TWI269810B

TWI269810B - Polypeptide having alpha-isomaltosylglucosaccharide-forming enzymatic activity

Info

Publication number: TWI269810B
Application number: TW091100311A
Authority: TW
Inventors: Michio Kubota; Kazuhiko Maruta; Takuo Yamamoto; Shigeharu Fukuda
Original assignee: Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 2001-01-12
Filing date: 2002-01-11
Publication date: 2007-01-01
Also published as: AU2002225387B2; CA2434414A1; EP1361274A1; CN1484701A; JP3942543B2; US20040161835A1; WO2002055708A1; CA2434414C; JPWO2002055708A1; EP1361274B1; KR20030066801A; KR100853353B1; ATE465260T1; US7211422B2; DE60236067D1; EP1361274A4

Description

1269810 A7 ____ B7 五、發明説明（1 ) 本發明係有關具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性的多肽（以下除特別標明以外，均稱爲「本發明之多肽」 )及藉由基因重組技術製造該多肽之方法及其用途。以葡萄糖爲構成糖之糖質係習知者有例如澱粉之部份分解物之直鏈澱粉，澱粉糊精，麥芽糖糊精，麥芽寡糖，異麥芽寡糖等。此等糖質係通常在分子兩端的其一具有非還原末端且另一方爲還原末端，具有還原性係爲人所知。通常澱粉部份分解物係以葡萄糖。當量（Dexitrose EquiValen + = DE)來表示固體單位之還原力。此値大者，通常係分子小，低粘度且甜味強，但反應性高，具有極易與胺基酸或蛋白質等具有胺基之物質引起胺基羰基反應，產生褐變或惡臭，極易引起其品質劣化等性質亦爲人所知。爲改善此缺點，以往均希望在不改變澱粉部份分解物之構成糖的葡萄糖下，減低或消滅其還原力。例如Journal of American Chemical Society 第 71 卷，353 〜358 頁（ 1 9 4 9 )所揭示，有使macerans ·直鏈激粉與之作用於澱粉，使6〜8分子葡萄糖生成爲α - 1，4 -葡萄糖基結合的α -，3 -或Τ -環狀糊精之方法爲人所知。如今已有工業規模自澱粉生產此等環狀糊精，此等以其所具有之非還原性，無味性，包含能力等特性被利用於各種用途。又，如本案申請人所申請專利日本特開平 7 - 1 4 3 8 7 6號公報及特開平7 - 2 1 3 2 8 3號公報等揭示，使非還原性精質生成酶及海藻糖游離酶作用於麥芽寡糖等澱粉部份分解物，以生成二分子之葡萄糖α，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -4- 1269810 A7 B7 五、發明説明（2 ) ^ -結合的海藻糖的方法係爲人所知者。現今α，α -海藻糖已在工業上自澱粉予以生產，以其所具有之非還原性，溫和，高品質之甘味特性等被利用於各種用途。如上述做爲以葡萄糖爲構成糖的非還原性糖質，葡萄糖聚合度爲 2之α，α —海藻糖，葡萄糖聚合度爲6至8之α -，/? -，r -環狀糊精雖被工業規模生產，以其各具有之特性被利用，但其種類仍受到限制，極希望能提供更多樣之非還原性糖質，或低還原性糖質。另一方面，近年來已有報告提出以葡萄糖爲構成糖之新環狀四糖類，即，「European Journal of Biochemistry」第226卷，641〜648頁（1994)中曾揭示主要以葡萄糖殘基爲α - 1 ，3結合與α - 1，6結合交替連接的Alternan，使水解酶之Alternanase作用以生成環 { — 6) — α - D — D比喃葡糖基一（1 — 3) — a — D — 吡喃葡糖基一（1 — 6) — α—D —吡喃葡糖基一（1 — 3) -α - D -吡喃葡糖基一（1 —丨之構造的環狀四糖 (此說明書中有時將此糖質簡稱爲「環狀四糖」），使其在一種有機溶媒之甲醇共存下晶析之內容。具有環狀構造之環狀四糖，係一種非還原性糖質，具有包含各種化合物之能力，所以可以具安定化揮發性有機物之作用或不會引起胺基羰基反應，不用擔心褐變劣化之下，可加工利用於各種用途。惟由於做爲製造環狀四糖之原料的alternan，或製造環狀四糖所需之酶的Alternanase 極不易取得，在現今情況下可以產生此等之微生物亦極不本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 t 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（3 ) 谷易取得。在這種情況下，本發明人等乃在國際專利申請案公開 W 0 01/90338 A1中揭示，以做爲非還原末端之結合樣式具有α _ 1 ，6 一葡萄糖基結合，做爲此還原末端以外之結合樣式爲具有α 一 1，4 -葡萄糖基結合 2葡萄糖聚合度爲3以上之糖質（在此說明書中有時簡稱爲「α-異麥芽糖基葡糖質」）爲原料，特異性地將該糖質之異麥芽糖基部份與其以外之葡糖質切斷，轉移此α -異麥芽糖基部份，使可以成生環狀四糖之α -異麥芽糖基轉移酶予以作用，而成功地生產出環狀四糖。α -異麥芽糖基轉移酶係可以自α -異麥芽糖基葡糖質藉由α -異麥芽糖基轉移而可生成環狀四糖之酶，係具有以下理化學性質之酶。 (1 )作用做爲非還原末端之結合樣式具有α 一 1 ，6葡糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α - 1 ，4葡糖基結合之葡萄糖聚合度3以上糖質，藉由α -異麥芽糖基轉移，生成具有環{一6) - α-D -吡喃葡糖基-( 1 — 3) — α — D—吡喃葡糖基-— a— D — 吡喃葡糖基一（1 — 3 ) - α — D —吡喃葡糖基一（1 — )構造的環狀四糖。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 ) (2 )分子量在SDS-凝膠電泳法中具有約82， 000達頓至 136，〇〇〇達頓範圍內之分子量。 (3 )等電點在含有兩性電解質之電泳法中具有P 1約3 · 7〜約 8 . 3範圍內之等電點。 (4 )最適溫度在pH6 . 0，30分鐘反應之條件下，具有約45 °C〜約5 0 °C範圍內之最適溫度。 (5 )最適P Η 3 5 °C，3 0分鐘反應之條件下具有ρ Η約5 . 5〜 pH約6·5範圍之最適pH。 (6 )溫度安定性保持於Ρ Η 6 · 0，6 0分鐘條件具有約4 5 °C以下之安定溫度領域。 (7 ) Ρ Η安定性於4 °C，保持2 4小時之條件下具有ρ Η約3 · 6〜 pH約10.〇範圍內之安定PH領域。惟有關環狀四糖之原料糖質，雖希望可以自豐富且廉本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 Α7 Β7 五、發明説明（5 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 價提供之澱粉予以生產，但實際上α -異麥芽糖基轉移酶無法直接作用於澱粉，所以必須採用預先將澱粉變換爲具有上述特定構造之α -異麥芽糖基葡糖質，例如人參三糖 (panose，6 - α -葡萄基麥芽糖）或異麥芽糖基麥芽糖等較低分子之異麥芽寡糖，繼而使α -異麥芽糖基轉移酶予以作用而生成環狀四糖的手法。另一方面，自原料生成環狀四糖的生成率觀之，使用人參三糖時，重量單位之原料人參三糖可得約4 4%。同樣，使用異麥芽糖基麥芽糖時，則約爲3 1 %，與之相比，使用澱粉時，不但必須預先使、-澱粉酶，切澱粉脫光之酶、0 -澱粉酶及α -配糖酶等予以作用，生成爲人參三糖等較低分子之異麥芽糖基寡糖，環狀四糖之生成率亦爲約1 5 %，極爲低。自澱粉生產生環狀四糖雖如上述生成率低，仍可具實用，惟令人憂心的是成本高。所以在此狀況下，乃極希望開發以極容易取得之澱粉等材料做爲原料，建立高生成率之環狀四糖新穎製造方法。經濟部智慧財產局、員工消費合作社印製在上述狀況下，本發明人等係對於以澱粉爲原料，可以自澱粉顯著提高環狀四糖收率之生成α -異麥芽糖基葡糖質的新穎酶寄與期待，廣泛地探索微生物之種類。結果意外地發現國際專利申請公開 W 0 0 1 / 9 0 3 3 8 A 1號所揭示之自土壤分離之芽孢桿菌（ Bacillus)屬或節桿菌（Arthrobacter)屬所屬微生物，具有產生α -異麥芽糖基轉移酶能力之C 9株、 C 11株、Ν7 5株及A 1 9株具有新穎生產^ 一異麥芽本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) 糖基葡糖質生成酶能力。發現對於澱粉部份分解酶爲主之較高分子葡萄糖質，使其與此新穎之α _異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶作用時，可以顯著提高環狀四糖之生成率至本發明人等所期待之目標，同時，一倂明確該α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之各性質，同時確立其製造方法，更確立了藉由該酶進行α -葡萄糖基轉移反應方法’ α -異麥芽糖基葡糖轉移酶之製造方法，以及倂用該酶與α -異麥芽糖基轉移酶之環狀四糖，或含此之糖質’以及其製造方法，尙確立了含有上述所得環狀四糖，或含其之糖質的飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。惟此等微生物係產生α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之能力並非極充足，欲大規模製造α -異麥芽糖基葡糖質或環狀四糖時，必須大量培養該酶之供給源的微生物乃成爲其問題之所在。針對此點，今日分子生物學已進步至獲知酶之本質係多肽，且構成其之胺基酸序列可左右該酶活性之表現，而該胺基酸序列係被暗號爲基因D Ν Α者。所以只要單離編碼該多肽的基因，分析出其鹼序列，即可製作含有編碼該多肽之DN A的重組DNA，並將此等導入適當之微生物或動植物細胞，在適當之營養培養基中培養所得轉形體，即可較容易地取得所期望之量的多肽。有鑑於上述狀況，找出可編碼該酶本質的多肽之基因，分析出其鹼序列乃成爲當前之急務。本發明係以創製可以自做爲非還原末端之結合樣式具本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 有α - 1 ，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質’在實質上不增加還原力之下藉由α -葡萄糖基轉，生成做爲非還原末端具有α - 1 ，6葡萄糖基結合樣式，做爲此非還原末端以外之結合式樣具有α - 1，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度3以上的糖質的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽者。3以上糖的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性的多肽爲第一目的。本發明係以提供可編碼上述多肽之D Ν Α爲第二目的〇

