 이소말토실 전이효소 활성 획분을 개별로 회수하고, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품, α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품으로서 각각 회수하여 이들 효소표품을 따로따로 정제하였다.
실험예 3-3 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 정제
실험예 3-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 부분 정제 효소표품을 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 이 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔 [Amersham Pharmacia Biotechnology(주)제]을 사용한 어피니티 크로마토그래피(겔의 양 500ml)에 사용하였다. 효소 활성성분은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도저하하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 황산 암모늄의 리니어 그래디언트 농도가 약 0.2M 부근인 획분에서 검출되었다. 거기에서 이 효소 활성획분을 회수하고, 정제 효소표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 효소표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 5에 나타낸다.
[표 5]
공 정 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 비활성(단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 19,100 0.11 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 8,210 0.48 43.0
이온교환 칼럼 용출액 6,890 4.18 36.1
어피니티 칼럼 용출액 5,220 35.1 27.3
정제한 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 효소표품의 순도를 검정한결과, 단백 밴드는 단일이어서 순도가 높은 폴리펩티드이었다.
실험예 3-4 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 부분 정제
실험예 3-2의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 부분 정제효소 표품을, 1M 황산 암모늄을 함유하는 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 대하여 투석하고, 그 투석액을 원심분리해서 불용물을 제거하고, 『Sephacryl HR S-200』 겔[Amersham Pharmacia Biotechnology(주)제]을 사용한 어피니티 크로마토그래피 (겔의 양 500ml)에 사용하였다. 효소 활성성분은, 『Sephacryl HR S-200』 겔에 흡착하고, 황산 암모늄 1M로부터 OM로 농도저하하는 리니어 그래디언트에서 용출시킨 결과, 황산 암모늄 농도 약 OM 부근의 획분에서 이 효소 활성이 검출되었다. 거기에서, 이 효소 활성획분을 회수하여 부분 정제 효소표품으로 하였다. 이 정제의 각 스텝에 있어서의 α-이소말토실 전이 효소 활성을 가진 효소표품의 효소 활성량, 비활성, 수율을 표 6에 나타낸다.
[표 6]
공 정 α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 활성량 (단위) α-이소말토실 전이효소 폴리펩티드 비활성 (단위/mg 단백) 수 율 (%)
배양 상청 28,800 0.18 100
황산 암모늄 염석후의 투석액 15,700 0.97 54.5
이온교환 칼럼 용출액 7,130 4.01 24.8
어피니티 칼럼 용출액 1,800 11.9 6.3
부분 정제한 α-이소말토실 전이 효소 활성 가지는 효소표품을 7.5％ (w/v) 농도 폴리아크릴아미드를 함유하는 겔 전기영동에 의해 그 순도를 검정한 결과, 메인의 단백 밴드 이외에 3종의 마이너한 단백 밴드가 나타났다.
실험예 4-1 각종 당질에의 작용
각종 당질을 사용하여 본 발명의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드의 기질이 될 수 있을 것인가 아닌가의 시험을 하였다. 말토오스, 말토트리오스, 말토테토라오스, 말토펜타오스, 말토헥사오스 , 말토헵타오스, 이소말토오스, 이소말토트리오스, 파노오스, 이소파노오스, 트레할로오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로스, 셀로비오스, 겐티비오스, 말티톨, 말토트리이톨, 락토오스, 수크로오스, 에를로오스, 세라기노오스, 말토실글루코시드, 이소말토실글루코시드를 함유하는 용액을 조제하였다.
이들 용액에, 실험예 1-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품, 또는 실험예 2-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품, 실험예 3-3의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품을 기질 고형물 1그램당 각각 2 단위씩 첨가하고, 기질농도를 2％ (w/v)가 되도록 조정하여, 이것을 30℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 효소의 경우, pH 8.4)에서 24시간 작용시켰다. 효소반응 전후의 반응액 중의 당질을 조사하기 위해서, 실리카 겔 박층 크로마토그래피 (이하, 간단히 「TLC」라고 한다.)를 하였다. 전개 용매로서 n-부탄올, 피리딘, 물 혼합액 (용량비 6:4:1), 박층 플레이트로서 『키젤 겔』 (알루미늄 플레이트, 20×20cm, 메르크사제)을 사용하여 2회 전개한 후, 황산-메탄올법으로 당질을 발색하여 검출하고, 각각의 당질에대한 효소작용의 유무를 확인하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다.
[표 7]
기 질 효 소 작 용
C11 효소 N75 효소 A19 효소
말토오스 + + +
말토트리오스 ++ ++ ++
말토테트라오스 +++ +++ +++
말토펜타오스 +++ +++ +++
말토헥사오스 +++ +++ +++
말토헵타오스 +++ +++ +++
이소말토오스 - - -
이소말토트리오스 - - -
파노오스 - - -
이소파노오스 ++ ++ ++
트레할로오스 - - -
코지비오스 + + +
니게로오스 + + +
네오트레할로오스 + + +
셀로비오스 - - -
겐티비오스 - - -
말티톨 - - -
말토트리이톨 + + +
락토오스 - - -
수크로오스 - - -
에를로오스 + + +
세라기노오스 - - -
말토실글루코시드 ++ ++ ++
이소말토실글루코시드 - - -
주) 효소반응 전후에서,
-는 변화없음을 나타내고,
+는 기질의 스폿이 약간 감소하고, 다른 생성물이 확인되는 것을 나타내며,
++는 기질의 스폿이 상당히 감소하고, 다른 생성물이 확인되는 것을 나타내고,
+++는 기질의 스폿이 대부분 소실하고, 다른 생성물이 확인되는 것을 나타낸다.
표 7의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는, 시험한 각종 당질의 중에서 글루코오스 중합도가 3 이상이고 비환원 말단에 말토오스 구조를 가진 당질에 잘 작용하는 것이 밝혀졌다. 또한, 글루코오스 중합도가 2인 당질에서는, 말토오스, 코지비오스, 니게로오스, 네오트레할로스, 말토트리이톨, 에를로오스에도 약간 작용하는 것이 밝혀졌다.
실험예 4-2 말토올리고당으로의 생성물
최종 고형물 농도 1％의 말토오스, 말토트리오스, 말토테트라오스 또는 말토펜타오스 수용액에, 실험예 1-3의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를, 고형물 그램당 2 단위 (말토오스 및 말토트리오스 수용액의 경우), 0.2 단위 (말토테트라오스 수용액의 경우), 0.1 단위 (말토펜타오스 수용액의 경우) 가하고, 35℃, pH 6.0에서 8시간 작용시켜, 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하였다. 그 효소 반응액의 당조성을 HPLC법을 이용해서 측정하였다. HPLC는, 『YMC Pack ODS-AQ303』 칼럼 [(주)와이 에무 시제]를 사용하고, 칼럼 온도 40℃, 용리액으로서의 물의 유속 0.5ml/min의 조건으로 실시하고, 검출은 시차(示差) 굴절계 『RI-8012』 [일본국의 Tosoh(주)제]를 사용해서 하였다. 그 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
반응에서 생성한 당질의 종류 기 질
기질말토오스 기질말토트리오스 기질말토테트라오스 기질말토펜타오스
글루코오스 8.5 0.1 0.0 0.0
말토오스 78.0 17.9 0.3 0.0
말토트리오스 0.8 45.3 22.7 1.9
말토테트라오스 0.0 1.8 35.1 19.2
말토펜타오스 0.0 0.0 3.5 34.4
말토헥사오스 0.0 0.0 0.0 4.6
이소말토오스 0.5 0.0 0.0 0.0
글루코실말토오스 8.2 1.2 0.0 0.0
글루코실말토트리오스 2.4 31.5 6.8 0.0
X 0.0 2.1 30.0 11.4
Y 0.0 0.0 1.4 26.8
Z 0.0 0.0 0.0 1.7
기타 0.6 0.1 0.2 0.0
표 중에서,
글루코실 말토오스는 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-0-α-글루코실말토오스, 파노오스),
글루코실말토트리오스는 α-이소말토실말토오스(별명, 63-0-α-글루코실 말토트리오스),
X는 이 실험예에서 구조를 밝힌 α-이소말토실 말토트리오스(별명, 64-0-α-글루코실말토테트라오스),
Y는 이 실험예에서 구조를 밝힌 α-이소말토실 말토테트라오스(별명, 65-0-α-글루코실 말토펜타오스),
Z는 미확인의 당질이다.
표 8의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성을 가진 폴리펩티드를 작용시킨 결과, 기질로서의 말토오스로부터는 주로 글루코오스와 α-이소말토실글루코오스(별명, 62-0―α-글루코실말토오스)가 생성하고, 기질로서의 말토트리오스로부터는 주로 말토오스와 α-이소말토실말토오스(별명, 63-0―α-글루코실말토트리오스)가 생성하며, 그 외, 소량이지만 글루코오스, 말토테트라오스, α-이소말토실글루코오스(별명, 62-0-α-글루코실말토오스), 및 생성물 X가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질로서의 말토테트라오스로부터는 주로 말토트리오스와 생성물 X가 생성하고, 그 외, 소량이지만 말토오스, 말토펜타오스, α-이소말토실말토오스(별명, 63-0-α-글루코실말토오스) 및 생성물 Y가 생성하는 것이 밝혀졌다.
기질로서의 말토펜타오스로부터는 주로 말토테트라오스와 생성물 Y가 생성하고, 그 외, 소량이지만 말토트리오스, 말토헥사오스, 생성물 X 및 생성물 Z가 생성하는 것이 밝혀졌다.
이어서, 기질로서의 말토테트라오스로부터의 주생성물인 생성물 X와, 기질로서의 말토펜타오스로부터의 주생성물인 생성물 Y의 정제와 단리를 하였다. 분취용 HPLC 칼럼 『YMC-Pack ODS-A R355-15S-1512A』 [(주) 와이 에무 시제]을 사용해서 생성물 X, Y를 정제하여 단리함으로써, 상기 말토테트라오스로부터의 반응물로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 X 표품을 고형물 수율 약 8.3％로서, 또한 상기 말토펜타오스로부터의 반응물로부터 순도 99.9％ 이상의 생성물 Y를 고형물 수율 약 11.5％로서 단리하였다.
이들 생성물 X 및 생성물 Y에 대해서, 통상적인 방법에 따라서 메틸화 분석과 NMR 분석을 하였다. 메틸화 분석 결과는 표 9에 정리하였다. NMR 분석 결과에 대해서는, 생성물 X와 생성물 Y의1H-NMR 스펙트럼을 도 1 및 도 2에 각각 나타내었다.
또한, 생성물 X와 생성물 Y의13C-NMR 스펙트럼을 도 3 및 도 4에 각각 나타내고, 이들의 귀속(歸屬)을 표 10에 정리하였다.
[표 9]
분석 메틸화물의 종류 조성비
생성물 X 생성물 Y
2,3,4-트리메틸화물 1.00 1.00
2,3,6-트리메틸화물 3.05 3.98
2,3,4,6-테트라메틸화물 0.82 0.85
이들 결과로부터 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드에 의한 말토테트라오스로부터의 생성물 X는, 말토테트라오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코오스기가 α-결합한 5당이고, 구조식 1로 나타내어지는 α-이소말토실 말토트리오스(별명, 64-O-α-글루코실말토테트라오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 1
α-D-Glc p-(1→6)-α-D-Glc p-(1→4)-α-D-Glc p-(1→4)-α-D-Glc p-(1→4)-D-Glcp
그리고 말토펜타오스로부터의 생성물 Y는, 말토펜타오스의 비환원 말단 글루코오스의 6 위치 히드록실기에 글루코실기가 α 결합한 6당이고, 구조식 2로 나타내어지는 α-이소말토실말토테트라오스(별명, 65-O-α-글루코실말토펜타오스)인 것이 밝혀졌다.
구조식 2
α－D－Glc p-(1→6)－α－D－Glc p-(1→4）－α－D－Glc p－(1→4）－α－D－Glc p-(1→4)－α－D－Glc p-(1→4)－D－Glc p
[표 10]
글루코오스 번호 탄소 번호 NMR 화학 시프트값 (ppm)
생성물 X 생성물 Y
a 1a 100.8 100.8
2a 74.2 74.2
3a 75.8 75.7
4a 72.2 72.2
5a 74.5 74.5
6a 63.2 63.1
b 1b 102.6 102.6
2b 74.2 74.2
3b 75.8 75.7
4b 72.1 72.1
5b 74.0 74.0
6b 68.6 68.6
c 1c 102.3 102.3
2c 74.2 74.2
3c 76.0 76.0
4c 79.6 79.5
5c 73.9 73.9
6c 63.2 63.1
d 1d 102.2 102.3
2d 74.0(α), 74.4(β) 74.2
3d 76.0 76.0
4d 79.8 79.5
5d 73.9 73.9
6d 63.2 63.1
e 1e 94.6(α), 98.5(β) 102.1
2e 74.2(α), 76.7(β) 74.0(α), 74.4(β)
3e 75.9(α), 78.9(β) 76.0
4e 79.6(α), 79.4(β) 79.8
5e 72.6(α), 77.2(β) 73.9
6e 63.4(α), 63.4(β) 63.1
f 1f 94.6(α), 98.5(β)
2f 74.2(α), 76.7(β)
3f 76.0(α), 78.9(β)
4f 79.6(α), 79.5(β)
5f 72.6(α), 77.2(β)
6f 63.3(α), 63.3(β)
이상으로부터, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 말토올리고당에 대한 작용은 아래와 같이 판단되었다.
1) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는, 기질로서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 작용하여, 그 비환원 말단의 글루코실 잔기를 다른 분자의 비환원 말단의 글루코실 잔기의 6 위치에 전이하는 작용을 가진 분자간의 6-글루코실 전이를 촉매하고, 비환원 말단에 6-O-α-글루코실기를 가진, 글루코오스 중합도가 1증가한 α-이소말토실글루코 당질 (별명, 6-O-α-글루코실 말토올리고당)과, 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 생성한다.
2) α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는, 4-글루코실 전이도 약간 촉매하여, 말토올리고당으로부터, 글루코오스 중합도가 1 증가한 말토올리고당과 글루코오스 중합도가 1 감소한 말토올리고당을 약간 생성한다.
실험예 4-3 환원력 생성시험
α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드가, 환원력 생성능력을 가지는가 아닌가를 조사하는 것을 목적으로 하여 아래의 시험을 하였다. 즉, 최종 농도 1％의 말토테트라오스 수용액에, 실험예 1-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품, 또는 실험예 2-3의 방법으로 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품, 실험예 3-3의 방법으로 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 정제 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 폴리펩티드 표품을, 기질 고형물 1그램당 0.25 단위 가하고, 35℃, pH 6.0 (아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 효소의 경우, pH 8.4 )에서 작용시키고, 그 반응액의 일부를 경시적으로 채취하여 100℃에서 10분간 유지해서 반응을 정지하고, 반응액의 환원력을 측정하였다. 즉, 그 효소반응 전후의 용액의 환원당의 량을 소모기-넬슨법으로 측정하고, 또한, 동시에 그 효소반응 전후의 용액의 전체 당량(糖量)을 앤트론 황산법으로 측정하고, 환원력 생성율(%)은 아래의 계산식을 이용해서 산출하였다.
계산식:
그 결과를 표 11에 나타낸다.
[표 11]
반응 시간(시간) 환원력 생성율 (%)
C11주 효소 N75주 효소 A19주 효소
0 0.0 0.0 0.0
1 0.1 0.1 0.0
2 0.0 0.0 0.1
4 0.1 0.0 0.0
8 0.0 0.1 0.1
표 11의 결과로부터 명백한 바와 같이, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는, 말토테트라오스를 기질로서 작용시키면 반응물의 환원력은 증가하지 않음을 알 수 있고, 이 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는 가수분해 작용을 나타내지 않거나 혹은 검출할 수 없을 정도로 약간인 것이 밝혀졌다.
실험예 4-4 분자량
실험예 1-3의 방법으로 정제해서 얻은 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 실험예 2-3의 방법으로 정제해서 얻은 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 또는, 실험예 3-3의 방법으로 정제해서 얻은 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 [겔 농도 7.5％ (w/v)]에 사용하고, 동시에 영동한 분자량 마아커 [일본 바이오 랏도 라보라토리즈(주)제)]와 비교해서 이 효소 폴리펩티드의 분자량을 측정하였다. Cll주 유래의 이 폴리펩티드의 분자량은 약 137,000±20,000 달톤이고, N75주 유래의 이 폴리펩티드의 분자량은 약 136,000±20,000 달톤이며, A19주 유래의 이 폴리펩티드의 분자량은 약 94,000±20,000 달톤이었다.
실험예 4-5 등전점
실험예 1-3의 방법으로 정제해서 얻은 Cll주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 실험예 2-3의 방법으로 정제해서 얻은 N75주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 또는 실험예 3-3의 방법으로 정제해서 얻은 A19주 유래 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를, 2％(w/v) 앰폴라인 [Amersham Pharmacia Biotechnology(주)제] 함유 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 제공하고, 전기 영동후의 단백 밴드 및 겔의 pH를 측정해서 이 효소 폴리펩티드의 등전점을 구하였다.
그 결과, Cll주 유래의 이 폴리펩티드의 등전점은 pl 약 5.2±0.5이고, N75주 유래의 이 폴리펩티드의 등전점은 pl 약 7.3±0.5이며, A19주 유래의 이 폴리펩티드의 등전점은 pl 약 4.3±0.5이었다.
실험예 4-6 작용 온도 및 pH
α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성에 미치는 온도와 pH의 영향에 대해서, 각종 온도, pH 조건하에서 실험예 1-1에 나온 α-이소말토실글루코 당질생성 효소의 활성 측정법에 준해서 조사하였다. 온도의 영향에 대해서는 Ca2+비존재하와 1mM 존재하에서 측정하였다.
이들 결과를 도 5 [온도의 영향 (Cll주 유래 폴리펩티드)], 도 6 [온도의 영향 (N75주 유래의 폴리펩티드)], 도 7 [온도의 영향 (A19주 유래의 폴리펩티드)], 도 8 [pH의 영향 (Cll주 유래 폴리펩티드)], 도 9 [pH의 영향 (N75주 유래의 폴리펩티드)], 도 10 [pH의 영향 (A19주 유래의 폴리펩티드)]에 나타내었다.
그 결과, Cll주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 효소표품의 최적 온도는, pH 6.0, 60분간 반응에서 약 45℃ (Ca2+비존재)또는 약 50℃ (1mM Ca2+존재)이고, 그 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이고, N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 최적 온도는, pH 6.0, 60분간 반응에서, 약 50℃ (Ca2+비존재) 또는 약 55℃ (1mM Ca2+존재)이며, 그 최적 pH는, 35℃, 60분간 반응에서 약 6.0이고, A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 최적 온도는, pH 8.4, 60분간 반응에서 약 60℃ (Ca2+비존재) 또는 약 65℃ (1mM Ca2+존재)이고, 그 최적 pH는35℃, 60분간 반응에서 약 8.4이었다.