本發明係以提供含上述D Ν A之可複製的重組D N A 爲第三目的。本發明係以提供導入有上述重組D Ν A之轉形體爲第四目的。本發明係以提供使用上述轉形體以製造具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的方法爲第五目的。本發明係以提供上述多肽之用途爲第六目的。本發明係以具有下述理化學上性質之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性的多肽解決上述第一目的者。 (1 )作用自做爲非還原末端具有α - 1，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，在實質上不增加還原力之下藉由α -葡萄糖基轉移，生成做爲非還原末端具有α - 1 ，6葡萄糖基結合樣式，做爲此非還原末端以外之結合式本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-10- 1269810 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（8 ) 樣具有α-l，4葡萄糖基結合樣式之葡萄糖聚合度3以上的糖質。 (2 )分子量在S D S -凝膠電泳法，具有約7 4，0 0 0至 1 6 0，0 0 0達頓範圍內之分子量。 (3 )最適溫度 Ρ Η 6 . 0，6 0分鐘反應下，於約4 0 °C〜5 0 °C 範圍內具有最適溫度。 PH6 · 0，60分鐘反應下，lmMCa2 +存在下，於4 5〜5 5 °C範圍內具有最適溫度。 PH8 .4，60分鐘反應下，於60°C具有最適溫度，或 PH8 . 4，60分鐘反應下，於lmMCa2 +存在下，於65 °C具有最適之溫度。 (4 )最適ρ II 35°C，60分鐘反應下，於pH約6 . 0〜8 . 4 範圍內具有最適pH。 (5 )溫度安定性保持於ρ Η 6 . 0，6 0分鐘條件，於4 5 °C以下具有溫度安定區域。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 ______ B7 五、發明説明（9 ) 保持於ρΗ6 · 0，60分鐘條件，lmMCa2 +存在下’於約5 0 °C以下具有溫度安定區域。保持於p Η 8 . 0，6 0分鐘條件，於5 5 °C以下具有溫度安定區域。保持於p Η 8 . 0，6 0分鐘條件，1 m M C a 2 +存在下’於約6 0 °C以下具有溫度安定區域。 (6 ) p Η安定性保持4 °C，2 4小時之條件下，Ρ Η約4 · 5〜 10.0範圍內具有安定pH之區域。本發明係藉由可編碼上述多肽之D N A以解決上述第二目的者。本發明係藉由可編碼上述多肽之D NA與含有可自律複製之載體的可複製D NA以解決上述第二目的者。本發明係藉由將可編碼上述多肽之D NA與含有可自律複製之載體的可複製重組DNA導入適當之宿主所成轉形體以解決上述第四目的者。本發明係藉由培養將編碼上述多肽之D N A與含有可自律複製之載體的可複製重組D NA導入適當之宿主所成轉形體，自培養物採取多肽的多肽之製造方法以解決上述第五目的者。本發明係藉由確立上述多肽之各種用途以解決上述第六目的者。本紙張尺度適用^國國家標準（CNS ) A4規格（210父297公釐了 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) # -訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -12- 1269810 A7 B7 五、發明説明（10 ) 本發明之多肽係指具有可以自做爲非還原末端之結合式樣具有α - 1，4 -葡萄糖基結合的葡萄糖聚合度爲2 以上糖質，在實質上不增加還原力之下，藉由α 一葡萄糖基轉移生成做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1，6葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有^ 一 1 ’ 4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以上糖質的酶活性之全部多肽而言者。本發明之多肽係通常具有被解明之胺基酸序列，其一例可爲如序列表中序列1所示胺基酸序列，或在該胺基酸序列中，缺失1或複數個胺基酸，即1 個或2個以上，有時可爲1至5 0個，或1至3 0個，或 1至1 0個胺基酸缺失’或被其他胺基酸所取代，更可以爲具有被附加之胺基酸序列的多肽。又，即使爲同樣之 D ΝΑ，有時還會因導入其之宿主，或培養含該d ΝΑ之轉形體的營養培養基成份組成或培養溫度，ρ Η之不同，藉由宿主內外之D Ν Α表現後的修飾等，雖保持所期之理化學上性質，但序列表1所示胺基酸中N末端附近的胺基酸缺失1或複數個，即1個或2個以上，有時缺失1至 50個，1至3 0個，或1至20個，或1至1〇個，或被其他胺基酸所取代，或在N末端新附加1或2個以上，有時1至3 0個，或1至2 0個，或1至1 〇個胺基酸生成之變異體。即使該變異體，只要具備所期之理化學性，當然亦可包含於本發明之多肽。本發明之多肽係將本發明之DNA導入適當之宿主，自所得轉形體之培養液採取即可獲得。本發明中人使用之本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -13- 1269810 A7 B7 五、發明説明（11 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 轉形體可爲例如序列4，5或6中所示，自5 /末端之驗基序列或此等序列中缺失，取代，或附加1或複數個鹼之鹼基序列，或依據基因之縮聚，將對於此等爲互補之鹼基序列或此等鹼序列中的1或複數個，在不改變基所編碼之胺基酸序列下以其他鹼基取代之鹼基序列所成含D N A的轉形體。又，上述鹼基序列可利用基因編碼之縮聚，在不改變編碼之胺基酸序列下，以其他鹼基取代鹼基之一個或複數個，即，1個或2個以上，有時爲1至1 5 0個，1 至9 0個，或1至6 0個，或1至3 0個者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本發明之D N A係只要爲可編碼本發明多肽之鹼基序列，不論其爲來自天然者，人爲合成者，均不計其來源，天然之來源者有例如2 0 0 0年4月2 5日在日本日本茨城縣中央第6所在之獨立行法人產業技術總合硏究專利寄存中心寄存的寄存號碼爲F E R Μ B P — 7 1 4 3的圓孢芽孢桿菌C9株；於2 0 0 0年4月2 5日在上述同一寄存機關之寄存號碼FERMBP-7144寄存之圓孢芽袍桿菌Cl 1株；於200 1年5月16日寄存於上述同一寄存機關之寄存號碼F E R Μ Β Ρ——7 5 9 1的圓孢芽孢桿菌Ν 7 5株之孢桿菌屬，或於2 0 0 1年5月1 6曰在上述同一寄存機關之寄存號碼F E RMB Ρ - 7 5 9 0 的球形節桿菌A 1 9株之節桿菌屬微生物。自此等微生物之菌體可得本發明之含D NA基因。即，接種該微生物於營養基，在好氣性條件下，培養約1至3天後，自培養物採取菌體，以溶菌酶或/3 -葡聚糖酶等細胞壁溶解酶或超本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -14- 1269810 A7 B7 五、發明説明（12 ) 音波處理，即可將該含有D NA之基因溶離至菌體外。這時亦可用蛋白酶等蛋白質分解酶，或於S D S等界面活性劑之存在下凍結溶解。然後適用斯界通常一般之例如酚萃取，醇沉澱、離心分離、核糖核酸酶處理等方法於上述所得處理物，即可得目的之D N A。另一方面欲人爲地合成本發明之D N A時，則可以依據例如序列表中序列4、5 或6所示鹼基序列化學合成。又，可以用含該DNA之基因做爲模板，使用可成爲適當之引物的化學合成D N A，進行P C R合成亦可極有利地實施使用此等D N A可以工業上大量地，廉價且輕易地製造本發明之多肽。即將該D N A插入通常可自行複雜之適當載體成爲重組DNA，導入其至適當宿主，在適當營養培養基中培養所得轉形體，自培養物採取菌體，自該菌體得含該D N A之重組D N A，將此導入通常極易使其增殖之適當宿主予以轉形，在適當之營養培養基中培養所得轉形體，即可製造本發明之多肽。上述重組D N A係只要可以取得可編碼本發明之多肽的D N A，即可藉由一般之重組D N A技術較容易地調製。上述載體可爲例如 pBR322、pUC18、Bluerscript II SK ( +)、 pUBl 10、pTZ4、pC194、pHVl4、 TRp7、YEp7、pBS7等質體載體或入gt· AC、Agt · λΒ、ρ11、ςύ1、41〇5 等噬菌體體。其中爲使本發明D Ν Α於大腸菌中表發現，以 pBR322、pUC18、Bluerscript II SK (+)、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 争·

、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -15- 1269810 A7 ___ B7 五、發明説明（13 )

Agt·AC及Agt ·λΒ爲宜，另一方面爲於枯草菌中表現，以pUBll〇、pTZ4、pC194、 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Pll、及 4105 爲宜。pHV14、TRp7、 YE p 7及p B S 7係在二種以上之宿主內使重組DMA 複製有用者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製插入本發明有關之D N A於上述載體時可採用斯業界通常採用之一般方法。具體言，以限制酶及/或超音波切斷含DNA之基因與可自行複製之載體，其次連結所成之 D NA片斷與載體片段。如能對基因及載體之切斷使用可特異性作用於核苷酸的限制酶，尤其I I型限制酶，詳而言如 Sau 3AI 、Eco R I > H i n d III 'Bam HI、Sal I、Xba I、Sac I 、P s t I等時可以極容易地連結DNA片斷與載體片斷。視其需要退火二者後，在活體內或活體外使D N A連接酶即可。如此所得之重組D N A可以導入大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母等適當宿主，使其爲轉形體，自此等轉形體選殖所希望之轉形體，經培養即可極輕易且大量地複製。上述選殖時可適用菌落雜交法，或以含有做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質的營養培養基，自該糖質選擇可生成做爲非還原末端的結合樣式具有α - 1 ，6葡萄糖基結合、做爲非還原末端以外的結合樣式具有α - 1 ，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以上之糖質的轉形體即可。經由此等選殖所得轉形體以營養培養基培時即可在菌本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇><297公釐） 16- 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（14 ) 體內外產生該多肽。營養培養基係通常使用具有碳源、氮源、礦物質，更視其需要再補足胺基酸或維他命等微量營養素之一般液體培養基、碳源可分別爲例如澱粉、澱粉水解物、葡萄糖、果糖、蔗糖、海藻糖等糖源，氮源可爲例如氨或氨鹽、尿素、硝酸鹽、腺、酵母萃取物、脂脂大豆、玉米漿、肉萃取物等含氮之無機或有機物。接種該轉形體於營養培養基、保持培養基爲20〜40 °C，pH2至 1 0，於通氣攪拌等好氣性條件下培養約1至6天，即可得含該多肽之培養物。此培養物可做爲含有本發明多肽之粗多肽直接使用，惟通常係在使用前視其需要藉由滲透壓衝擊或界面活性劑自菌體萃取出，或藉由超音波或細胞溶解酶軋碎菌體後，經過濾，離心分離等自菌體或菌體軋碎物分離，精製本發明之多肽。精製時可採用斯業界中通常爲精製多肽而採用之一般方法，例如對除去菌體或菌體軋碎物之培養物採用適當地組合一種或二種以上選自濃縮、鹽析、透析、分離沈澱、凝膠過濾層析、離子交換層析、凝膠電泳、等電點電泳等之方法即可。本發明之多肽係具有可以自做爲非還原末端之結合式樣具有α - 1，4 -葡萄糖基結合的葡萄糖聚合度爲2以上糖質，在實質上不增加還原力之下，藉由α -葡萄糖基轉移生成做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1 ，6葡萄糖基結合，做爲此非還原末端以外之結合樣式具有α - 1 ，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲3以上糖質的酶活性者，詳而言具有以下理化學上性質。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（彳5 ) (1 )作用自做爲非速原末端具有α - 1，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，在實質上不增加還原力之下藉由α -葡萄糖基轉移，即可生成做爲非還原末端具有α - 1，6葡萄糖基結合樣式，做爲此非還原末端以外之結合式樣具有α - 1，4葡萄糖基結合樣式之葡萄糖聚合度 3以上的糖質。 (2 )分子量在S D S -凝膠電泳法，具有約7 4，0 0 0至 160， 000達頓範圍內之分子量。 (3 )最適溫度