실험예 4-7 안정성
α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 온도 안정성은, 이 폴리펩티드 함유 용액 [20mM 아세트산 완충액, pH 6.0 (A19주 유래의 폴리펩티드의 경우, 20mM 글라이신―NaOH 완충액, pH 8.0)]을 Ca2+비존재하 또는 1mM Ca2+존재하에서 각 온도에서 60분간 유지하고, 물로 냉각한 후, 잔존하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 측정함으로써 구하였다. 또한, pH 안정성은, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 각 pH의 50mM 완충액 중에서 4℃, 24시간 유지한 후, pH를 6.0 (A19주 유래의 폴리펩티드의 경우, pH 8.0)으로 조정하고, 잔존하는 효소 활성을 측정함으로써 구하였다.
이들의 결과를 도 11 [온도 안정성 (Cl1주 유래의 폴리펩티드)], 도 12 [온도 안정성 (N75주 유래의 폴리펩티드], 도 13 [온도 안정성 (A19주 유래의 폴리펩티드)], 도 14 [pH 안정성 (Cll주 유래 폴리펩티드)], 도 15 [pH 안정성 (N75주 유래의 폴리펩티드)], 도 16 [pH 안정성 (A19주 유래의 폴리펩티드)]에 나타내었다.
Cl1주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 온도 안정성은 약 40℃까지 (Ca2+비존재) 또는 약 45℃까지 (1mM Ca2+존재)이고, 이 폴리펩티드의 pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이며, N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 온도 안정성은 약 45℃까지 (Ca2+비존재) 또는 약 50℃까지 (1mM Ca2+존재)이고, 이 폴리펩티드의 pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이며, A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 온도 안정성은 약 55℃까지 (Ca2+비존재) 또는 약 60℃까지 (1mM Ca2+존재)이고, 이 폴리펩티드의 pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
실험예 5 부분 아미노산 서열
실험예 5-1 N 말단 아미노산 서열
실험예 1-3의 방법으로 정제해서 얻은 Cll주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 실험예 2-3의 방법으로 정제해서 얻은 N75주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드, 또는 실험예 3-3의 방법으로 정제해서 얻은 A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드에 대해서, 그 N 말단 아미노산 서열을 프로틴 시퀀서 『모델 473A』 (어플라이드 바이오시스템즈사제)를 사용해서 분석한 결과, Cll주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는 서열표에 있어서의 서열 번호 7에 나온 아미노산 서열을 가지고, N75 주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는 서열표에 있어서의 서열 번호 19에 나온 아미노산 서열을 가지며, A19주 유래의 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드는 서열표에 있어서의 서열 번호 26에 나온 아미노산 서열을 가진 것이 밝혀졌다.
실험예 5-2 Cll주 유래의 폴리펩티드의 내부 아미노산 서열
실험예 1-3의 방법으로 정제해서 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 얻어진 투석액을 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 10㎍의 트립신 [일본국의 和光純藥(주) 판매]을 가하고, 30℃, 22시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 즉, 『마이크로본다팩 C18 칼럼』 [지름 2.1mM × 길이 150mM, 워터즈(주)제]을 사용하고, 실온하, 유속 0.9ml/분의 조건으로 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세트니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-40％ 아세트니트릴 용액의 120분간 이행하는 리니어 그래디언트 조건하에서 펩티드를 칼럼 분획하였다. 칼럼으로부터 용출해 나오는 펩티드를 파장 210 nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 잘 분리한 10 펩티드 [P8 (유지시간 약 8분), P20 (유지시간 약 20분), P56 (유지시간 약 56분), P60 (유지시간 약 60분), P62 (유지시간 약 62분), P64 (유지시간 약 64분), P75 (유지시간 약 75분), P82 (유지시간 약 82분), P88 (유지시간 약 88분), P99 (유지시간 약 99분)]을 분취하고, 각각의 펩티드 함유 획분을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해한 후, 각각의 펩티드를 프로틴 시퀀서에 제공하여 각각 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 8 내지 17에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다.
실험예 5-3 N75주 유래 폴리펩티드의 내부 아미노산 서열
실험예 2-3의 방법으로 정제해서 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소활성을 가진 폴리펩티드의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 얻어진 투석액을 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이 시료액(1ml)에 20㎍의 리질엔도펩티다아제 [일본국의 和光純藥(주) 판매]를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 즉, 『마이크로본타스페아 C18 칼럼』 [지름 3.9mM × 길이 150mM, 워터즈(주)제]을 사용하고, 실온하에서 유속 0.9ml/분의 조건으로, 0.1％ 트리플루오로아세트산-8％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-36％ 아세토니릴 용액의 120분간 이행하는 리니어 그래디언트 조건하에서 펩티드를 칼럼 분획하였다. 칼럼으로부터 용출해 나오는 펩티드를 파장 210 nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 잘 분리한 5 펩티드 [PN47 (유지시간 약 47분), PN59 (유지시간 약 59분), PN67 (유지시간 약 67분), PN87 (유지시간 약 87분), PN89 (유지시간 약 89분)]을 분취하고, 각각의 펩티드 함유 획분을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해한 후, 각각의 펩티드를 프로틴 시퀀서에 제공하고, 각각 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 20 내지 24에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다.
실험예 5-4 A19주 유래의 폴리펩티드의 내부 아미노산 서열
실험예 3-3의 방법으로 정제해서 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 일부를 10mM 트리스-염산 완충액(pH 9.0)에 대하여 투석한 후, 얻어진 투석액을 이 완충액으로 약 1mg/ml의 농도가 되도록 희석하였다. 이시료액(1ml)에 20㎍의 리질엔도펩티다아제 [일본국의 和光純藥(주) 판매]를 가하고, 30℃, 24시간 반응시킴으로써 펩티드화하였다. 생성한 펩티드를 단리하기 위해서 역상 HPLC를 하였다. 즉, 『마이크로본다스페아 C18 칼럼』 [지름 2.1mM × 길이 150mM, 워터즈(주)제]을 사용하고, 실온하에서 유속 0.9ml/분의 조건으로, 0.1％ 트리플루오로아세트산-16％ 아세토니트릴 용액으로부터 0.1％ 트리플루오로아세트산-36％ 아세토니트릴 용액의 120분간 이행하는 리니어 그래디언트 조건하에서 펩티드를 칼럼 분획하였다. 칼럼으로부터 용출해 나오는 펩티드를 파장 210 nm의 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 기타의 펩티드와 잘 분리한 5 펩티드 [PA39 (유지시간 약 39분), PA81 (유지시간 약 81분), PA86 (유지시간 약 86분), PA92 (유지시간 약 92분), PNlO4 (유지시간 약 104분)]을 분취하고, 각각의 펩티드 함유 획분을 진공건조한 후, 200㎕의 0.1％ 트리플루오로아세트산-50％ 아세토니트릴 용액에 용해한 후, 각각의 펩티드를 프로틴 시퀀서에 제공하여 각각 아미노산 서열을 분석한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 27 내지 31에 나온 아미노산 서열이 얻어졌다.
실험예 6 바실루스 글로비스포루스 Cll주 유래의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 조제
실험예 6-1 염색체 DNA의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 2.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.0％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염 0.06％ (w/v), 황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v) 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 Cll주를 접종하여 27℃, 230rpm에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양물로부터 채취한 균체를 TES 완충액(pH 8.0)에 부유시키고, 리소자임을 0.05％ (w/v) 가하여 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 처리물을 -80℃에서 1시간 동결후, TSS 완충액(pH 9.0)을 가해서 60℃로 가온하고, TES 완충액/페놀 혼합액을 가하여 얼음물 중에서 냉각하면서 5분간 격렬하게 진탕한 후 원심분리에 의해 상청을 채취하였다.
이 상청에 2배 용량의 차거운 에탄올을 첨가하여 침전한 조(粗)염색체 DNA를 채취하고, SSC 완충액(pH 7.1)에 용해후, 리보누클레아제와 푸로티나아제를 각각 7.5㎍ 또는 125㎍ 가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트해서 반응시켰다. 반응물에 클로로포름/이소아밀 알코올 혼합액을 첨가해서 염색체 DNA를 추출하고, 차거운 에탄올을 가하여, 생성한 염색체 DNA를 함유하는 침전을 채취하였다. 이렇게 하여 얻은 정제 염색체 DNA를 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하고, 용액을 -80℃에서 동결하였다.
실험예 6-2 형질 전환체 BGC2의 조제
실험예 6-1에서 조제한 정제 염색체 DNA 용액을 1ml 취하고, 여기에 제한 효소 Sau 3Al을 약 35 단위 가하고, 37℃에서 20분간 반응시켜 염색체 DNA를 부분 분해한 후, 수크로오스 밀도 기울기 초원심법에 의해 약 2,000 내지 6,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 채취하였다. 별도로, 플라스미드 벡터 『Bluescript II SK(+)』 [스트라타진·클로닝·시스템(주)제]를 통상적인 방법에 의해 제한 효소 Bam Hl을작용시켜 완전히 절단한 후, 그 절단된 플라스미드 벡터 0.5㎍과 앞서 얻은 DNA 단편 약 5㎍을 『DNA 라이게이션 키트』 [일본국의 寶酒造(주)제]를 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서 조작해서 연결하여 얻어진 재조합 DNA를 사용하여, 통상적인 컴피턴트 셀법에 의해 컴피턴트 셀 『Epicurian Coli XL2-Blue』 [스트라타진·클로닝·시스템(주)제]를 100㎕를 형질전환해서 유전자 라이브러리를 작제하였다. 얻어진 유전자 라이브러리로서의 형질 전환체를 통상적인 방법에 의해 조제한, 트립톤 10g/L, 효모 엑기스 5g/L, 염화 나트륨 5g/L, 앰피실린 나트륨염 100mg/L, 및 5-브로모―4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50mg/L을 함유하는 한천 평판배지(pH 7.0)에 식균(植菌)하고, 37℃에서 24시간 배양후, 배지위에 형성된 백색의 콜로니 약 5,000개를 Amersham제 나일론 막 『Hybond-N+』위에 고정하였다. 별도로, 실험예 5-2의 방법으로 밝혀진, 서열표에 있어서의 서열 번호 16에 나온 아미노산 서열에 있어서의 제4번째로부터 제11번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'-GGNTTYATGAAYTTYAGRTGGGA-3′로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 통상적인 방법에 따라 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리누클레오티드키나아제를 사용해서 동위체 표지(標識)하여 프로브 1로서의 합성 DNA를 얻었다. 앞서 얻은 나일론 막 위에 고정한 콜로니 중에서 프로브 1과 현저한 회합을 나타내는 콜로니에 대하여, 통상적인 콜로니 하이브리다이제이션법을 적응해서 2종류의 형질 전환체를 선택하였다. 통상적인 방법에 의해, 이들 2종류의 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 채취하는 한편, 서열표에 있어서의 서열 번호 17에 나온 아미노산 서열에 있어서의제4번째로부터 제11번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3′로 나타내어지는 염기서열의 프로브 2를 화학합성하고, 마찬가지로 동위체 표지후, 통상적인 서어든 하이브리다이즈를 적응하여 현저한 회합을 나타낸 재조합 DNA를 선택하고, 이 형질 전환체를 『BGC2』로 명명하였다.
실험예 6-3 DNA 서열의 해명
실시예 6-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGC2』를 통상적인 방법에 따라, 앰피실린 나트륨을 100㎍/ml 함유하는 L-브로스 배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 배양물로부터 균체를 채취하고, 통상의 알칼리―SDS법에 의해 재조합 DNA를 추출하였다. 이 재조합 DNA의 염기서열을, 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는 바실루스 글로비스포루스 Cll주에서 유래하는, 체인 길이 5294 염기쌍의, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 나온 염기서열의 DNA를 함유하고 있었다.
도 17에 나온 바와 같이, 이 재조합 DNA에 있어서, 이 DNA는 제한 효소 Xba 1에 의한 인식 부위의 하류에 연결되어 있었다.
한편, 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 그 서열 번호 18에 병기한 그대로이며, 이 아미노산 서열과 실험예 5-1의 방법으로 확인된 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 아미노산 서열 및 실험예 5-2의 방법으로 밝혀진 중간부 부분 아미노산 서열인, 서열표에 있어서의 서열 번호 7 및 서열 번호 8 내지 17에 나온 아미노산 서열과 비교한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 7에 나온 아미노산 서열은, 서열 번호 18에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제36 내지 44번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
그리고 서열표에 있어서의 서열 번호 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17에 나온 아미노산 서열은, 각각 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제823 내지 832번째, 제576 내지 589번째, 제874 내지 904번째, 제1117 내지 1141번째, 제657 내지 670번째, 제367 내지 399번째, 제970 내지 993번째, 제938 내지 953번째, 제279 내지 295번째 및 제632 내지 651번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
한편, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 있어서의 제4783 내지 4785번째의 염기서열은, 번역 종지 코돈 (5'-TAA-3')을 코우드하고 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단은 그 직전의 글루탐산 (서열표에 있어서의 서열 번호 18에 있어서의 제1284번째의 아미노산)인 것이 밝혀졌다.
이들 결과는, 본 발명의 폴리펩티드가 서열표에 있어서의 서열 번호 1에 나온 아미노산 서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드는, 바실루스 글로비스포루스 Cll주에서는 서열표에 있어서의 서열 번호 4에 나온 염기서열의 DNA에 의해 코우드 되어 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제1 내지 35번째의 아미노산 서열은 이 폴리펩티드의 분비 시그널 서열이라고 추정되었다. 이들로부터, 이 폴리펩티드의 분비 전의 전구체 펩티드는, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 병기된 아미노산 서열로 되어있고, 그 아미노산 서열은, 서열표에 있어서의 서열 번호 18에 나온 염기서열에 코우드되어 있는 것이 밝혀졌다. 이렇게 하여, 그 염기서열을 확인한 재조합 DNA를 『pBGC2』로 명명하였다.
실험예 7 바실루스 글로비스포루스 N75주 유래의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 조제
실험예 7-1 염색체 DNA의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 2.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.0％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염 0.06％ (w/v), 황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v) 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 바실루스 글로비스포루스 N75주를 접종하여 27℃, 23Orpm에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의하여 배양물로부터 채취한 균체를 TES 완충액(pH 8.0)에 부유시켜 리소자임을 0.05％ (w/v) 가하고 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 처리물을 -80℃에서 1시간 동결후, TSS 완충액(pH 9.0)을 가해서 60℃로 가온하고, TES 완충액/페놀 혼합액을 가하여 얼음 물 속에서 냉각하면서 5분간 격렬하게 진탕한 후, 원심분리에 의해 상청을 채취하였다.
이 상청에 2배 용량의 차거운 에탄올을 첨가하고, 침전한 조염색체 DNA를 채취하여 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해후, 리보누클레아제와 프로티나아제를 각각 7.5㎍ 또는 125㎍ 가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트해서 반응시켰다. 반응물에 클로로포름/이소아밀 알코올 혼합액을 가하여 염색체 DNA를 추출하고, 차거운 에탄올을 가하여, 생성한 염색체 DNA를 함유하는 침전을 채취하였다. 이렇게 하여 얻은 정제염색체 DNA를 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하고, 용액을 -80℃에서 동결하였다.
실험예 7-2 형질 전환체 BGN2의 조제
실험예 7-1에서 조제한 정제 염색체 DNA 용액을 1ml 취하고, 여기에 제한 효소 Kpn I을 약 200 단위 첨가하고, 37℃에서 16시간 반응시켜서 염색체 DNA를 분해한 후, 수크로오스 밀도 기울기 초원심법에 의해 약 3,000 내지 7,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 채취하였다. 별도로, 플라스미드 벡터 『Bluescript II SK(+)』 (스트라타진 클로닝 시스템사제)을 통상적인 방법에 의해 제한 효소 Kpn l을 작용시켜서 완전히 절단한 후, 그 절단된 플라스미드 벡터 0.5㎍과 앞서 얻은 DNA 단편 약 5㎍을 『DNA 라이게이션 키트』 [일본국의 寶酒造(주)제]를 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서 조작해서 연결하여 얻어진 재조합 DNA를 사용하여, 통상적인 컴피턴트 셀법에 의해 컴피턴트 셀 『Epicurian Coli XL2-Blue』 (스트라타진 클로닝 시스템사제)를 100㎕을 형질전환해서 유전자 라이브러리를 작제하였다. 얻어진 유전자 라이브러리로서의 형질 전환체를, 통상적인 방법에 의해 조제한, 트립톤 10g/L, 효모 엑기스 5g/L, 염화 나트륨 5g/L, 앰피실린 나트륨염 100mg/L 및 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50mg/L을 함유하는 한천 평판배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 배양후, 배지위에 형성된 백색의 콜로니 약 2,500개를 나일론 막 『Hybond-N+』 (Amersham제)위에 고정하였다.
별도로, 실험예 5-3의 방법으로 밝혀진, 서열표에 있어서의 서열 번호 24에 나온 아미노산 서열에 있어서의 제4번째로부터 제11번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'－GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3′로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 통상적인 방법에 따라 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리누클레오티드키나아제를 사용해서 동위체 표지하여 프로브 1로서의 합성 DNA를 얻었다.
앞서 얻은 나일론 막 위에 고정한 콜로니 중에서, 프로브 1과 현저한 회합을 나타내는 콜로니에 대하여 통상적인 콜로니 하이브리다이제이션법을 적응해서 3종류의 형질 전환체를 선택하였다. 통상적인 방법에 의해, 이들 3종류의 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 채취하는 한편, 서열표에 있어서의 서열 번호 23에 나온 아미노산 서열에 있어서의 제14번째로부터 제21번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'-GTNAAYCARAAYCAYTGGTTYTA-3′로 나타내어지는 염기서열의 프로브 2를 화학합성하고, 마찬가지로 동위체 표지후, 통상의 서어든 하이브리다이즈를 적응하여 현저한 회합을 나타낸 제조합 DNA를 선택하여, 이 형질 전환체를 『BGN2』로 명명하였다.
실험예 7-3 DNA 서열의 해명
실시예 7-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGN2』를 통상적인 방법에 따라, 앰피실린 나트륨을 100㎍/ml 함유하는 L-브로스 배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 배양물로부터 균체를 채취하고, 통상의 알칼리―SDS법에 의해 재조합 DNA를 추출하였다. 이 재조합 DNA의 염기서열을 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는 바실루스 글로비스포루스 N75주에서 유래하는, 체인 길이 4991 염기쌍의, 서열표에 있어서의 서열 번호 5에 나온 염기서열의 DNA를 함유하고 있었다.
도 18에 나온 바와 같이, 이 재조합 DNA에 있어서, 이 DNA는 제한효소 Kpn l에 의한 인식 부위의 하류에 연결되어 있었다. 한편, 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 그 서열 번호 25에 병기한 바와 같고, 이 아미노산 서열과, 실험예 5-1의 방법으로 확인된 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 아미노산 서열 및 실험예 5-3의 방법으로 밝혀진 중간부 부분 아미노산 서열인 서열표의 서열 번호 19 및 서열 번호 20 내지 24에 나온 아미노산 서열과 비교한 결과, 서열표의 서열 번호 19에 나온 아미노산 서열은 서열 번호 25에 병기한 아미노산 서열에서의 제36 내지 43번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
또한, 서열표에 있어서의 서열 번호 20, 21, 22, 23 및 24에 나온 아미노산 서열은, 각각, 서열표에 있어서의 서열 번호 25에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제907 내지 925번째, 제367 내지 386번째, 제1034 내지 1058번째, 제996 내지 1020번째, 및 제632 내지 642번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
한편, 서열표의 서열 번호 25에 있어서의 제4294 내지 4296번째의 염기서열은 번역 종지 코돈(5'-TAA-3')을 코우드하고 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단은 그 직전의 글루타민(서열표의 서열 번호 25에 있어서의 제1286번째의 아미노산)인 것이 밝혀졌다.