ΡΗ6 _ 0，60分鐘反應下，於約40°C〜50°C 範圍內具有最適溫度。 PH6 _ 0，60分鐘反應下，lmMCa2 +存在下，於4 5〜5 5 t範圍內具有最適溫度。 pH 8. 4，60分鐘反應下，於60 °C具有最適溫度，或 PH8 · 4，60分鐘反應下，於lmMCa2 +存在下，於6 5 °C具有最適之溫度。 (4 )最適P Η 35°C，60分鐘反應下，於pH約6 . 0〜8 · 4 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 經濟部智慧財產局員工涓費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -。 1269810 A7 B7 五、發明説明（16 ) 範圍內具有最適p Η。 (5 )溫度安定性保持於ρ Η 6 · 0，6 0分鐘條件，於4 5 °C以下具有溫度安定區域。保持於p Η 6 · 0，6 0分鐘條件，1 m M C a 2 +存在下，於約5 0 °C以下具有溫度安定區域。保持於ρ Η 8 _ 0，6 0分鐘條件，於5 5 °C以下具有溫度安定區域。保持於pH8 · 0，60分鐘條件，lmMCa2 +存在下，於約6 0 °C以下具有溫度安定區域。 (6 ) p Η安定性保持4 °C，2 4小時之條件下，ρ Η約4 _ 5〜 1 0 · 0範圍內具有安定pH區域。本發明之多肽可作用的基質可用澱粉、支鏈澱粉、直鏈澱粉、糖原等含α - 1 ，4 -葡萄糖基結合之多糖、或藉由澱粉酶或酸等予以部份水解所得澱粉糊精、麥芽糖糊精、麥芽寡糖等部分分解物。還可以隨意使用以分支酶等糖原分支酶（EC 2 · 4 · 1 · 18)處理此等含α — 1 ’ 4結合之葡糖糖質。以澱粉酶分解之部份分解物可用 Handbook of Amylases and Related Enzymes、Pergamon 〇 Press公司（東京）（1988年）所記載之α -澱粉酶（本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. -訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -19 - 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（17 ) E C 3.2.1.1)、冷一澱粉 (EC 3 . 2 .1 . 2)、麥芽三糖生成之澱粉酶 (EC 3.2.1.116)、麥芽四糖生成之澱粉酶 (EC 3 . 2 . 1 . 60) 、麥芽五糖生成之澱粉酶、麥芽六糖生成之澱粉酶（EC 3 · 2 . 1 . 98)等以澱粉酶分解之部份分解物。更可以在隨意調製部份分解物時使支鏈澱粉酶（pullulanase 3 . 2 . 1 . 4 1 )、異澱粉酶（E C 3 . 2 , 1 . 6 8 )等澱粉脫支酶作用。做爲基質之澱粉可爲玉米、小麥、米等榖類由來之地上澱粉 ’亦可爲馬鈴薯、番薯、樹薯等地下澱粉，較佳係用糊化及/或液化澱粉作成溶液。此澱粉之部份分解的程度係愈低，愈能提高環狀四糖之生成率，所以D E約2 0以下，較佳爲約1 2以下，更佳係以約5以下爲宜。基質之濃度並不特別限定，例如使用基質濃度0 . 1 % (以下在本說明書中除特別提示以外，以「％」表示「 w/w %」）之低濃度溶液，亦可進行本發明之酶反應，惟工業上係以1 %以上爲宜。又，基質溶液即使爲含有未完全溶解之不溶性基質於其中之形態的懸濁狀溶液亦無妨。較佳係濃度4 0 %以下，更佳係2 0 %以下爲宜。反應溫度係可進行反應之溫度，即可於6 5 °C附近之溫度進行。較佳係3 0〜5 5 °C附近之溫度。反應之p Η 係通常調整爲4 . 5〜8範圍，較佳係調整爲ρ Η約 5 . 5〜7範圍。反應時間視酶反應之進行適當地選擇。對於使本發明之多肽作用於其基質而生成之α -異麥 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) #· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 20 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（18 ) 芽糖基葡糖質，使α -異麥芽糖基轉移酶作用即可極容易製造大量之斯業界有用之環狀四糖。使α -異麥芽糖轉移酶作用之時期亦可在使本發明多肽作用，使該多肽失活後進行作用。較佳係倂用本發明之多肽與α -異麥芽糖基轉移酶使其作用。例如對澱粉或其部份分解物或糖原之水溶液，使本發明之多肽與α 一異麥芽糖基轉移酶倂用進行作用，即可以自每單位固體之澱粉或其部份分解物，以約 3 0 %以上之生成率，糖原時則以約8 0 %以上之生成率得環狀四糖。此倂用本發明之多肽與α _異麥芽糖基轉移酶予以生成環狀四糖之機作係自二者之反應特性推測應爲如下者。 (1 )本發明之多肽係對做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1 ，4蔔萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之糖質，例如澱粉、糖原、或此等之部份分解物等糖質之非還原末端之α - 1，4葡萄糖基作用，將葡萄糖基分子間轉移爲其他之非還原末端葡萄糖基的6位羥基、生成非還原末端具有α -異麥芽糖基之糖質。 (2 ) α -異麥芽糖基轉移酶係作用於非還原末端具有異麥芽糖基之糖質，使該異麥芽糖基分子間轉移於位在其他非還原末端，具有異麥芽糖基之糖質的非還原末端葡萄糖基之3位羥基、生成非還原末端具有異麥芽糖基一 1 ’ 3 -異麥芽糖之糖質。 (3 ) α -異麥芽糖基轉移酶係作用於其非還原末端具有異麥芽糖基- 1 ，3 -異麥芽糖基之糖質，藉由分子本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -21 - 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（19 ) 內轉移作用自上述糖質切離異麥芽糖基- 1 ，3 -異麥牙糖基，予以環狀化生成爲環狀四糖。 (4)在（3)中被切離異麥芽糖基一 1 ，3 -異麥芽糖基後之係再次經由（1 )〜（3 )的反應，生成環狀四糖，更重覆此等之反應，生成大量之環狀四糖而被蓄積〇如以上所述，藉由倂用本發明之多肽與α -異麥芽糖基轉移酶，如上述二者會重覆地作用於此等之基質，顯著地提高環狀四糖之生成率。又，此環狀四糖生成反應之際，亦可再倂用其他轉移酶，還可以更有利地實施，以提高環狀四糖之生成率。即，例如，倂用本發明之多肽與α -異麥芽糖基轉移酶作用於濃度約1 5 %的澱粉部份分解物時，可以約5 5 %之生成率得環狀四糖，但同樣之條件下倂用本發明之多肽與α -異麥芽糖基轉移酶，與環麥芽糖糊精葡聚葡糖基轉移酶之三者予以作用時，可以更提高約5〜1 0%單位基質固體對之環狀四糖的收率至約6 0〜6 5 %。上述經由反應所得溶液可做爲環狀四糖、或含其糖質之溶液直接使用。惟通常係再予精製使用。其精製方法可適當地採用公知之方法，例如藉活性碳脫色，精製、以Η 型、Ο Η型離子交換樹脂脫鹽、藉薄層層析、高速液體層析、離子交換管柱層析、活性碳管柱層析、矽膠管柱層析等管柱層析進行分餾，以醇類及丙酮等有機溶媒的分離，以具有適度分離性能之膜予以分離。更可以組合一種或二本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -22- 1269810 A7 B7 五、發明説明（20 ) 種以澱粉酶，例如α -澱粉酶、々-澱粉酶、葡糖澱粉酶 (EC 3 · 2 · 1.3)等或α —配糖酶 (E C 3 · 2 · 1 _ 20)等酶，分解殘存之其他糖質的方法，以酵母之發酵處理、鹼處理等以分解除去殘存之還原性糖質的精製方法。尤其環狀四糖之工業上大量製造方法係最適於使用離子交換樹脂之管柱層析，例如藉由特開昭 5 8 — 2 3 7 9 9號公報、特開昭5 8 - 7 2 5 9 8號公報等揭示之強酸性陽離子交換樹脂之管柱層析，除去夾雜糖類，可以有利地製造高純度之環狀四糖含量，或含其之糖質。追時可隨意地採用固定床方式，移動床方式，擬似移動床方式的任一方式。如上述所得之環狀四糖、或含其之糖質係濃縮後做爲糖漿狀製品。或予以乾燥成非晶質環狀四糖或含其之粉末狀糖質製品。又，製造環狀四糖結晶時係例如在有機溶媒存在下，在助晶罐中放入固體純度約5 0 %以上、固體濃度約3 0 %至9 0 %之高含環狀四糖之溶液，於單位固體約〇 . 1 〜2 0 %之環狀四糖晶種共存下，於9 5 t以下之溫度，較佳於1 0〜9 0 °C範圍一邊攪拌一邊自高溫緩緩冷卻爲低溫，製造含有結晶糖膏。自糖膏製造環狀四糖結晶，或含此糖質之方法可適當地採用例如塊狀粉碎方法、流動造粒方法，噴霧乾燥方法等公知方法。又，製造含蜜結晶之方法可適當地採用分蜜方法等。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 23- 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（21 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 如上所製造之環狀四糖係具有品位高且低甜味的非還原性之白色粉末或糖漿、極安定性，與其他材料，尤其與胺基酸、低聚肽、蛋白質等含胺基酸之物質混合，加工亦很少褐變或發生異臭，幾乎不會影響所混合之其他材料的物性。又，環狀四糖因具有包合能力，所以可防止香氣成份，有效成份等之揮發、防品質劣化，具極優異之保持安定化香氣成份、有效成份之效果。這時可視其需要與其他環狀糖質，例如環狀糊精類、分岐環狀糊精類、環狀葡聚糖類、環狀果聚糖類等倂用，藉由其包合能力可以極有利地實施強化安定性。除上述環狀四糖以外，環狀糊精等環狀糖質不必限定爲高純度者，即使爲低純度之環狀糖質，例如與多量之麥芽糊精一起含有各種環糊精之澱粉部份分解物亦可使用。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製另外，使用本發明之多肽所得之環狀四糖因實質上不會被澱粉酶或α -配糖酶所分解，所以既使經口攝取亦實質上不會被消化吸收，又，不易被腸內細菌發酵，可做爲極低熱量之水溶性食物纖維被利用。又，不易被蛀牙誘發菌所發酵，極適於利用做爲不易駐牙之甜味料。亦可利用做爲防止粉末狀物之附著、固結用劑。另外，因該環狀四糖本身係無毒、無害的天然甘味料，無任何危險性、爲極安定之甘味料。環狀四糖結晶製品時，可以與支鏈澱粉，羥乙基澱粉，及聚乙烯吡咯酮等結合劑倂用，利用於錠劑或糖衣片。另外還兼具有滲透調節性、賦形性、增光澤性、保濕性、粘性、防止其他糖之晶析性、難發酵性等有用本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -24- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（22) 之性質。因此用本發明之多肽所得環狀四糖，或含其之糖質係可直接做爲甘味料，調味改良劑、品質改良劑、安定劑、防變色劑、賦形劑等，有利地利用於飮食物、嗜好品、飼料、餌料、化粧品、醫藥品等之各種組成物。又，使用本發明之多肽所得環狀四糖或含其之糖質可直接做爲附甜味之調味料使用。視其需要可與粉糖膏、葡萄糖、果糖、異構化糖、砂糖、麥芽糖，海藻糖（α，α 一海藻糖、α，Θ -海藻糖、/3，/5 -海藻糖）、蜂蜜、楓糖、山梨糖醇、麥芽糖醇、二氫查耳酮、甜葉菊替、α -葡糖基甜葉菊苷、羅漢果甜味物、甘草、索馬精，L -天冬胺醯基苯丙胺酸曱酯、糖精、乙醯舒泛Κ、甘素、甘胺酸、丙胺酸等其他甘味料倂用，又，可以與糊精、潑粉、乳糖等類增量劑倂用。尤其與一種或二種以上赤蘚糖醇、木糖醇、麥芽糖醇等低熱量甘味料或α -葡糖基甜葉菊苷、索馬精、L -天冬胺醯基- L -苯丙胺酸甲酯、糖精、乙醯舒泛Κ及甘素等高甜味度甘味料倂用，極適於利用做爲低熱量甘味料或減肥甘味料等。又，使用本發明之多肽所得環狀四糖，或含其之糖質可直接，或視其需要與其他增量劑、賦形劑、或結合劑等混合，隨意成形爲顆粒狀、球狀、短棒狀、板狀、立體狀或錠劑等各種形狀使用。又，使用本發明之多肽所得環狀四糖，或含其之糖質的甘味可以與酸味、鹹味、澀味、鮮味、苦味等其他具有本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____ B7 五、發明説明（23 ) 加味之各種物質極易調和、耐酸性、耐熱性亦大，所以可以有利地利用於一般飮食物之增甜、加味改良，或品質改良用。例如對醬油、粉末狀醬油、味噌、粉末狀味噌、醪、醃料、撒料、美乃滋、沙拉調味品、食用醋、三杯醋、粉末壽司醋、中式調味料、沾醬、湯麵料、香醋、蕃茄醬、烤肉醬、咖哩原味、燉牛肉調味料、鮮味、湯味、複合調味料、米酣、新米酣、糖包、咖啡用糖包等各種調味料做爲甘味料、更可做爲加味改良劑、品質改良劑等利用。另外，還可做爲對例如煎餅、米菓、糯米菓、糯米點心、湯圓、豆餡點心、米糕、餡類、羊羹、水羊羹、二色卵、果凍、蛋糕、糖果等各種日式點心、麵包、餅乾、鹹餅乾、小餅乾、派、布丁、奶油、鮮奶油、泡芙、鬆餅、海棉蛋糕、甜甜圈、巧克力、口香糖、牛奶糖、奶油糖、糖果等各種西式點心、冰淇淋，凍果汁露等冰類、果實糖漬物、冰糖漿等糖漿類、花浸漬膏、花生醬、果醬等膏類、果醬、橘皮果醬、糖漿浸漬物、糖漬果實等果實、蔬菜的加工食品類、什錦醬菜、麯醃漬物、千層醃漬物、蕗薔醃漬物等醃漬物類、醃蘿蔔加味料、醃白菜加味料等醃漬加味料、火腿、小臘腸等畜肉製品類、魚肉火腿、魚肉小蠟腸、板魚、竹輪、炸魚漿等魚肉製品、海膽 '鳥賊內臟醃製品、酸海帶、魷魚絲、河豚米酣漬干、鳕魚、鯛魚、蝦等之肉鬆等各種珍味類、由海苔、山菜、魷魚、小魚、貝等所製造之小菜、煮豆、馬鈴薯沙拉、海帶捲等料理食品、乳製品、魚肉、畜肉、果實、蔬菜之瓶裝、罐頭類、合成本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-26- 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（24 ) 酒' 釀造酒、淸酒、果實酒、發泡酒、啤酒等酒類、咖徘、可可亞、果汁、碳酸飮料、乳酸飮料、乳酸菌飮料等淸涼飮料水、布丁粉、鬆餅粉、速食果汁、速泡咖啡、速食紅S湯、杯湯等速食食品，更可爲嬰兒副食品、病人餐、飮用劑、含肽食品、冷凍食品等各種飮食物的加甜味、加味改良、風味改良或品質改良等有利地利用。又，可做爲家畜、家禽、及其他、蜜蜂、蠶、魚等飼養動物之飼料、餌料等提高嗜好性等目的使用。除此外，還可做爲香煙、牙膏、口紅、唇霜、內服液、錠劑、舌片、肝油糖、口中淸涼劑、口中香劑、嗽口劑等固體物、膏狀、液狀等各種形態之嗜好品、化粧品、醫藥品等各種組成物之甘味劑、或加味改良劑、改口味劑，更可做爲品質改良劑、安定劑等有利地利用。做爲對品質改良劑或安定劑之用途可以有利地利用於極易喪失各種有用成份或活性之各種生理活性物質，或含其之健康食品及醫藥品等。例如可對干擾素α 、干擾素/?、干擾素r、腫瘤壤死因子α、腫瘤壞死因子冷、巨噬細胞游走阻斷因子、菌落刺激因子、轉移因子、間白素I I等含細胞分裂素液、胰島素、成長激素、催乳激素、紅血球生成素、卵細胞刺激荷爾蒙等含激素液、 BCG疫苗、日本腦炎疫苗、麻疹疫苗、小兒痳捧疫苗、痘苗、破傷風類毒素、毒蛇抗毒素、人免疫球蛋白等含生物製劑液、青黴素、紅黴素、氯黴素、四環素、金黴素、硫酸卡那黴素等含抗生素液、硫胺、核黃素、L -抗壞血酸、肝油、類胡蘿蔔素、麥角甾醇、生育酚等含維生素液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .#· 訂

-27- 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（25 ) 、EPA、DHA、花生四烯酸等高度不飽和脂肪酸或其酯衍生物、脂肪酶、酯酶、尿激酶、蛋白酶、/3 -澱粉酶、異澱粉酶、葡聚糖酶、乳糖酶等含酶液、藥用人參萃取物、鱉萃取物、綠藻萃取物、蘆薈萃取物、蜂膠萃取物等萃取物類或蜂王漿等各種生理活性物質，更可以在不失去病毒、乳酸菌、酵母等生菌膏等有效成份或活性之下，極容易製造爲高品質之液狀、糊狀、固體狀或粉末狀之健康食品、化粧品、醫藥品等。如上述之各種組成物中使其含使用本發明之多肽所得環狀四糖，或含其之糖質的方法係在該製品完成前的步驟中使其含有即可，例如可適當地選擇混溶、混揑、溶解、熔解、浸漬、滲透、撒佈、塗佈、被覆、噴霧、注入、晶析、固化等公知之方法。爲有其量係，含有0 _ 1 %以上，較佳爲1 %以上之爲宜。以下根據實驗例說明具有圓孢芽孢桿菌C 1 1株（ FERM BP — 714 4)、圓孢芽孢桿菌N75株（ FERM BP - 7591)及球形節桿菌A19株（ FERM BP — 7590)產生之α —異麥芽糖基葡糖質生成酶活性的多肽之理化學上性質分析，編碼具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的D Ν Α分析，以及利用該D N A以調製具有重組型α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的方法如下。實驗1 調製圓孢芽孢桿菌C11株由來之具有α-異麥 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^衣. 、1Τ

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -28- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 ___ B7 __ 五、發明説明（26 ) 芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽實例1 - 1 調製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇〇m 1由 4 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：paindex#4 )， 1 · 8w/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist)，〇 . lw/v% 磷酸二鉀、〇 . 〇6w/v% 磷酸—鈉· 1 2水鹽、〇 . 〇 5 w / v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌Cll (FERM BP — 7144)，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之培養基約2 0 f，加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，於2 7 °C保持於p Η 6 · 0〜8 · 0，通氣攪拌培養4 8小時。培養後之培養液中之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係約0 . 5 5單位/m 1 、α —異麥芽糖基轉移酶活性係約1 . 8單位/m 1 、測定此培養物以離心分離（1 0， 0〇0 r . p · m、3 0分鐘）回收之上澄液1 8 <的酶活性時，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係約0 . 5 1單位/m 1的活性（總活性約 9，18 0單位/)、α -異麥芽糖基轉移酶係約1 _ 7 單位/m 1活性（總活性約3 0，4 0 0單位）、兩種之酶活性均主要在培養上澄液中被檢出，獲知兩種均爲被分本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 B7 __ 五、發明説明（27 ) 泌至培養液中之分泌型酶。 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁) 又，上述種類的酶活性係如下測定者，α -異麥芽糠基葡糖質生成酶活性之測定係溶解麥芽糖三醇於1 0 0 mM乙酸緩衝液（ρΗ6 . 0 )使其爲2w/v%，做爲基質溶液。在〇 _ 5 m 1該基質溶液中加入0 . 5 m 1酶溶液，於3 5 °C進行6 0分鐘之酶反應。煮沸該反應液 1 0分鐘，停止反應後，以高速液體層析HP L C法定量其反應液中之該麥芽糖量。1 -異麥芽糖基葡糖質生成酶之活性1單位係以上述條件1分鐘生成1微莫耳之麥芽糠的酶量做爲定義者。又，Η P L C係用「Shodex KS-801」管柱（昭和電工公司製）、管柱溫度6 0 °C，液離液係水之流速0 , 5 m 1 /分鐘水之條件下進行’檢測係用示差折射計「R 1 — 8 0 1 2」（東曹公司製）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製又，α -異麥芽糖基轉移酶之酶活性的測定係將人參三糖溶解於1 0 0 m Μ乙酸緩衝液（ρ Η 6 _ 0 )使其爲濃度，做爲基質溶液。在0·5ml該基質溶液中加入0 . 5 m 1酶溶液，於3 5 °C進行3 0分鐘之酶反應。煮沸該反應液1 0分鐘，停止反應後’以葡萄糖氧化酶法定量該反應液之葡萄糖量。1單位^-異麥芽糖基轉移酶之酶活性係以上述條件下1分鐘內生成之1 #莫耳葡萄糖的酶量來表示。實驗例1 - 2 調製部份精製之酶標品以8 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗例1 一 1所得本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（28) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製培養上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（ lOOOOrpm，30分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 〇 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 . 5 )後對該緩衝液透析，得約4 1 6 m 1粗酶液。此粗酶液係具有8 4 4 0單位α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性與2 8 0 0 0單位之 α 一異麥芽糖基轉移酶活性。以使用Sepabeads FP-DA13凝膠（三菱化學公司製）的離子交換管柱層析處理。這時之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性成份、α -異麥芽糖基轉移酶活性成份均不會被Sepabeads FP-DA13凝膠吸附，二酶成份係被檢測出爲爲非吸附餾份。回收出非吸附餾份以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 0 )透析此酶液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacrye HR S-200 凝膠（Amasham· Pharmacia· Biotech 公司製）之親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。酶活性成份係會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ至〇 Μ硫銨濃度降低之直線梯度，繼而以0 m Μ至1 〇〇 m Μ麥芽糖四醇濃度上昇之直線梯度溶離時，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶與α -異麥芽糖基轉移酶係分離後溶離、α 一異麥芽糖基轉移酶活性係在硫銨之直線梯度的其濃度爲約0 . 3 Μ附近溶離，本發明之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在麥芽四糖之直線梯度的其濃度爲約3 0 m Μ附近溶離。在此分別收集α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份與α -異麥芽糖基葡糖質生成酶，活性餾份。分別做爲具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品，具有α -異本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐1 ~ "" 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（29 ) 麥芽糖基葡糖質轉移酶活性之部份精製酶標品回收，分別精製此等酶標品。實驗例1 - 3 精製具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 ) 透析實驗例1 - 2之方法所得具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品餾份，離心分離此透析液除去不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠疏水層析（凝膠量3 5 0 m 1 )處理。此酶活性成份會吸附於Butyl-Toyopearl 6 5 0M凝膠，於硫銨1 Μ至〇 Μ濃度降低之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約〇 . 3 Μ附近吸附之酶活性成份會溶離出，回收示有此酶活性之餾份。再以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 0 )透析此回收餾份，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用 Sephacryl HR S-200凝膠之親和性層析精製。將此精製之各步驟中具有α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之酶標品的酶活性量，比活性，收率示於表1。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -32- 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（3〇 ) 表 1 步驟 α-異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽活性量 (單位） α-異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 培養上澄液 9,180 0.14 100 硫銨鹽析後之透析液 8,440 0.60 91.9 離子交換管柱溶離液 6,620 1.08 72.1 親和性管柱溶離液 4,130 8.83 45.0 疏水管柱溶離液 3,310 11.0 36.1 親和性管柱溶離液 2,000 13.4 21.8 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 以含有7 · 5w/v%v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳檢定精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽標品的酶標品純度’結果蛋白帶係單一者，且純度高之多肽。實驗例1 - 4 具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽精製以含1 Μ硫銨磷酸緩衝液（ρ Η 7 · 0 )透析實驗例 1 - 2之方法所得之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之部份精製酶標品、離心分離此透析液、除不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopead 650Μ疏水層析（凝膠量3 5 0 m 1 )處理。此酶活性成份會吸附於Butyl-Toyopearl 650M 凝膠，於硫銨1 Μ至〇 Μ濃度減少的之直線梯度溶離之結果，在硫銨濃度約0 . 3 Μ附近會溶離出，收集示有此酶活性之餾份並回收。再以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐）訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 33- 1269810

7 B 五、發明説明（31 ) 液（p Η 7 · 0 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性層析精製。將此精製之各步驟中具有α -異麥芽糖基轉移之酶標品的酶活性量，比活性，收率示於表2。表 2 步驟 α -異麥芽糖基轉移酶多肽之活性量 (單位） ^ -異麥芽糖基轉移酶多肽之比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 培養上澄液 30,400 0.45 100 硫銨鹽析後之透析液 28,000 1.98 92.1 離子交換管柱溶離液 21,800 3.56 7L7 親和性管柱溶離液 13,700 21.9 45.1 疏水管柱溶離液 10,300 23.4 33.9 親和性管柱溶離液 5,510 29.6 18.1 以含有7.5w/v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳檢定精製之具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的酶標品純度，結果蛋白帶係單一者，且純度高之多肽。實驗例2 調製圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 0 〇m 1 4 . 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4)， 1 · 8w/v%酵母萃取物（商品名：Asa hi mist)，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -34 1269810 A 7 _ B7 _ 五、發明説明（32 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 · lw/v% 磷酸二鉀、〇 . 06w/v% 磷酸—鈉· 12水鹽、〇 . 〇5w/v%硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 7 5，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，於2 7 °C保持於P Η 6 . 0〜8 · 0，通氣攪拌培養4 8小時。測定培養後之培養物中的酶活性係約0 · 3 4單位/m 1 ，α -異麥芽糖基轉移酶活性係約 1 _ 1單位/ m 1、測定離心分離（1 0 0 〇〇 r p m， 3 0分鐘）回收此培養物之約1 8 <上澄液之酶活性結果 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係約〇 . 3 3單位/ ml (總活性約5，9 4 0單位）、α -異麥芽糖基轉移酶係約1 . 1單位/m 1活性（總活性約1 9，8 0 0單位）兩種酶之活性均主要在培養上澄液中檢測出，獲知兩種酶均爲被分泌至培養液中之分泌型酶。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製實驗例2 - 2 調製部份精製酶標品以8 0 %飽和硫銨液鹽析約1 8 <實驗例2 - 1之方法所得培養上澄液，於4 °C放置2 4小時後，離心分離（ 10， 000rpm，30分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 8 · 3 )後對該緩衝液透析，得約4 5 0 m 1粗酶液。此粗酶液中係具有本紙張尺度適财關家縣（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（33 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 4 7 1 0單位之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，約 15，7 0 0單位α -異麥芽糖基轉移酶活性。使用實驗 4 一 1記載之Sepabeads FP-DA13凝膠（三菱化學公司製）離子交換管柱層析處理此粗酶液。α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性成份係會吸附於Sepabeads FP DA13凝膠、α -異麥芽糖基轉移酶活性成份係不會吸附於Sepabeads FP DA 13凝膠，溶離爲非吸附餾份。繼而以N a C 1濃度〇 Μ 至1 Μ之直線梯度溶離時，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性成份係在N a C 1直線梯度之濃度約〇 . 2 5 Μ附近溶離。在此分別回收α -異麥芽糖基轉移酶活性餾份與α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性餾份，做爲具有α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品，具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製標品分別回收，分別精製此等之酶標品。實驗例2 - 3 精製具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活

性之多肽經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ鱗酸緩衝液（ρ Η 7 · 0 ) 透析實驗例2 - 2之方法所得具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品、離心分離此透析液，除去不溶物，以使用 Sepahacryl HR S-200 凝膠（Amasham· Pharmacia · Biotech公司製）之親和性層析（凝膠5 Ο Ο m 1 )處理。酶活性會吸附於Sepahacryl HR S-200凝膠，以1 Μ〜0 Μ降低濃度硫銨之直線梯度，再以〇 m Μ〜 1 0 OmM之濃度上昇之麥芽四糖直線梯度溶離時，α -本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1269810 A7 B7 __ 五、發明説明（34 ) 異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在麥芽四糖之直線梯度，於其濃度爲約3 0 m Μ附近檢測出餾份。回收、此酶活性之餾份。以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（Ρ Η 7 . 0 )透析此回收液、離心分離此透析液，除去不溶物，以使用東曹公司製Butyl-Toyopearl 650Μ凝膠之疏水層析 (凝膠量3 5 0 m 1 )處理。此酶會吸附於 Butyl-