이들 결과는, 본 발명의 폴리펩티드가 서열표의 서열 번호 2에 나온 아미노산 서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드는 바실루스 글로비스포루스 N75주에 있어서는 서열표의 서열 번호 5에 나온 염기서열의 DNA에 의해 코우드되어 있는 것을나타내고 있다. 그리고 서열표의 서열 번호 25에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제1 내지 35번째의 아미노산 서열은 이 폴리펩티드의 분비 시그널 서열이라고 추정되었다.
이들로부터, 이 폴리펩티드의 분비전의 전구체 펩티드는 서열표의 서열 번호 25에 병기된 아미노산 서열로 되어 있고, 그 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 25에 나온 염기서열에 코우드되어 있는 것이 밝혀졌다. 이렇게 하여, 그 염기서열을 확인한 재조합 DNA를 『pBGN2』로 명명하였다.
실험예 8 아르드로박터 글로비포르미스 A19주 유래의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 함유하는 재조합 DNA와 형질 전환체의 조제
실험예 8-1 염색체 DNA의 조제
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 2.0％ (w/v), 효모 추출물 『아사히 미스트』 1.0％ (w/v), 인산 2칼륨 0.1％ (w/v), 인산 1나트륨 12수염(水鹽) 0.06％ (w/v), 황산 마그네슘 7수염 0.05％ (w/v) 및 물로 된 액체배지를 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 씩 넣고, 오토클레이브에서 121℃, 20분간 멸균하여 냉각하고, 아르드로박터 글로비포르미스 A19주를 접종하여 27℃, 230rpm에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 그 후, 원심분리에 의해 배양물로부터 채취한 균체를 TES 완충액(pH 8.0)에 부유시켜, 리소자임을 0.05％ (w/v) 가하고 37℃에서 30분간 인큐베이트하였다. 처리물을 -80℃에서 1시간 동결후, TSS 완충액(pH 9.0)을 가해서 60℃로 가온하고, TES 완충액/페놀 혼합액을 가하여 얼음 물 속에서 냉각하면서 5분간 격렬하게 진탕한 후, 원심분리에 의해 상청을 채취하였다.
이 상청에 2배 용량의 차거운 에탄올을 가하고, 침전한 조염색체 DNA를 채취하여 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해후, 리보누클레아제와 프로티나아제를 각각 7.5㎍ 또는 125㎍ 가하고, 37℃에서 1시간 인큐베이트하여 반응시켰다. 반응물에 클로로포름/이소아밀 알코올 혼합액을 가해서 염색체 DNA를 추출하고, 차거운 에탄올을 가하여, 생성한 염색체 DNA를 함유하는 침전을 채취하였다. 이렇게 하여 얻은 정제 염색체 DNA를 농도 약 1mg/ml가 되도록 SSC 완충액(pH 7.1)에 용해하고, 용액을 -80℃에서 동결하였다.
실험예 8-2 형질 전환체 AGAl의 조제
실험예 8-1에서 조제한 정제 염색체 DNA 용액을 1ml 취하고, 여기에 제한 효소 Kpn I을 약 10 단위 가하고 37℃에서 30분간 반응시켜서 염색체 DNA를 부분 분해한 후, 수크로오스 밀도 기울기 초원심법에 의해 약 4,000 내지 8,000 염기쌍으로 된 DNA 단편을 채취하였다.
별도로, 플라스미드 벡터 『Bluescript II SK(+)』 [스트라타진 클로닝 시스템(주)제]을 통상적인 방법에 의해 제한 효소 Kpn l을 작용시켜서 완전히 절단한 후, 그 절단된 플라스미드 벡터 0.5㎍과 앞서 얻은 DNA 단편 약 5㎍을 『DNA 라이게이션 키트』 [일본국의 寶酒造(주)제]를 사용하고, 첨부의 설명서에 따라서 조작해서 연결하여 얻어진 재조합 DNA를 사용하여, 통상적인 컴피턴트 셀법에 의해 컴피턴트 셀 『Epicurian Coli XL2-Blue』 [스트라타진 클로닝 시스템(주)제]를 100㎕을 형질전환해서 유전자 라이브러리를 작제하였다.
얻어진 유전자 라이브러리로서의 형질 전환체를, 통상적인 방법에 의해 조제한, 트립톤 10g/L, 효모 엑기스 5g/L, 염화 나트륨 5g/L, 앰피실린 나트륨염 100mg/L, 및 5-브로모―4-클로로-3-인돌릴-β-갈락토시드 50mg/L을 함유하는 한천 평판배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 배양후, 배지위에 형성된 백색의 콜로니 약 6,000개를 나일론 막 『Hybond-N+』 [Amersham(주)제] 위에 고정하였다.
별도로, 실험예 5-4의 방법으로 밝혀진, 서열표에 있어서의 서열 번호 27에 나온 아미노산 서열에서의 제1번째로부터 제11번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'-CARGARTGGAAYYTNACNGGNGAYCCNTGGAC-3′로 나타내어지는 염기서열의 올리고뉴클레오티드를 화학합성하고, 통상적인 방법에 따라 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리누클레오티드키나아제를 사용해서 동위체 표지하여 프로브 1로서의 합성 DNA를 얻었다.
앞서 얻은 나일론 막 위에 고정한 콜로니 중에서, 프로브 1과 현저한 회합을 나타내는 콜로니에 대하여 통상적인 콜로니 하이브리다이제이션법을 적응해서 2종류의 형질 전환체를 선택하였다. 통상적인 방법에 의해, 이들 3종류의 형질 전환체로부터 재조합 DNA를 채취하는 한편, 서열표에 있어서의 서열 번호 29에 나온 아미노산 서열에 있어서의 제6번째로부터 제16번째까지의 아미노산 서열에 근거하여 5'-TGGACNCARCCNGARGCNGGNGCNGTNTTGCA-3′로 나타내어지는 염기서열의 프로브 2를 화학합성하고, 마찬가지로 동위체 표지후, 통상적인 서어든 하이브리다이즈를 적응하여 현저한 회합을 나타낸 재조합 DNA를 선택하여 이 형질 전환체를 『AGAl』로 명명하였다.
실험예 8-3 DNA 서열의 해명
실시예 8-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『AGAl』을 통상적인 방법에 따라, 앰피실린 나트륨을 100㎍/ml 함유하는 L-브로스 배지(pH 7.0)에 식균하고, 37℃에서 24시간 회전 진탕 배양하였다. 배양 종료후, 원심분리에 의해 배양물로부터 균체를 채취하고, 통상의 알칼리―SDS법에 의해 재조합 DNA를 추출하였다. 이 재조합 DNA의 염기서열을 통상적인 디데옥시법에 의해 분석한 결과, 이 재조합 DNA는 아르드로박터 글로비포르미스 A19주에서 유래하는, 체인 길이 5811 염기쌍의, 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 나온 염기서열의 DNA를 함유하고 있었다. 도 19에 나온 바와 같이, 이 재조합 DNA에 있어서, 이 DNA는 제한효소 Kpn l에 의한 인식 부위의 하류에 연결되어 있었다.
한편, 이 염기서열로부터 추정되는 아미노산 서열은 그 서열 번호 32에 병기한 바와 같고, 이 아미노산 서열과, 실험예 5-1의 방법으로 확인된 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단 아미노산 서열 및 실험예 5-4의 방법으로 밝혀진 중간부 부분 아미노산 서열인, 서열표에 있어서의 서열 번호 26 및 서열 번호 27 내지 31에 나온 아미노산 서열과 비교한 결과, 서열표에 있어서의 서열 번호 26에 나온 아미노산 서열은 서열 번호 32에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제37 내지 49번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다.
또한, 서열표에 있어서의 서열 번호 27, 28, 29, 30 및 31에 나온 아미노산 서열은, 각각 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제227 내지 239번째, 제345 내지 374번째, 제401 내지 430번째, 제89 내지 115번째, 및 제641 내지 667번째의 아미노산 서열과 완전히 일치하였다. 그리고 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 있어서의 제4550 내지 4552번째의 염기서열은 번역 종지 코돈(5'-TGA-3')을 코우드하고 있으므로, 본 발명의 폴리펩티드의 C 말단은 그 직전의 페닐알라닌 (서열표에 있어서의 서열 번호 32에 있어서의 제965번째의 아미노산)인 것이 밝혀졌다.
이들 결과는, 본 발명의 폴리펩티드가 서열표에 있어서의 서열 번호 3에 나온 아미노산 서열을 가지고, 본 발명의 폴리펩티드는, 아르드로박터 글로비포르미스 A19주(FERM BP-7590)에서는 서열표에 있어서의 서열 번호 6에 나온 염기서열의 DNA에 의해 코우드되어 있는 것을 나타내고 있다. 또한, 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 병기한 아미노산 서열에 있어서의 제1 내지 36번째의 아미노산 서열은 이 폴리펩티드의 분비 시그널 서열이라고 추정되었다.
이들로부터, 이 폴리펩티드의 분비전의 전구체 펩티드는 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 병기된 아미노산 서열로 되어 있고, 그 아미노산 서열은 서열표에 있어서의 서열 번호 32에 나온 염기서열에 코우드되어 있는 것이 밝혀졌다. 이렇게 하여 그 염기서열을 확인한 재조합 DNA를 『pAGAl』로 명명하였다.