Toyopearl 650M凝膠，以1 Μ〜0 Μ直線梯度之硫銨溶離時，於硫銨濃度約0 . 3 Μ附近溶離出吸附之酶，回收示有此酶活性之餾份。再次以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 7 . 0 )透析此回收液、離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性層析精製。此精製之各步驟中的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之酶標品的酶活性量，比活性、收率示於表3。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 、1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -37 - 1269810 A7 B7 五、發明説明（35 ) ^- ^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽之活性量 (單位） ^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 5¾¾液 5,940 0.10 100 後之透析液 4,710 0.19 79.3 ¢5¾管柱溶離液 3,200 2.12 53.9 柱溶離液 2,210 7.55 37.2 主溶離液 1,720 10.1 29.0 柱溶離液 1,320 12.5 22.2 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含有7 . 5 w/ v % v %濃度之聚丙傭醯胺的凝膠電泳檢定精製之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽標品的酶標品純度，結果蛋白帶係單一者，且純度高之多肽。實驗2 - 4 精製具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽以含1Μ硫銨之l〇mM磷酸緩衝液（ρΗ7 · 0) 透析實驗例2 - 2之方法所得具有α -異麥芽糖基轉移酶酶活性之部份精製酶標品，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用 Amasham · Pharmacia · Biotech 公司製之 Sephacrye HR S-200凝膠親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。酶活性成份係會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ〜0 Μ降低濃度之硫銨直線梯度溶離時，在約〇 . 3 Μ硫銨濃度附近之餾份檢出酶活性。回收此酶活性之餾份。另外以含1 Μ硫銨之1 0 m Μ磷酸緩衝液（ρ Η 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -38- 1269810 A7 ____ B7 _ 五、發明説明（36 ) 7 · 0 )透析此酶活性餾份，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Butyl-Toyopearl 650M凝膠的疏水管柱層析（凝膠量3 5 0 J )處理。此酶活性成份係會吸附於Butyl-Toyopead 650M 凝膠，以直線梯度 1 Μ 〜 0 Μ 濃度降低之硫銨直線梯度溶離時，於約〇 . 3 Μ硫銨濃度附近被溶離，回收具有此酶活性的餾份。以1 0 m M Tris -鹽酸緩衝液 (P Η 8 · 0 )透析此回收液，離心分離此透析液，除去不溶物，以使用Super Q-ToyoPearl 650C之凝膠的離子交換管柱層析（凝膠量3 8 0 m 1 )處理。此酶係不會吸附於 Super Q-Toyopead 650凝膠，溶離爲非吸附餾份，回收所得溶離留份，做爲精製酶標品。此精製之各步驟中具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之酶標品的活性量、比活性、收率示於表4。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表 4 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶多肽之活性量 (單位） α-異麥芽糖基轉移酶多肽之比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 培養上澄液 19,000 0.33 100 硫銨鹽析後之透析液 15,700 0.64 82.6 離子交換管柱溶離液 12,400 3.56 65.3 親和性管柱溶離液 8,320 11.7 43.8 疏水管柱溶離液 4,830 15.2 25.4 離子交換管柱溶離液 3,850 22.6 20.3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -39- 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（37 ) 以含有7·5w/v%濃度之聚丙烯醯胺之SDS— 聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測具有精製之異麥芽糖基轉移酶活性的酶標品的純度，結果蛋白帶係單一者，可知爲純度極高之多肽。實驗例3 調製來自球形節桿菌A 1 9株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽在5 0 0m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇 0J由 4 . 〇w / v%澱粉部份分解物（商品名：paindex#4)， 1 · 酵母萃取物 Asahimist) ，0 · lw/v% 磷酸二鉀、〇 _ 〇6w/v%磷酸一鈉· 12水鹽、 0 _ 0 5 w / v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，冷卻後接種球形節桿菌 A 1 9株，於2 7 °C、2 3 0 r d m旋轉振盪培養4 8小時後，得種培養液。在3 0 <容量之發酵器中放入與種培養時一樣組成之培養基約2 0 <，加熱殺菌，冷卻爲2 7 °C後接種1 v / v %種培養液，保持於溫度2 7 °C、p Η 6 · 0〜9 _ 0 ，通氣攪拌培養4 8小時。培養後測定培養液中的酶活性係約1 · 7單位/m 1 ，α -異麥芽糖基轉移酶活性係約 1·7單位/ml、離心分離（1〇，OOOrpm， 3 0分鐘）此培養物，回收之上澄液1 8 ^的酶活性經測定之結果，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係約 1 . 0 6單位/ m 1 (總活性約1 9，1 0 0單位）、^ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) .^^衣. 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） _ -40 - 1269810 A7 ___B7 五、發明説明（38 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -異麥芽糖基轉移酶活性係約1 · 6單位/ (總活性約 2 8，8 0 0單位），二種酶活性均主要在培養上澄液中被檢測出，由此可知二種酶均爲被分泌至培養液之分泌型酶。又’球形節桿菌A 1 9株由來之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之活性測定係做爲基質用緩衝液使用1 〇〇 m Μ 甘胺酸一 N a〇Η緩衝液（ρ η 8 · 4 )，除此外，其他均與實驗例1之方法一樣。實驗例3 - 2 調製部份精製酶標品以6 0%飽和硫錢液鹽析約1 8彡實驗例3 - 1之方法所得培養上澄液，於4 t放置2 4小時後，離心分離（

1 0，0 0 0 r p m，3 0分鐘）該鹽析沈澱物並回收，溶解於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 . 0 )後對該緩衝液透析，得約8 5 0 m 1粗酶液。此粗酶液係具有 8， 210單位α-異麥芽糖基葡糖質生成酶活性、與經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 15，7 0 0單位之α -異麥芽糖基轉移酶活性。以使用東曹公司製之DEAE— Toyopearl 65 0S凝膠之離子交換管柱層析（凝膠量3 8 〇m 1 )處理此粗酶液。結果兩種酶活性係會吸附於D E A E — Toyopearl 650S凝膠，以自〇 Μ 至1 Μ N a C 1濃度之直線梯度溶離，結果α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在N a C 1之直線梯度下於其濃度約0 . 2 Μ附近溶離，α -異麥芽糖基轉移酶活性係在 N a C 1之直線梯度下於其濃度約〇 . 3 Μ附近溶離。在本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -41麵 1269810 A7 _________ B7 __ 五、發明説明（39 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此分別回收α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性餾份與^ -異麥芽糖基轉移酶活性餾份，分別做爲具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品，具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之部份精製酶標品回收，分別精製此等酶標品。實驗例3 — 3 實驗例3 - 3 精製具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽以含1 Μ硫銨之1 〇 m Μ磷酸緩液（ρ Η 7 . 〇 )透析實驗例3 - 2之方法所得具有^-異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之部份精製酶標品。離心分離此透析液除去不溶物後，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。此酶活性成份會吸附於經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ至〇 Μ降低濃度硫酸銨之直線梯度溶離，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性係在硫酸銨之直線梯度下其濃度爲約0 . 2 Μ附近被檢出餾份，回收此酶活性之餾份，得精製酶標品。此精製之各步驟中的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶標品的酶活性量，比活性、收率示如表5。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -42- 1269810 A7 B7 五、發明説明（4〇 ) 表 5 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶多肽活性量 (單位） α-異麥芽糖基轉移酶多肽比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 培養上澄液 19,100 0.11 100 硫銨鹽析後之透析液 8,210 0.48 43.0 離子交換管柱溶出液 6,890 4.18 36.1 親和性管柱溶離液 5,220 35.1 27.3 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以含有7·5w/v%濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳檢定精製。α -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽標品純度，結果蛋白帶係單一，且純度高之多肽。實驗例3 - 4 具有α -異麥芽糖基轉移酶活性之多肽的部份精製以含1Μ硫銨之1 OmM磷酸緩液（ρΗ7 . 0)透析實驗例3 - 2之方法所得具有α -異麥芽糖基轉移酶活性的剖份精製酶標品，離心分離此透析液以除去不溶物後，以使用Sephacryl HR S-200凝膠之親和性管柱層析（凝膠量5 0 0 m 1 )處理。此酶活性成份會吸附於Sephacryl HR S-200凝膠，以1 Μ至0 Μ降低濃度之硫酸銨直線梯度溶離，結果在硫酸銨濃度約0 Μ附近餾份檢出此酶活性，回收顯示此酶活性的餾份，做爲部份精製酶標品。此精製之步驟中的具有α 一異麥芽糖基轉移酶之酶標品的酶活性量，比活性、收率示於表6。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^^衣_ 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -43- 1269810 A7 B7 五、發明説明（41 ) 表 6 步驟 α-異麥芽糖基轉移酶之多肽活性量 (單位） α-異麥芽糖基轉移酶之多肽比活性 (單位/mg蛋白）收率 (%) 培養上澄液 28,800 0.18 100 硫銨鹽析後之透析液 15,700 0.97 54.5 離子交換管柱溶出液 7,130 4.01 24.8 親和性管柱溶離液 1,800 11.9 6.3 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 以含有7 . 5 w/ v %濃度之聚丙烯醯胺的凝膠電泳定部份精製之具有α -異麥芽糖基轉移標品的酶標品純度，結果除主要蛋白帶以外，尙看到三種次要之蛋白帶。實驗例4 一 1 對各種糖質之作用經濟部智慧財產局員工消費合作社印製使用各種糖質試驗是否可成爲^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽的基質。調製麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、異麥芽糖、異麥芽三糖、人參三糖（6 - α -葡萄基麥芽糖）、異人參三糖、海藻糖、麴二糖、黑麴糖、新海藻糖、纖維二糖、龍膽二糖、麥芽糖醇、麥芽三醇、乳糖、蔗糖、erlose、selaginose 麥芽糖基糖苷、異麥芽糖基糖苷之溶液。對此等溶液之每 1 g基質固體分別添加2單位實驗例1 - 3之方法所得來自圓孢芽孢桿菌C 1 1株之精製之α -異麥芽糖基葡糖質本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） 44 1269810 A7 B7 五、發明説明（42 ) 生成酶多肽標品，或實驗例2 - 3之方法所得來自圓孢芽孢桿菌N 7 5株之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶多肽標品，或實驗例3 - 3之方法所得來自球形節桿菌A 1 9 株的精製α -異麥芽糖基轉移酶多肽標品，調製爲2 w/ ν %基質濃度，於3 0 °C，ρ Η 6 . 0 (球形節桿菌 A 1 9株由來之酶係ρ Η 8 . 4 )反應2 4小時。以做爲展開溶媒用正丁醇、吡啶、水混液（容量比6 : 4 : 1 ) 、薄層板用「Keessel gel 60」（Alumiplate，20x 20cm 墨克公司製）展開二次後，以硫酸-甲醇使糖質發色檢測，確認是否對各糖質有無酶作用，結果示於表7。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS )域格⑺OX歸楚） 1269810 A7 Ώ7 五、發明説明（43 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表 7 基質 ______ 酵素作用 C11株酶 N75株酶 A19株酶麥芽糖 + + + 麥芽三糖 + + +十十+ 麥芽四糖 + + + + + + + + + 麥芽五糖 + + + + + + + + + 麥芽六糖 + + + + + + + + + 麥芽七糖 + + + + + + + + + 異麥芽糖 — — — 異麥芽三糖 — __ — 人參三糖 —— — — 異人參三糖 + + + + + + 海藻糖 — —— — 麴二糖 + + + 黑麴糖 + + + 新海藻糖 + + + 纖維二糖 — — — 龍膽二糖 — — — 麥芽糖醇 — — — 麥芽糖三醇 + + + 乳糖 — — — 蔗糖 — — — erlose + + + selaginose — — — 麥芽糖基糖苷 + + + + + + 異麥芽糖基糖苷 — — — (註）酶反應前後「-」表示未變化、 +」表示反應後基質斑點稍減少，確認有其他生成物 + +」表示質斑點已顯著減少，確認有其他生成物 + + +」係表示基質斑點已完全消失，確認有其他生成物 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼ 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 1269810 A7 B7 五、發明説明（44 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 由表7之結果可知，具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽可以對試驗之各種糖質中的葡萄糖聚合度3 以上，非還原末端具有麥芽糖構造之糖質充分地作用。又 ’對葡萄糖聚合度爲2之糖質則獲知亦可稍作用於麥芽糖、麴二糖、黑麴糖、新海藻糖、麥芽糖三醇、erl〇se。實驗4-2 自麥芽寡糖之生成物

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對濃度1 %之麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖’分別以每1 g固體單位加入2單位（麥芽糖及麥芽三糖）、0.2單位（麥芽四糖）、0.1單位（麥芽五糖 )之實驗例1 - 3之方法所得具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，於3 5 t：、ρ Η 6 . 〇作用8小時，保持於1 0 0 °C 1 0分鐘停止反應。使用Η P L C法測定此酶反應液之糖組成。HP L C係用YMC Pack ODS — AQ303管柱（Y _M. C公司製造），在管溫度4 0 °C ’流速〇 · 5 mC /分鐘之條件下進行，檢測係使用不差折射法R I - 8 0 12 (東曹公司製造）進行。結果示於表8。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） "47- 1269810 A7 B7 五、發明説明（45 ) 表 8 反應後生成之糖質種類基質麥芽糖麥芽三糖麥芽四糖麥芽五糖葡葡糖 8.5 0.1 0.0 0.0 麥芽糖 78.0 17.9 0.3 0.0 麥芽三糖 0.8 45.3 22.7 1.9 麥芽四糖 0.0 1.8 35.1 19.2 麥芽五糖 0.0 0.0 3.5 34.4 麥芽六糖 0.0 0.0 0.0 4.6 異麥芽糖 0.5 0.0 0.0 0.0 葡萄糖基麥芽糖 8.2 1.2 0.0 0.0 葡葡糖基麥芽三糖 2.4 31.5 6.8 0.0 X 0.0 2.1 30.0 11.4 Υ 0.0 0.0 1.4 26.8 Ζ 0.0 0.0 0.0 1.7 其他 0.6 0.1 0.2 0.0 表中 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼ 、1Τ

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製葡萄糖基麥芽糖係α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，62 -◦一α-葡萄糖基麥芽糖、人參三糖）、葡萄糖基麥芽三糖係指α -異麥芽糖基麥芽三糖（別名，63 — ◦一 α -葡萄糖基麥芽三糖）、 X係經此實驗例已獲知構造之α -異麥芽糖基麥芽三糖 (別名，64 —〇—α —葡萄糖基麥芽四糖）、 Υ係經此實驗例已獲知構造之α -異麥芽糖基麥芽四糖本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） -48- 1269810 A7 ____ B7 五、發明説明（46 ) (別名，65 - ◦一 α -葡萄糖基麥芽五糖）、 Ζ係未鑑定之糖質。由表8可知，使具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽作用結果，自基質麥芽糖主要可生成葡萄糖與α -異麥芽糖基葡萄糖（別名，62 - ◦- α -葡萄基麥芽糖、人參三糖），自基質麥芽三糖主要可生成麥芽糖與α-異麥芽糖基葡萄糖（別名，63 - - ^ 一葡萄糖基麥芽三糖）、少量生成葡萄糖、麥芽四糖、、-異麥芽糖基葡萄糖（別名，6 2 - ◦一 α -葡萄糖基麥芽糖）及生成物X，獲知自基質麥芽四糖主要可生成麥芽三糖與生成物X，其他還可生成少量之麥芽糖、麥芽五糖、α -異麥芽糖基葡萄糖 (別名，63 -〇一 α —葡萄糖基麥芽四糖）及生成物Υ。自基質麥芽五糖主要生成麥芽四糖與生成物Υ、其他還可生成少量之麥芽三糖、麥芽六糖、主成物X、生成物Ζ。單離、精製自基質麥芽四糖之生成物的生成物X、以及自基質麥芽五糖之主生成物的生成物Υ。使用分離用 HPLC 管柱 YMC - Pack 〇DS — A R355 — 1 5 S - 1 5 12A (Υ·Μ· C公司製）精製、單離生成物X、Y，自上述麥芽四糖之反應物’自麥芽五糖之反應物分別以固體物收率約8 · 3 %單離純度9 9 . 9 % 以上之生成物X標品，以固體物收率約1 1 . 5 %單位純度9 9 · 9%以上之生成物Y。依常法進行甲基化分析與N M R分析此等生成物X及生成物Υ。甲基化分析之結果示於表9。N M R分析之結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公董了 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -49- 1269810 A7 B7 五、發明説明（47 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 果係1H—NMR譜示於第1圖（生成物X)、第2圖（生成物Y) 、13C — NMR譜示於第3圖（生成物X)、第 4圖（生成物Y)，將生成物X、Y之歸屬示於表1〇。表1 0 分析甲基化物之種類組成比生成物X 生成物Υ 2,3,4-三甲基化物 1.00 1.00 2,3,6-三甲基化物 3.05 3.98 2,3,4,6-四甲基化物 0.82 0.85 由此等結果可知，具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的自麥芽四糖的生成物X係在麥芽四糖之非還原末端葡萄糖之6位羥基有葡萄糖基予以α結合的五糖，爲構造式1所示之α -異麥芽糖基麥芽四糖（別名， 64 — ◦- α —葡萄糖基麥芽四糖）。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製構造式1 : α-D-Glcp - (1^6) - a- D- Glcp

—(1 — 4) — a — D — G1 cp — (1 — 4) — a — D —Glcp— (1-^4)— D — Glcp 又，獲知自麥芽五糖之生成物Y係麥芽五糖之非還原末端葡萄糖之6位羥基上有葡萄糖基予以α結合的六糖，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） 1269810 A7 B7 五、發明説明（48 ) 以構造式2所示α -異麥芽糖基麥芽四糖（別名，6 5-〇 -α-葡萄糖基麥芽五糖）者。構造式2 :

a -D — G 1 c p - ( 1 -> 6 ) — a -D - G 1 c P -( 1 —4 ) — a 一 D - G 1 C P - ( 1 —4 ) — OL 一 D 一 G 1 c p — ( 1 —4 ) — a — D - G 1 c p - ( 1 - 4 )一 D 一 G 1 C P (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 1269810 A7 B7 五、發明説明（49 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製表1 0 葡萄糖號碼碳號碼 NMR化學轉移値（ppm) 生成物X 生成物Υ A la 100.8 100.8 2a 74.2 74.2 3a 75.8 75.7 4a 72.2 72.2 5a 74.5 74.5 6a 63.2 63.1 B lb 102.6 102.6 2b 74.2 74.2 3b 75.8 75.7 4b 72.1 72.1 5b 74.0 74.0 6b 68.6 68.6 C 1 c 102.3 102.3 2c 74.2 74.2 3c 76.0 76.0 4c 79.6 79.5 5c 73.9 73.9 6c 63.2 63.1 D Id 102.2 102.3 2d 74.0( a ),74.4( β ) 74.2 3d 76.0 76.0 4d 79.8 79.5 5d 73.9 73.9 6d 63.2 63.1 E 1 e 94.6( a ),98.5(/3 ) 102.1 2e 74.2( a ),76.7( β ) 74.0( α ),74.4( /3 ) 3e 75.9( a ),78.9( β ) 76.0 4e 79.6(α ),79.4(^ ) 79.8 5e 72.6( a ),77.2( β ) 73.9 6e 63Λ{α ),63.4(/3 ) 63.1 F If 94·6(α )，98·5(幻 2f 74.2( α ),76.7( /3 ) 3f 76.0( α ),78.9( yS ) 4f 79.6( α ),79.4( /3 ) 5f 72.6( α ),77.2( β ) 6f 63.4(α ),63.4(β ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家襟準（CNS ) A4規格（21 OX297公釐） -52 - 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7 五、發明説明（50 ) 由以上可知，具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽對於麥芽寡糖之作用係如以下者。 (1 )具有α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽係會作用於做爲基質之做爲非還原末端結合樣式具有α -1，4葡萄糖基結合之葡萄糖聚合度爲2以上之麥芽寡糖，具有會觸媒將該非還原末端之葡萄糖殘基轉移至其他分子之非還原末端葡萄殘基的6位之作用的分子間6 -葡萄糖基轉移，生成非還原末端上具有6 -〇- α -葡萄糖基之葡萄糖聚合度爲增加1之α -異麥芽糖基葡萄糖質（別名6-◦-α葡萄糖基麥芽寡糖）、與葡萄聚合度減少1 之麥芽寡糖。 (2 )具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽可稍作爲觸媒進行4 -葡萄糖基轉移，可以自麥芽寡糖稍生成葡萄糖聚合度增加1之麥芽寡糖、與葡萄糖聚合度減少1之麥芽寡糖。實驗例4 - 3 還原力生成試驗爲調查具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽是否具有還原力生成能力進行以下試驗。即，在最後濃度 1 %之麥芽四糖水溶液中，對每1 g基質固體添加〇 . 2 5單位實驗，實驗例1 一 3之方法所得來自圓孢芽孢桿菌C 1 1株之精製α _異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽標品，實驗例2 - 3之方法所得來自圓孢芽孢桿菌 Ν 7 5之精製α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽標品及本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-53- 1269810 A7 五、發明説明（51 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實驗例3 - 3之方法所得來自球形節桿菌A 1 9株的精製 α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽標品，於3 5 °C， PH6 . 〇 (球形節桿菌a 19株由來之酶時係pH 8 · 〇 )作用，經一段時間採取一部份該反應液，保持於 1 〇〇 °c 1 〇分鐘停止反應，測定反應液之還原力。即以Somogyi-Nelson法測定此酶反應前後之溶液還原糖量。另外，同時又用蒽酮法測定此酶反應前後之溶液之全糖量。返原力生成率（％)係使用如下所75計算式算出’結果一倂示於表1 1。計算式：潛原力年成步r 07、「反應後之還原糖量1「反應則之^原糖里1 V 1 ΠΠ 超原力4成率(％) = [—麵之全-糖]X 100 表反應時間還原力率（％) (小時） C11株酶 Ν75株酶 Α19株酶 0 0.0 0.0 0.0 1 0.1 0.1 0.0 2 0.0 0.0 0.1 4 0.1 0.0 0.0 8 0.0 0.1 0.1 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製由表1 1之結果可知，具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽係以麥芽四糖爲基質作用時實質上不會增 -54- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（52 ) 加反應物之還原力、獲知該具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽不會具有水解作用，或僅爲無法檢測出之少量者。實驗例4一4 分子量將實驗例1 - 3之方法精製所得圓孢芽孢桿菌c 1 1 株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，實驗例2 - 3之方法精製所得圓孢芽孢桿菌Ν 7 5株的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽、或實驗例3 - 3之方法精製所得來自球形節桿菌A 1 9株的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽供予S D S -聚丙烯醯胺電泳法（凝膠濃度7 . 5 w/ ν % )，與同時電泳之分子量標識物（日本Bio-rad · Laboratrys公司製）比較，測定此酶多肽之分子量，結果C 1 1株由來之該多肽的分子量係約140， 000±20， 000達爾頓、N75 株由來之該多肽的分子量係約1 3 6，0 0 0 ± 2 0，0 0 0達爾頓、A 19株由來之該多肽的分子量係約 94， 0 0 0±20， 000 達爾頓。實驗例4 — 5 等電點以含有 2 w / v % Ampholine ( Amasham Phamacia Biotech公司製）之等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法測試將實驗例1 - 3之方法精製所得圓孢芽孢桿菌C 1 1株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，實驗例2 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐Ί ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 B7 五、發明説明（53 ) - 3之方法精製所得圓孢芽孢桿菌N 7 5株的具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽、或實驗例3 - 3之方法精製所得來自球形節桿菌A 1 9株的具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，測定電泳後之蛋白帶及凝膠之ρ Η，求得該酶多肽之等電點。結果c 1 1株由來之該多肽的等電點係ρ 1約5 . 2 ± 0 . 5、Ν 7 5株由來之該多肽等電點係Ρ 1約7 . 3 ± 0 . 5、A 1 9株由來之該多肽的等電點係ρ 1約4 . 3 土 0 . 5。