실험예 9 본 발명의 형질 전환체에 의한 폴리펩티드의 생산
실험예 9-1 형질 전환체 BGC2
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 5g/L, 폴리펩톤 20g/L, 효모 엑기스 20g/L 및 인산 1수소 나트륨 1g/L을 함유하는 수용액을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣어 오토클레이브에서 121℃에서 15분간 처리하고, 냉각하여 무균적으로 pH 7.0로 조제한 후, 앰피실린 나트륨염 10mg을 무균적으로 첨가해서 액체배지를 조제하였다. 이 액체배지에 실험예 6-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGC2』를 접종하여 27℃에서 약 48시간 통기 교반 배양하였다. 이 배양물 중의 이 폴리펩티드의 유무를 조사하기 위해서, 통상적인 방법에 따라 이 배양물을 원심분리해서 배양 상청과 균체로 분리해서 개별로 회수하였다.
균체에 대해서는, 초음파 파쇄법에 의한 세포로부터의 전체 추출물과, 침투압 쇼크법에 의한 세포 페리프라즘으로부터의 추출물을 따로따로 조제하였다. 상기 초음파 파쇄법은, 균체를 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 현탁한 후, 그 균체 현탁액을 얼음 물 속에서 냉각하면서 초음파 호모게나이저 (『모델 UH-600』) [(주) 에스 엠 테제)로 세포를 파쇄하고, 그 파쇄물을 세포 전체 추출물로 하는 방법을 채용하였다. 상기 침투압 쇼크법은, 균체를 30mM 염화 나트륨을 함유하는 10mM 트리스-염산 완충액(pH 7.3)으로 세정한 후, 세정 균체를 200g/l 수크로오스 및 1mM-EDTA를 함유하는 33mM 트리스-염산 완충액 (pH 7.3)에 현탁하고 27℃에서 20분간 진탕한 한 다음, 원심분리해서 균체를 회수하고, 그 균체를, 미리 약 4℃로 냉각해 둔 0.5 mM염화 마그네슘 수용액에 현탁하고, 얼음 물 속에서 20분간 진탕하여 세포 페리프라즘으로부터 추출하는 방법을 채용하였다. 그 후, 원심분리하여 상청을 회수하고, 그 상청을 세포 페리프라즘 추출물로 하였다.
이렇게 하여 얻은 배양 상청, 세포 전체 추출물, 세포 페리프라즘 추출물 각각에 대해서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 측정하고, 각각의 활성값을 배양물 1ml 당(當)으로 환산하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.
[표 12]
시 료 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성(단위/ml-배양물)
배양 상청 0.0
세포 전체 추출물 1.1
세포 페리프라즘 추출물 1.0
표 12의 결과로부터 명백한 바와 같이, 형질 전환체 『BGC2』은 본 발명의 폴리펩티드를 세포내에서 생산하고, 그 대부분은 세포 페리프라즘에 분비되는 것이 밝혀졌다. 한편, 제1의 대조로서, 대장균 『XL2-Blue』주를, 배지에 앰피실린을 첨가하지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다. 제2의 대조로서, 바실루스 글로비스포루스 Cll주를, 앰피실린을 함유하고 있지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다.
제1의 대조의 배양 상청, 균체 파쇄물 모두가 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 전혀 나타나지 않았다. 제2의 대조의 배양 상청 및 균체 파쇄물에는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성이 나타났지만, 이 경우는, 각각 배양물당 약 0.37 단위, 약 0.02 단위이며, 형질 전환체 『BGC2』의 경우에 비교해서 분명히 낮은 값이었다.
상기에서 얻은 세포 페리프라즘 추출물을, 다시 실험예 1의 방법에 준하여 염석, 투석하고, 『Sepabeads FP-DA13』 겔, 『Sephacryl HR S-200』 겔, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 제공해서 정제하고, 본 발명의 폴리펩티드를 실험예 1에 나타낸 방법에 준해서 분석하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 분자량 약 137,000±20,000 달톤, 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 등전점 약 5.2±0.5, α-이소말토실 전이효소 활성의 최적 온도 약 45℃ (Ca2+이온 비존재), 약 50℃ (Ca2+이온 존재), 최적 pH 약 6.0, 온도 안정성은 약 40℃ 까지 (Ca2+이온 비존재), 약 50℃ (Ca2+이온 존재), pH 안정성은 약 5.0 내지 10.0이었다.
이들 결과로부터 이 재조합형 폴리펩티드는, 실험예 1의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 이화학적 성질과 실질적으로 동일하였다.
실험예 9-2 형질 전환체 BGN2
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 5g/L, 폴리 펩톤 20g/L, 효모 엑기스 20g/L 및 인산 1수소 나트륨 1g/L을 함유하는 수용액을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣고 오토클레이브에서 121℃에서 15분간 처리하고, 냉각하여 무균적으로 pH 7.0로 조제한 후, 앰피실린 나트륨염 10mg을 무균적으로 첨가해서 액체배지를 조제하였다. 이 액체배지에 실험예 7-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGN2』를 접종하여 27℃에서 약 48시간 통기 교반 배양하였다. 이 배양물중의 이 폴리펩티드의 유무를 조사하기 위해서, 실험예 9-1의 방법과 마찬가지로 배양 상청과 세포 전체 추출물과 세포 페리프라즘 추출물을 따로따로 조제하였다. 배양 상청, 세포 전체 추출물, 세포 페리프라즘 추출물 각각에 대해서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 측정하고, 각각의 활성값을 배양물 1ml 당으로 환산하였다. 그결과를 표 13에 나타낸다.
[표 13]
시 료 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성(단위/ml-배양물)
배양 상청 0.54
세포 전체 추출물 0.91
세포 페리프라즘 추출물 0.85
표 13의 결과로부터 명백한 바와 같이, 형질 전환체 『BGN2』는 본 발명의 폴리펩티드를 배양 상청 및 세포내에서 생산하고, 그 세포내 중의 대부분은 세포 페리프라즘에 분비되는 것이 밝혀졌다.
한편, 제1의 대조로서, 대장균 『XL2-Blue』주를, 배지에 앰피실린을 첨가하지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다. 제2의 대조로서, 바실루스 글로비스포루스 N75주를, 앰피실린을 함유하고 있지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다.
제1의 대조의 배양 상청, 균체 파쇄물 모두가 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 전혀 나타나지 않았다. 제2의 대조의 배양 상청 및 균체 파쇄물에는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성이 나타났지만, 이 경우는, 각각 배양물당 약 0.21 단위, 약 0.01 단위이며, 형질 전환체 『BGN2』의 경우에 비교해서 분명히 낮은 값이었다.
상기에서 얻은 배양 상청과 세포 페리프라즘 추출물의 혼합물을, 다시 실험예 2의 방법에 준하여 염석, 투석하고, 『Sepabeads FP-DA13』 겔, 『Sephacryl HR S-200』 겔, 『Butyl-Toyopearl 650M』 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 제공해서 정제하고, 본 발명의 폴리펩티드를 실험예 2에 나타낸 방법에 준해서 분석하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 분자량 약 136,000±20,000 달톤, 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 등전점 약 7.3±0.5, α-이소말토실 전이 효소 활성의 최적 온도 약 50℃ (Ca2+비존재하), 약 55℃ (Ca2+존재하), 최적 pH 약 6.0, 온도 안정성은 약 45℃까지 (Ca2+비존재하), 약 50℃ (Ca2+존재하), pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
이들 결과로부터 재조합형 폴리펩티드는, 실험예 2의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 이화학적 성질과 실질적으로 동일하였다.
실험예 9-4 형질 전환체 AGAl
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 5g/L, 폴리 펩톤 20g/L, 효모 엑기스 20g/L 및 인산 1수소 나트륨 1g/L을 함유하는 수용액을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣어 오토클레이브에서 121℃에서 15분간 처리하고, 냉각하여 무균적으로 pH 7.0로 조제한 후, 앰피실린 나트륨염 10mg을 무균적으로 첨가해서 액체배지를 조제하였다. 이 액체배지에 실험예 8-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『AGAl』을 접종하여 27℃에서 약 48시간 통기 교반 배양하였다. 이 배양물중의 이 폴리펩티드의 유무를 조사하기 위해서, 실험예 9-1의 방법과 마찬가지로 배양 상청과 세포 전체 추출물과 세포 페리프라즘 추출물을 따로따로 조제하였다. 배양 상청, 세포 전체 추출물, 세포 페리프라즘 추출물 각각에 대해서 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 측정하고, 각각의 활성값을 배양물 1ml 당으로 환산하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.
[표 14]
시 료 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성(단위/ml-배양물)
배양 상청 0.51
세포 전체 추출물 2.5
세포 페리프라즘 추출물 2.4
표 14의 결과로부터 명백한 바와 같이, 형질 전환체 『AGAl』은 본 발명의 폴리펩티드를 배양 상청 및 세포내에서 생산하고, 그 세포내 중의 대부분은 세포 페리프라즘에 분비되어지는 것이 밝혀졌다.
한편, 제1의 대조로서, 대장균 『XL2-Blue』주를, 배지에 앰피실린을 첨가하지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다. 제2의 대조로서, 아르드로박터 글로비포르미스 A19주를, 앰피실린을 함유하고 있지 않은 것 이외는 모두 상기 형질 전환체의 경우와 동일한 조건에서 배양하고, 배양물로부터 배양 상청과 균체 파쇄물을 조제하였다.
제1의 대조의 배양 상청, 균체 파쇄물 모두 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성은 전혀 나타나지 않았다. 제2의 대조의 배양 상청 및 균체 파쇄물에는α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성이 나타났지만, 이 경우는, 각각 배양물당 약 0.33 단위, 약 0.01 단위이며, 형질 전환체 『AGA2』의 경우에 비교해서 분명히 낮은 값이었다.