實驗例4 一 6 作用溫度及pH 針對α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性影響之溫度與 Ρ Η，在各種溫度、ρ Η條件下，依照實驗例一 1所示 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之活性測定方法調查。溫度之影響係在C a 2 +不存在下與1 mM存在下測定。此等結果示於第5圖〔溫度之影響（C 1 1株由來之多肽）〕、第6圖〔溫度之影響（N75株由來之多肽）〕、第7圖〔溫度之影響（A19株由來之多肽）〕、第8圖〔pH 之影響（C 1 1株由來之多肽）〕、第9圖〔ρ Η之影響 (Ν75株由來之多肽）〕、第10圖〔pH之影饗（ A19株由來之多肽）〕、結果C11株由來之具有α-異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之酶標品的至適溫度係ρ Η 6 . 0，60分鐘反應下爲約45°C (Ca2 +不存在）或約50°C(lmM Ca2 +存在），其至適pH係35t：反應6 0分鐘爲約6 . 0。N7 5株由來之具有α -異麥本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐1 二— -56 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（54 ) 芽糖基葡糖質生成酶活性之酶標品的至適溫度係p Η 6 · 0，60分鐘反應下爲約50°C (Ca2 +不存在）或約55°C (ImM Ca2 +存在），其至適pH係35°C 反應6 0分鐘爲約6 · 0。A1 9株由來之具有α —異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之酶標品的至適溫度係ρ Η 8 · 4，60分鐘反應下爲約6 0°C (Ca2 +不存在）或約6 5 °C ( 1 m M C a 2 +存在），其至適ρ Η係6 5 t：反應6 0分鐘爲約8 . 4。實驗例4 - 7 安定性具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的溫度安定性係使含有該多肽溶液（2 0 m Μ乙酸緩衝液、ρ Η 6 . 0 ( A 1 9株由來之多肽時係2 0 m Μ甘胺酸 —Na〇H緩衝液、ΡΗ8 · 0)〕在Ca2 +不存在下或 ImM C a 2 +存在下保持於各溫度6 0分鐘，水冷後，測定殘存之α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性以求得。又，Ρ Η安定性係在各ρ Η之5 0 m m Μ緩衝液中保持具有 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽於4它，2 4小時後，調整ρΗ6 · 0 (A19株由來之多肽時係pH 8 · 0 )，測定殘存之酶活性以求得。結果示於第1 1圖〔溫度安定性（C 1 1株由來多肽）〕、第1 2圖〔溫度安定性（N 7 5株由來多肽）〕、第1 3圖〔溫度安定性 (A 1 9株由來多肽）〕' 第1 4圖〔ρ Η安定性（ Cll株由來多肽）〕、第l5圖〔pH安定性（N75 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） · ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-57- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 __ 五、發明説明（55 ) 株由來多肽）〕、第16圖〔pH安定性（A19株由來多肽）〕、C11株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的溫度安定性係約4 0 t爲止（C a 2 +不存在下）或至約45°C(lm Ca2 +存在下），而該酶之pH安定性係約5 · 0至1 0 . 0，N75株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的溫度安定性係約4 5 °C爲止（C a 2 +不存在下）或至約5 0 °C ( 1 m Ca2 +存在下），而該酶之pH安定性係約5 . 0至 9 · 0，A1 9株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的溫度安定性係約5 5 °C爲止（C a 2 +不存在下）或至約60°C(lm Ca2 +存在下），而該酶之 p Η安定性係約5 . 0至9 . 0。實驗例5 部份胺基酸序列實驗例2 - 3之方法精製所得C 1 1株由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性的多肽，實驗例2 - 3之方法精製所得來自Ν7 5由來之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，或實驗例3 - 3之方法精製所得來自A 1 9株之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽，結果獲知來自C 1 1株之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽係具有序列7所示胺基酸序列，來自 Ν 7 5株之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽係具有序列1 9所示胺基酸序列，來自A 1 9株之具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽係具有序列2 6所本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-58- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（56 ) 示胺基酸序列。實驗例5 - 2 來自C 1 1株之多肽的內部胺基酸序列以1 0 m M Tds —鹽酸緩衝液（ρΗ9 · 0)透析實驗例1 - 3之方法精製所得一部份具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽後，以同緩衝液稀釋透析液使其爲約1 m g / m 1濃度。在1 m 1此試料液中加入1 〇 // g 胰蛋白酶（和光純藥公司販售），於3 0 °C，反應2 2小時予以肽化。爲單離生成之肽進行逆相Η P L C。使用 microbondapackC18 管柱（直徑 2 . lmmx 長度 1 5 0 m m，Waters公司製），以流速0.9ml /分鐘，室溫下，以0 . 1%三氟化乙酸一 8%乙腈溶液至0 · 1%三氟化乙酸- 4 0 %乙腈溶液之以1 2 0分鐘移行之直線梯度條件下管柱分餾肽。自管柱溶離之肽係經測定波長 2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其他肽充分被分離之1 0個肽〔（P 8 (保持時間約8分鐘）、P 2 0 (保持時間約2 0分鐘）、P 5 6 (保持時間約5 6分鐘）、 P 6 0 (保持時間約6 0分鐘）、P 6 2 (保持時間約 62分鐘）、P64 (保持時間約64分鐘）、P75 ( 保持時間約7 5分鐘）、P 8 2 (保持時間約8 2分鐘）、P 8 8 (保持時間約8 8分鐘）、P 9 9 (保持時間約 9 9分鐘）、真空乾燥各含有多肽之餾份後，溶解於2 0 //1之0 . 1%三氟化乙酸一 5 0%乙腈溶液。以蛋白質序列儀測各種肽，分別分析胺基酸序列至8殘基，結果得本紙張尺度適用中國國家標準（⑽）峨格（21〇謂公幻 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（57 ) 序列表8至1 7所示胺基酸序列。實驗例5 - 3 來自N 7 5株之多肽的內部胺基酸序列以1 〇 m M Tds —鹽酸緩衝液（ρ Η 9 . 0 )透析實驗例2 - 3之方法精製所得一部份具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽後，以同緩衝液稀釋使其爲約1 m g / m 1濃度。在1 m 1此試料液中加入2 0 // g賴胺醯基肽鏈內切酶（和光純藥公司販售），於3 0 °C，反應 2 4小時予以肽化。爲單離生成之肽進行逆相Η P L C。即，使用microbondapack C18管柱（直徑3 · 9mmx長度 1 5 0 m m，Waters公司製），以流速0. 9ml /分鐘，室溫下，以0' 1 %三氟化乙酸一 8 %乙腈溶液至 0 . 1 %三氟化乙酸一 3 6 %乙腈溶液之移行1 2 0分鐘之直線梯度條件下管柱分餾肽。自管柱溶離之肽係經測定波長2 1 0 n m吸光度而檢測出。分離出與其他肽充分被分離之四個肽〔P N 4 7 (保持時間約4 7分鐘）、 P N 5 9 (保持時間約5 9分鐘），P N 6 7 (保持時間約6 7分鐘）、P N 8 7 (保持時間約8 7分鐘）〕，分別真空乾燥各含有多肽餾份後，溶解於2 0 0 // 1之 0 . 1 %三氟化乙酸—5 0 %乙腈溶液。以蛋白質序列儀測此等肽，分別分析胺基酸序列，結果得序列表2 0至 2 4所示胺基酸序列。實驗例5 - 4 來自A 1 9株之多肽的內部胺基酸序列本紙張尺度適用中_標準（CNS ) μ規格（別>< 釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（58 ) 以1 0 m M Tris —鹽酸緩衝液（ρίί9 , 〇)透析實驗例3 - 3之方法精製所得一部份之具有α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽’以同緩衝液稀釋使其爲約1 m g / m 1濃度。在1 m 1此試料液中加入2 〇 # g賴胺醯基肽鏈內切酶（和光純藥公司販售），於3 0 °C，反應 2 4小時予以肽化。爲單離生成之肽進行逆相η P L C。即，使用microbondapack C18管柱（直徑2 . lmmx長度 1 5 0 m m，Waters公司製），以流速〇 · 9 m 1 /分鐘，室溫下，以0 . 1%三氟化乙酸一 16%乙腈溶液至 0. 1%三氟化乙酸一 3 6%乙腈溶液之12 0分鐘行之直線梯度條件下管柱分餾份。自管柱溶離之肽係經測定波長2 1 0 nm吸光度而檢測出。分離出與其他肽充分被分離之五個肽〔P 3 9 (保持時間約3 9分鐘），P A 8 1 (保持時間約8 1分鐘）、P A 8 6 (保持時間約8 6分鐘）P A 9 2 (保持時間約9 2分鐘）、P N 1 0 4 (保持時間約1 0 4分鐘）〕，分別真空乾燥各含有肽餾份，溶解於2 0 0// 1之0 · 1%三氟化乙酸—5 0%乙腈溶液。以蛋白質序列儀測此等肽試料，分別分析胺基酸序列，結果得序列表2 7至3 1所示胺基酸序列。實驗例6 調製包含可編碼圓孢芽孢桿菌C 1 1株由來之多肽的D N A之重組D N A與轉形體

實驗例6 - 1 調製染色體D N A 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-61 - 1269810 A7 B7 五、發明説明（59 ) 在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇 1由 2 · Ow/ν%澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4 ) ’ 1 . 〇w / v%酵母卒取物（商品名· Asahimist) ’ 0 . lw/v% 磷酸二鉀、〇 . 〇6w/v% 磷酸—鈉· 1 2水鹽、0 · 0 5 w/ v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌20分鐘’經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌C 1 1株，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養2 4小時。其後離心分離自培養物採取菌體，使其浮遊於TES緩衝液（ρΗ8·0)，加入0_05w / > %溶菌酶，於3 7 °C培養3 0分鐘。於一 8 0 °C凍結 1小時處理物，加入T S S緩衝液（p Η 9 _ 0 )，加溫 6 0 t T E S緩衝液/酚混合液，在冰水中一邊冷却一邊用力振盪5分鐘後，離心分離採取上澄液。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之精染色體DNA，溶解於S S C緩衝液（p Η . 7 . 1 )後，分別加入 7 . 5//g或125//g之核糖核酸酶與蛋白酶，於37 °C培養1小時使其反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液萃取染色體D NA，加入冷乙醇，採取食生成之染色體 D N A的沈澱。溶解所得精製染色體D N A於S S C緩衝液（P Η 7 · 1 )使其爲濃度約1 m g / m 1 ，凍結溶液爲-8 0 °C。實驗例6 - 2 調製轉形體B G C 2 取1 m 1實驗例6 - 1調製之精製染色體DNA溶液本^張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -62 - 1269810 A7 B7 五、發明説明（60 ) ，在其中加入約3 5單位之限制酶s a u 3 A I，於 3 7 °C反應2 0分鐘部份分解染色體D N A後，以蔗糖密度梯度離心法採取約2 0 〇〇至6 0 〇〇鹽基對所成 D N A片段。另外，依常法使限制酶B a m Η I作用於質體體「Bluescript II SK ( + )」Stragean · cloning · System 公司製），使其完全切斷後，使用「DNA Hgation組套」（寶酒造公司製），依其所附說明書操作連接〇 . 5 // g該被切斷之質體載體與約5 // g先前所得〇 N A片段，使用所得重組D N A，依一般之感應細胞（Competent cell )法轉形 1 0 0 // 1 感應細胞「Epicurian Coli XL2-Blue」（ Stragean· Cloning· System公司製）製作基因庫。將所得基因庫之轉形體植菌於依常法調製之含1 0 g / 1胰蛋酶水解腺，5g/l酵母萃取物，5g/l氯化鈉，100 mg/l胺苄青黴素鈉鹽及5 〇m/l 5 -溴一 4 一氯一 3 —吲哚基—/9 一半乳糖苷的瓊脂平板培養基（p Η 7.0)，於3 7 °C培養2 4小時後，將培養基上所形成約5 0 0 0個白色菌落固定於Amasham製尼龍「Hybond-N + 」上。另外依據在實驗例5 - 2之方法被鮮明之序列表 1 6所示胺基酸序列中第4至1 1之胺基酸序列，化學合成由 5、GGNTTYATGAAYTTYAGRTGGGA-3,所示驗基序歹[J 的低核苷酸，依常法使用〔7 - 3 2 P〕A T P及T 4多核苷酸激酶同位體標識得到做探針1之合成D N A。對先前所得固定於尼龍膜上的菌落中，對探針1具有顯著聯繫的菌落，適用一般之菌落雜交法選擇二種轉形體。依常法自此本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -63- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 ___ _ B7 _ 五、發明説明（61 ) 等二種轉形體採取重組DNA，另一方面根據序列表中序列1 7所示胺基酸序列之第4至第1 1之胺基酸序列化學合成以 S'-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGGI,所示鹼基序列的探針2，同樣地同位素標識後，適用一般之南氏雜交 ’選擇有顯著聯繋之重組D N A，命名該轉形體爲「B G C 2」。實驗例6 - 3 分析D N A序列依常將實驗例6 - 2之方法所得轉形體「B G C 2」植菌於含有1 〇〇 # g / m 1胺苄青黴素鈉之L 一肉汁培養基（p Η 7 . 0 )，於3 7 °C旋轉振盪培養2 4小時。培養完後離心分離自培養物採取菌體，依一般之鹼-S D S法萃取重組D N A。以一般二去氧法分析此重組 D N A之鹼基序列，獲知含有圓孢芽孢桿菌C 1 1株由來之鏈長5 2 9 4鹼基對之序列表中序列1 8所示鹼基序列之D N A。如第1 7圖所示，此重組D N A中該D N A係被連接於藉由限制酶X b a I認識部位之下游。另一方面自此鹼基序列可被推論之胺基酸序列係如其序列1 8所一倂記載一樣，此胺基酸序列，與實驗例5 - 1的方法被確認之本發明多肽的N末端胺基酸序列及實驗例5 - 2的方法被認確之中間部份胺基酸序列。比較序列表中之序歹[j 7及序列8至1 7所示胺基酸序列時，序列表中序列7所示胺基酸序列係與序列1 8中倂記之胺基酸序列中之第 3 6至第4 4之胺基酸序列完全一致。又，序列8、9、本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

64- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 A7 __ B7 五、發明説明（62 ) 10、11、12、13、14、15、16 及 17 所示月安基酸序列係分別與序列1 8中所列記之胺基酸序列之第 823 至 832、第 576 至 589、第 874 至 904 、第 1117 至 1141、第 657 至 670、第 367 至399、第970至993、第938至953、第 279至295、及第63 2至651之胺基酸序列完全一致。又’序列1 8中之第4783至478 5之鹼基序列係編碼終止密碼（5 / — T A A — 3 >)，所以獲知本發明多肽之C末端係其前面之麩胺酸（序列1 8中之第 1 2 8 4的胺基酸）。由此等結果可知，本發明之多肽係具有序列1所示胺基酸序列，顯示本發明之多肽係在圓孢芽孢桿菌C 1 1株時係被序列4所示鹼基序列之D N A編碼時。又，序列 1 8中列記之胺基酸序列中的第1至8 5的胺基酸序列係被推論爲該多肽之分泌訊息序列。由此可知該多肽之分泌前的先質體肽係由序列1 8所列記之胺基酸序列所成，其胺基酸序列係被序列1 8所示驗基序列所編碼者。爲此將此確認鹼基序列的重組D N A命名爲「p B G C 2」。實驗例7 調製包含可編碼圓孢芽孢桿菌N 7 5株由來之多肽的D N A之重組D N A與轉形體