상기에서 얻은 배양 상청과 세포 페리프라즘 추출물의 혼합물을, 다시 실험예 3의 방법에 준하여 염석, 투석하고, 『DEAE-Toyopearl 650M』 겔, 『Sephacryl HR S-200』 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피에 제공해서 정제하고, 본 발명의 폴리펩티드를 실험예 3에 나타낸 방법에 준해서 분석하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 분자량 약 94,000±20,000 달톤, 등전점 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법에 의한 등전점 약 4.3±0.5, α-이소말토실 전이 효소 활성의 최적 온도 약 60℃ (Ca2+비존재하), 약 65℃ (Ca2+존재하), 최적 pH 약 8.4, 온도 안정성은 약 55℃까지 (Ca2+비존재하), 약 60℃ (Ca2+존재하), pH 안정성은 약 5.0 내지 9.0이었다.
이들 결과로부터 재조합형 폴리펩티드는, 실험예 3의 방법으로 얻은 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 이화학적 성질과 실질적으로 동일하였다.
이들 결과로부터 본 발명의 폴리펩티드는, 재조합 DNA기술에 의해 제조할 수 있음과 아울러 폴리펩티드의 생산성도 현저하게 향상하는 것이 밝혀졌다.
이하, 실시예에 의해 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법과 본 발명의 폴리펩티드를 이용한 환상 4당 또는 그것을 함유하는 당질의 제조 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 본 발명의 폴리펩티드의 제조
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 5g/L, 폴리 펩톤 20g/L, 효모 엑기스 20g/L 및 인산 1수소 나트륨 1g/L을 함유하는 수용액을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣어 오토클레이브에서 121℃에서 15분간 처리하고, 냉각하여 무균적으로 pH 7.0로 조제한 후, 앰피실린 나트륨염을 100㎍/ml 가하였다. 이 액체배지에 실험예 5-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGC2』를 접종하여 27℃, 230rpm에서 24시간 회전 진탕 배양해서 종배양액을 얻었다. 이어서, 30리터 용량의 퍼멘터에 상기와 같은 조성의 액체배지를 약 18 리터 넣고, 마찬가지로 멸균하여 37℃ 까지 냉각 후, 앰피실린 나트륨염을 50㎍/ml 가하고 종배양액을 1 % (v／v) 접종하여 27℃에서 48시 통기 배양하였다. 이 배양물을 원심분리해서 균체를 회수하고, 10mM 인산 완충액(pH 7.0)에 현탁한 후, 초음파 처리해서 균체를 파쇄하고, 원심분리에 의해 불용물을 제거해서 상청을 얻었다.
이 상청 중의 효소 활성을 측정한 결과, 배양물 1 리터당 약 1,100 단위의 효소 활성이 검출되었다. 이 상청을 사용해서 실험예 1의 방법에 정제한 결과, 비활성 약 13.5 단위/mg 단백질의 본 발명의 폴리펩티드를 1ml당 약 61 단위 함유하는 수용액이 약 70ml 얻어졌다.
실시예 2: 본 발명의 폴리펩티드의 제조
전분 부분 분해물 『파인덱스 #4』 5g/L, 폴리 펩톤 20g/L, 효모 엑기스 20g/L 및 인산 1수소 나트륨 1g/L을 함유하는 수용액을 500ml 용량의 삼각 플라스크에 100ml 넣고 오토클레이브에서 121℃에서 15분간 처리하여 냉각하고, 무균적으로 pH 7.0로 조제한 후, 앰피실린 나트륨염을 100㎍/ml 더하였다. 이 액체배지에 실험예 6-2의 방법으로 얻은 형질 전환체 『BGN2』를 접종하고, 37℃, 230rpm에서 24시간 회전 진탕 배양해서 종배양액을 얻었다. 이어서, 30 리터 용량의 퍼멘터에 상기와 같은 조성의 액체배지를 약 18 리터 넣고, 마찬가지로 멸균하여, 27℃까지 냉각 후, 앰피실린 나트륨염을 50㎍/ml 가하고 종배양액을 1％ (v/v) 접종하여 27℃에서 48시간 통기 배양하였다. 이 배양물을 원심분리해서 배양 상청을 얻었다.
이 배양 상청중의 효소 활성을 측정한 결과, 배양물 1 리터당 약 750 단위의 효소 활성이 검출되었다. 이 상청을 사용해서 실험예 2의 방법에 의해 정제한 결과, 비활성 약 12.6 단위/mg 단백질의 본 발명의 폴리펩티드를 1ml당 약 72 단위 함유하는 수용액이 약 75ml 얻어졌다.
실시예 3: 환상 4당을 함유하는 시럽상물의 제조
타피오카 전분을 농도 약 25％ 전분유(澱粉乳)로 하고, 여기에 α-아밀라아제(상품명 『네오스비타아제』, (일본국의 나가세 생화학공업(주)제)를 전분 고형물 그램당 0.2％ 가하고, 85 내지 90℃에서 약 20분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브 하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 실시예 1의 방법으로 얻은 본 발명의 폴리펩티드와, 실험예 1-4의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이 효소를 전분 고형물 그램당 각각 2.2 단위와 6.6 단위의 비율이 되도록 가하고, 또한 시클로말토덱스트린글루카노트란스페라아제 [일본국의 (주) 林原 생물화학 연구소제]를 전분 고형물 그램당 10 단위 되도록 가하여 pH6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 다음에 α-글루코시다아제제(劑) [상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약(주)제]를 고형물 1그램당 300 단위 가하여 24 시간 반응시키고, 다시 글루코아밀라아제제 [상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업(주)제]를 고형물 1그램당 30 단위 가하여 17 시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축해서 농도 60％의 환상 4당 함유 시럽을 원료전분 고형물당 수율 약 90％로 얻었다.
이 시럽는, 고형물당, 글루코오스 38.4％, 환상 4당 58.1％, 기타의 당질을 3.5％ 함유하고 있고, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수(利離) 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 4: 환상 4당 결정성 분말의 제조
옥수수 전분을 농도 약 20％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제 (상품명 『터마밀 60L』, 노보사제)을 전분 그램당 0.3％ 가하여, 95℃에서 15분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 다시 약 35℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻고, 여기에 실시예 1의 방법으로 얻은 폴리펩티드와 실험예 1-4의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이효소를 전분 고형물 그램당 각각 2.5 단위와 7.0 단위의 비율이 되도록 가하고, 더욱이 시클로말토덱스트린·글루카노트란스페라아제 [일본국의 (주) 林原 생물화학 연구소제]를 전분 고형물 그램당 10 단위 되도록 가하고, pH 6.0, 온도 35℃에서 48시간 반응시켰다.
그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제 [상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노』, 일본국의 天野제약(주)(주)제]를 고형물 그램당 300 단위 가하여 24시간 반응시키고, 더욱이 글루코아밀라아제제 [상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업(주)제]를 고형물 그램당 30 단위 가하여 17 시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을, 통상적인 방법에 따라 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 더욱 농축하여, 고형물당, 글루코오스 34.2％, 환상 4당 62.7％, 기타의 당질을 3.1％ 함유하는 농도 60％의 환상 4당 함유 시럽을 얻었다.
이 환상 4당 함유 시럽을, 강산성 캐타이온 교환 수지 (상품명 『앰버라이트 CR-1310 (Na형)』, 오르가노(주)제)를 사용한 칼럼 분획을 하였다. 수지를 내경 5.4cm의 쟈켓부 스테인레스제 칼럼 4개에 충전하고, 직렬로 연결해서 수지층 전체 길이 20m로 하였다. 칼럼내 온도를 60℃로 유지하면서, 당액을 수지에 대하여 5％ (v/v) 가하고, 여기에 60℃의 온수를 SV O.13에서 흘려서 분획하고, 용출액의 당 조성을 HPLC법으로 모니터하여 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 정제하여, 고형물당 약 98％의 환상 4당을 함유하는 환상 4당 고함유액을 얻었다.
이 용액을 농도 약 70％로 농축한 후, 조정관에 넣고, 종정(種晶)으로서 환상 4당 5 내지 6함수결정 약 2％를 가해서 서냉(徐冷)하여, 결정 석출율 약 45％의 매스키트를 얻었다. 이 매스키트를 건조탑 위의 노즐로부터 50kg/cm2의 고압으로 분무하였다. 이와 동시에 85℃의 열풍을 건조찹의 상부에서 송풍하고, 저부에 설치한 이송용 철망 컨베이어 위에서 결정 분말을 포집하고, 컨베이어 아래로부터 45℃의 온풍을 보내면서 그 분말을 건조탑 밖으로 서서히 이동시켜 꺼내었다.
이 결정 분말을 숙성탑에 충전해서 온풍을 보내면서 10시간 숙성시켜, 결정화와 건조를 완료하여, 원료전분 고형물당 수율 약 20％로 환상 4당 5 내지 6함수결정 분말을 얻었다.
이 제품은 환원성이 극히 낮고, 아미노카르보닐 반응을 일으키기 어려우며, 흡습성도 나타내지 않고, 취급이 용이하며, 온화한 저감미, 적당한 점도, 보습성, 포접성, 난(難)소화성을 가지므로, 감미료, 저칼로리 식품 소재, 정미 개량제, 풍미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
실시예 5: 환상 4당 결정성 분말의 제조
옥수수 전분을 농도 약 30％의 전분유로 하고, 여기에 탄산 칼슘 0.1％ 가하여 pH 6.5로 조정하고, α-아밀라아제 [상품명 『터마밀 60L』 (노보사제)]를 전분 그램당 0.3％ 가하여 95℃에서 15분간 반응시킨 다음, 120℃에서 20분간 오토클레이브하고, 약 51℃로 급냉해서 DE 약 4의 액화 용액을 얻어 여기에 실시예 2의 방법으로 얻은 폴리펩티드와 실험예 2-4의 방법으로 얻은 α-이소말토실 전이 효소를 전분 고형물 그램당 각각 2.4 단위와 8.0 단위의 비율로 가하고, 또한 시클로말토덱스트린·글루카노트란스페라아제 [일본국의 (주)林原 생물화학 연구소제]를 전분 고형물 그램당 3 단위가 되도록 가하고, pH 5.5, 온도 51℃에서 48시간 반응시켰다. 그 반응액을 95℃에서 30분간 유지한 후, pH 5.0, 온도 50℃로 조정한 후, α-글루코시다아제제(劑) [상품명 『트란스글루코시다아제 L 「아마노」』, 일본국의 天野제약(주)제]를 고형물 그램당 300 단위 가하여 24시간 반응시키고, 또한 글루코아밀라아제제 [상품명 『글루코자임』, 일본국의 나가세 생화학공업(주)제]를 고형물 그램당 30 단위 가하여 17시간 반응시키고, 그 반응액을 95℃로 가열하여 30분간 유지한 후, 냉각하고, 여과해서 얻어지는 여액을 통상적인 방법에 따라서 활성탄으로 탈색하고, H형 및 OH형 이온교환 수지에 의해 탈염해서 정제하고, 또한 더욱 농축하여, 고형물당, 글루코오스 46.8％, 환상 4당 44.0％, 기타의 당질을 9.8％ 함유하는 농도 60％의 환상 4당 함유 시럽을 얻었다.
얻어진 환상 4당 함유 시럽을 원(原)당액으로 하고, 환상 4당의 함량을 높이기 위해서, 실시예 5의 방법에 준해서 강산성 캐타이온 교환 수지를 사용하는 칼럼 크로마토그래피를 하여 환상 4당 고함유 획분을 채취하고, 정제하여 농축하고, 분무건조하여 환상 4당 함유 분말을 원료전분 고형물당 수율 약 45％로 얻었다.
이 제품은 고형물당, 글루코오스 3.7％, 환상 4당 80.5 ％, 및 그 밖의 당질을 15.8％ 함유하고 있고, 온화한 단 맛, 적당한 점도, 보습성, 포접성을 가지므로, 감미료, 정미 개량제, 품질 개량제, 이수 방지제, 안정제, 변색 방지제, 부형제, 포접제, 분말화 기재 등으로서, 각종 음식물, 화장품, 의약품 등의 각종 조성물에 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명은 이렇게도 현저한 작용 효과를 나타내는 발명이며, 이 분야에 공헌하는 바 실로 엄청난 의의 있는 발명이라고 할 수 있다.
본 발명의 제1의 목적은, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 3 이상인 당질을 생성하는 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드를 창제하는 것이다.
본 발명의 제2의 목적은 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제3의 목적은 상기 DNA를 함유하는 복제 가능한 재조합 DNA를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제4의 목적은 상기 재조합 DNA를 도입한 형질 전환체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제5의 목적은, 상기 형질 전환체를 이용하는, α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 제6의 목적은 상기 폴리펩티드의 용도를 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 상기 제1의 목적을 아래의 이화학적 성질을 가진 α-이소말토실글루코 당질생성 효소 활성을 가진 폴리펩티드에 의해 해결하는 것이다.
(1) 작용
비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도가 2 이상인 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상인 당질을 생성한다.
(2) 분자량
SDS-겔 전기 영동법에 의해, 약 74,000 내지 약 160,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
(3) 최적 온도
pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 약 40 내지 약 50℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 45 내지 약 55℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는,
pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 65℃에서 최적 온도를 가진다.
(4) 최적 pH
35℃, 60분간 반응의 조건하에서 pH 약 6.0 내지 약 8.4의 범위내에서 최적 pH를 가진다.
(5) 온도 안정성
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건하에서 약 45℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가진다.
pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
pH 8.0, 60분간 반응의 조건하에서 55℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가진다.
또는, pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에서, 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도 안정 영역을 가진다.
(6）pH 안정성
4℃, 24시간 유지하는 조건하에서 pH 약 5.0 내지 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
본 발명은 상기한 제2의 목적을 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA에 의해 해결하는 것이다.
본 발명은 상기 제3의 목적을 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA와 자율 복제 가능한 벡터를 함유해서 되는 복제 가능한 DNA에 의해 해결하는 것이다.
본 발명은 상기 제4의 목적을, 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA가 자율 복제 가능한 벡터를 함유해서 되는 복제 가능한 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입해서 되는 형질 전환체에 의해 해결하는 것이다.
본 발명은 상기 제5의 목적을, 상기 폴리펩티드를 코우드하는 DNA가 자율 복제 가능한 벡터를 함유해서 되는 복제 가능한 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입해서 되는 형질 전환체를 배양하고, 배양물로부터 폴리펩티드를 채취해서 되는 폴리펩티드의 제조 방법에 의해 해결하는 것이다.
본 발명은 상기 제6의 목적을 상기 폴리펩티드의 여러가지 용도를 확립함으로써 해결하는 것이다.

Claims (18)

  1. 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질로부터, 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성하는 효소 활성을 가지며, 또한, 서열표에 있어서의 서열 번호 1, 2, 혹은 3에 나온 아미노산 서열, 혹은 그것들의 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환, 혹은 부가한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 아래의 이화학적 성질을 가진 폴리펩티드.
    (1) 분자량
    SDS-겔 전기 영동법에 의해, 약 74,000 내지 약 160,000 달톤의 범위내에서 분자량을 가진다.
    (2) 최적 온도
    pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 약 40℃ 내지 약 50℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
    pH 6.0, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 45℃ 내지 약 55℃의 온도범위내에서 최적 온도를 가진다.
    pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 60℃에서 최적 온도를 가진다. 또는
    pH 8.4, 60분간 반응의 조건하에서 1mM Ca2+존재하에 약 65℃에서 최적 온도를 가진다.
    (3) 최적 pH
    35℃, 60분간 반응의 조건하에서 pH 약 6.0 내지 8.4의 온도범위내에서 최적 pH를 가진다.
    (4) 온도 안정성
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건하에서 약 45℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    pH 6.0, 60분간 유지하는 조건에 있어서 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    pH 8.0, 60분간 반응의 조건하에서 55℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    또는, pH 8.0, 60분간 유지하는 조건에 있어서, 1mM Ca2+존재하에 약 60℃ 이하에서 온도안정 영역을 가진다.
    (5）pH 안정성
    4℃, 24시간 유지하는 조건하에서 pH 약 5.0 내지 약 10.0의 범위내에서 안정 pH 영역을 가진다.
  3. 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를 코우드하는 DNA.
  4. 제3항에 있어서, 서열표에 있어서의 서열 번호 4, 5, 혹은 6에 나온 염기서열 혹은 그것들의 염기서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가한 염기서열, 또는 그것들에 상보적인 염기서열 혹은 그것들의 염기서열에 있어서의 1개 혹은 복수개의 염기를, 유전자의 축중에 근거하여, 그것이 코우드하는 아미노산 서열을 변경함이 없이 다른 염기로 치환한 염기서열을 가진 DNA.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 유전자의 축중에 근거하여, 서열표에 있어서의 서열 번호 1, 2 또는 3에 나온 아미노산 서열을 변경함이 없이 서열표에 있어서의 서열 번호 4, 5, 혹은 6에 나온 염기서열에 있어서의 염기의 1개 혹은 복수개의 염기를 다른 염기로 치환한 염기서열을 가진 DNA.
  6. 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 바실루스 속(屬)의 미생물에서 유래하는 DNA.
  7. 제3항, 제4항 또는 제5항에 있어서, 아르드로박터 속의 미생물에서 유래하는 DNA.
  8. 제3항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 기재한 DNA와 자율 복제 가능한 벡터를함유해서 되는 복제 가능한 재조합 DNA.
  9. 제8항에 있어서, 자율 복제 가능한 벡터가 플라스미드 벡터 Bluescript II SK(+)인 복제 가능한 재조합 DNA.
  10. 제8항 또는 제9항 기재의 복제 가능한 재조합 DNA를 적당한 숙주에 도입해서 되는 형질 전환체.
  11. 제10항에 있어서, 숙주가 대장균인 형질 전환체.
  12. 제10항 또는 제11항 기재의 형질 전환체를 영양배지 중에서 배양하고, 그 배양물로부터 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를 채취하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 배양물 중의 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를, 원심분리, 여과, 농축, 염석, 투석, 분별 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 등전점 전기영동으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 방법에 의해 채취하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 제조 방법.
  14. 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 작용시켜, 상기 당질의 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성시키는 방법.
  15. 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 작용시켜, 상기 당질의 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질의 제조 방법.
  16. 제1항 또는 제2항 기재의 폴리펩티드를, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 2 이상의 당질에 작용시켜, 상기 당질의 환원력을 실질적으로 증가함이 없이 α-글루코실 전이함으로써, 비환원 말단의 결합으로서 α-1,6 글루코실 결합 양식을 가지고, 이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질을 생성시키고, 이어서, 비환원 말단의 결합 양식으로서 α-1,6 글루코실 결합을 가지고이 비환원 말단 이외의 결합 양식으로서 α-1,4 글루코실 결합을 가진, 글루코오스 중합도 3 이상의 당질로부터 α-이소말토실 전이함으로써, 사이클로{6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실―(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성하는 효소를 작용시켜, 사이클로{→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조를 가진 환상 4당을 생성시키고, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 환상 4당의 제조 방법.
  17. 제16항에 있어서, 환상 4당을 결정화시키는 공정을 함유하는 것을 특징으로 하는 환상 4당의 제조 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 환상 4당이 시럽 또는 결정인 것을 특징으로 하는 환상 4당의 제조 방법.
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