實驗例7 — 1 調製染色體D N A 在5 0 〇m 1容積之三角形燒瓶中放入1 0 〇m 1由本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-65 - 1269810 A7 B7 __ 五、發明説明（63 ) 2 . 〇 w / v %澱粉部份分解物（商品名·· Paindex#4 )， 1 · 0 w / v %酵母萃取物（商品名：Asahimist) ’ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 · lw/v%磷酸二鉀、〇 · 〇6w/v%磷酸一鈉· 1 2水鹽、0 · 0 5 w/ v %硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘’經冷卻後接種圓孢芽孢桿菌N 7 5株，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養2 4小時。其後離心分離自培養物採取菌體’使其浮遊於T E S緩衝液（p Η 8 . 0 )，加入0 · 0 5 w / ν %溶菌酶，於3 7 °C培養3 0分鐘。於一 8 0 °C凍結 1小時處理物，加入T S S緩衝液（P Η 9 . 0 )，加溫

6 0 °C加入T E S緩衝液/酚混合液，在冰水中一邊冷却一邊用力振盪5分鐘後，離心分離採取上澄液。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之粗染色體D N A ，溶解於S S C緩衝液（p Η · 7 . 1 )後，分別加入 7 _ 5//g或125//g之核糖核酸酶與蛋白酶，於37 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 °C培養1小時使其反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液，萃取染色體DNA，加入冷乙醇，採取食生成之染色體D N A的沈澱。溶解所得精製染色體D N A於S S C緩衝液（p Η 7 . 1 )使其爲濃度約1 m g /m 1 ，凍結溶液爲—8 0 °C。實驗例7 - 2 調製轉形體B G N 2

取1 m 1實驗例7 - 1調製之精製染色體D N A溶液，在其中加入約2 0 0單位之限制Κ ρ η I ，於3 7 °C I紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格（210Χ297公釐） ' — -66- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（64 ) 反應1 6小時分解染色體D N A後’以蔗糖密度梯度離心法採取約3 0 0 0至7 0 0 0鹽基對所成D N A片段。另外，依常法使限制酶Κ ρ η I作用於質體載體^ Bluescriptll SK ( + )」Stra gea η · cloning· System 公司製），使其完全切斷後，使用「DNA ligation組套」（寶酒造公司製），依其所附說明書操作連接0 _ 5 // g該被切斷之質體載體與約5 // g先前所得D N A片段’使用所得重組 D N A，依一般之感應細胞（Competent cell )法轉形 1 0 0 // 1 感應細胞「Epicurian Coli XL2-Blue」（Stragean • Cloning · System公司製）製作基因庫。將所得基因庫之轉形體植菌於依常法調製之含1 0 g / 1胰蛋酶水解腺， 5g/l酵母萃取物，5g/l氯化鈉，100mg/l 胺苄青黴素鈉鹽及5 0 m / 1 5 —溴—4 一氯—3 —吲哚基一 Θ -半乳糖苷的瓊脂平板培養基（Ρ Η 7 . 0 )，於3 7 t培養2 4小時後，將培養基上所形成約2 5 0 0 個白色菌落固定於Amasham製尼龍「Hybond-N+」上。另外依據在實驗例5 - 3之方法被鮮明之序列表2 4所示胺基酸序列中第4至1 1之胺基酸序列，化學合成由 5，-GAYGCNTGGATGTTYGGNGAYTGG-3,所示鹼基序歹[J 的低核苷酸，依常法使用〔r— 32P〕ATP及T4多核苷酸激酶同位體標識得到做探針1之合成D N A。對先前所得固定於尼龍膜上的菌落中，對探針1具有顯著聯繋的菌落，適用一般之菌落雜交法選擇3種轉形體。依常法自此等 3種轉形體採取重組D N A，另一方面根據序列表中序列本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-67- 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（65 ) 2 3所示胺基酸序列之第1 4至第2 1之胺基酸序列化學合成以 S^GTNAAYCARAAYCAYTGGTTYTAJ 所示鹼基序歹[| 的探針2，同樣地同位素標識後，適用一般之南氏雜交，選擇具有顯著聯繫之重組D N A，命名該轉形體爲「B G N 2」。實驗例7 - 3 分析D N A序列依常將實驗例7 - 2之方法所得轉形體「B G N 2」植菌於含有1 0 0 // g / m 1胺苄青黴素鈉之L 一肉汁培養基（p Η 7 _ 0 )，於3 7 °C旋轉振盪培養2 4小時。培養完後離心分離自培養物採取菌體，依一般之鹼-S D S法萃取重組D N A。以一般二去氧法分析此重組 DNA之鹼基序列，獲知含有圓孢芽孢桿菌N7 5株由來之鏈長4 9 9 1鹼基對之序列表中序列2 5所示鹼基序列之DNA。如第1 8圖所示，此重組DNA中該DNA係被連接於藉由限制酶Κ ρ η I認識部位之下游。另一方面自此鹼基序列可被推論之胺基酸序列係如其序列2 5所一倂記載一樣，此胺基酸序列，與實驗例5 - 1的方法被確認之本發明多肽的Ν末端胺基酸序列及實驗例5 - 3的方法被認確之中間部份胺基酸序列。比較序列表中之序列 1 9及序列2 0至2 4所示胺基酸序列時，序列表中序列 1 9所示胺基酸序列係與序列2 5中倂記之胺基酸序列中之3 6至第4 3之胺基酸序列完全一致。又，序列2 0、 2 1、2 2及2 4所不胺基酸序列係分別與序列2 5中戶斤 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -68- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（66 ) 列記之胺基酸序列之第9 0 7至9 2 5、第3 6 7至 386、第 1034 至 1058、第 996 至 1020、及第6 3 2至6 4 2之胺基酸序列完全一致。又，序列 2 5中之第4 2 9 4至4 2 9 6之鹼基序列係編碼終止密碼（5 / - T A A - 3 / )，所以獲知本發明多肽之C末端係其前面之麩胺酸（序列2 5中之第1 2 8 6的胺基酸 )° 由此等結果可知，本發明之多肽係具有序列2所示胺基酸序列，顯示本發明之多肽係在圓孢芽孢桿菌N 7 5株時係被序列5所示鹼基序列之D N A編碼時。又，序列 2 5中列記之胺基酸序列中的第1至3 5的胺基酸序列係被推論爲該多肽之分泌訊息序列。由此可知該多肽之分泌前的先質體肽係由序列2 5所列記之胺基酸序列所成，其胺基酸序列係被序列2 5所示鹼基序列所編碼者。爲此將此確認鹼基序列的重組D N A命名爲「p B G N 2」。實驗例8 調製包含可編碼球形節桿菌A 1 9株由來之多肽的D N A之重組D N A與轉形體

實驗例8 - 1 調製染色體D N A 在5 0 0 m 1容積之三角形燒瓶中放入1 〇 0 m 1由 2 · 0 w / v %澱粉部份分解物（商品名：Paindex#4 )， 1 _ 〇w/v%酵母萃取物（商品名：Asahimist)， 0 _ lw/v% 磷酸二鉀、〇 · 〇6w/v% 磷酸—鈉· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（67 ) 1 2水鹽、0 · 05w/v%硫酸鎂· 7水鹽及水所成液體培養基，以1 2 1 °C熱壓器殺菌2 0分鐘，經冷卻後接種球形節桿菌A 1 9株，於2 7 °C、2 3 0 r p m旋轉振盪培養2 4小時。其後離心分離自培養物採取菌體，使其浮遊於T E S緩衝液（p Η 8 · 0 )，加入0 · 0 5 w / ν %溶菌酶，於3 7 °C培養3 0分鐘。於一 8 0 °C凍結1 小時處理物，加入T S S緩衝液（p Η 9 . 0 )，加溫 6 0 °C加入T E S緩衝液/酣混合液，在冰水中一邊冷却一邊用力振盪5分鐘後，離心分離採取上澄液。在此上澄液中加入2倍容量之冷乙醇，採取沈澱之精染色體DNA ，溶解於S S C緩衝液（p Η . 7 . 1 )後，分別加入 7 . 5//g或125//g之核糖核酸酶與蛋白酶，於37 °C培養1小時使其反應。反應物中加入氯仿/異戊醇混合液萃取染色體D NA，加入冷乙醇，採取食生成之染色體 D N A的沈澱。溶解所得精製染色體D N A於S S C緩衝液（P Η 7 . 1 )使其爲濃度約1 m g /m 1 ，凍結溶液爲—8 0 〇C。實驗例8 - 2 調製轉形體A G A 1 取1 m 1實驗例8 - 1調製之精製染色體D N A溶液，在其中加入約1 〇單位之限制酶Κ ρ η I，於3 7 V 反應3 0分鐘部份分解染色體D N A後，以蔗糖密度梯度離心法採取約4 0 0 0至8 0 0 0鹽基對所成D N A片段。另外，依常法使限制酶Κ ρ η I作用於質體載體「 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -70- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（68 )

Bluescript II SK ( + )」Stragean· cloning· System 公司製），使其完全切斷後，使用「DNA ligation組套」（寶酒造公司製），依其所附說明書操作連接約5 // g該被切斷之質體載體與約5 // g先前所得D N A片段，使用所得重組 D N A，依一般之感應細胞（Competent cell )法轉形 1 0 0 // 1 感應細胞「Epicurian Coli XL2-Blue」（Stragean • Cloning · System公司製）製作基因庫。將所得基因庫之轉形體植菌於依常法調製之含1 0 g / 1胰蛋酶水解腺， 5g/l酵母萃取物，5g/l氯化鈉，l〇〇mg/l 胺卡青黴素鈉鹽及5 0 m / 1 5 -溴—4 一氯一 3 -吲哚基一沒一半乳糖苷的瓊脂平板培養基（p Η 7 . 0 )，於3 7 °C培養2 4小時後，將培養基上所形成約6 0 0 0 個白色菌落固定於Amasham製尼龍「Hybond-N+」上。另外依據在實驗例5 - 4之方法被鮮明之序列表2 7所示胺基酸序列中第1至1 1之胺基酸序列，化學合成由 S^CARGARTGGAAYYTNACNGGNGAYCCNTGGACJ 所示鹼基序列的低核苷酸，依常法使用〔r 一 3 2 ρ〕Α τ p及 T 4多核苷酸激酶同位體標識得到做探針1之合成D N A 。對先前所得固定於尼龍膜上的菌落中，對探針1具有顯著聯繫的菌落，適用一般之菌落雜交法選擇2種轉形體。依常法自此等2種轉形體採取重組D N A，另一方面根據序列表中序列2 9所不胺基酸序列之第6至第1 6之胺基酸序列化學合成以 S^TGGACNCARCCNGARGCNGGNGCNGNTTGCAJ所示鹼基本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-71 - 1269810 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（69 ) 序列的探針2，同樣地同位素標識後，適用一般之南氏雜交，選擇具有顯著聯繫之重組D N A，命名該轉形體爲「 A G A 1」。實驗例8 — 3 分析D N A序列依常將實驗例8 - 2之方法所得轉形體「A G A 1」植菌於含有1 Ο Ο // g / m 1胺苄青黴素鈉之L 一肉汁培養基（p Η 7 . 0 )，於3 7 °C旋轉振盪培養2 4小時。培養完後離心分離自培養物採取菌體，依一般之鹼-S D S法萃取重組D N A。以一般二去氧法分析此重組 D N A之鹼基序列，獲知含有球形節桿菌A 1 9株由來之鏈長5 8 1 1鹼基對之序列表中序列3 2所示鹼基序列之 D N A。如第1 9圖所示，此重組D N A中該D N A係被連接於藉由限制酶Κ ρ η I認識部位之下游。另一方面自此鹼基序列可被推論之胺基酸序列係如其序列3 2所一倂記載一樣，此胺基酸序列，與實驗例5 - 1的方法被確認之本發明多肽的Ν末端胺基酸序列及實驗例5 - 4的方法被認確之中間部份胺基酸序列。比較序列表中之序列 2 6及序列2 7至3 1所示胺基酸序列時，序列表中序列 2 6所示胺基酸序列係與序列3 2中倂記之胺基酸序列中之3 7至第4 9之胺基酸序列完全一致。又，序列2 7、 2 8、2 9、3 0及3 1所示胺基酸序列係分別與序列 3 2中所列記之胺基酸序列之第2 2 7至2 3 9、第 3 45 至 374、第 40 1 至 430、第 89 至 1 1 5、 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -72- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（70 ) 及第6 4 1至6 6 7之胺基酸序列完全一致。又，序列 3 2中之第4 5 5 0至4 5 5 2之鹼基序列係編碼終止密碼（5 / - T G A - 3 / )，所以獲知本發明多肽之C末端係其前面之麩胺酸（序列3 2中之第9 6 5的胺基酸）〇由此等結果可知，本發明之多肽係具有序列3所示胺基酸序列，顯示本發明之多肽係在球形形桿菌A 1 9株時係被序列6所示鹼基序列之D N A編碼時。又，序列3 2 中列記之胺基酸序列中的第1至3 6的胺基酸序列係被推論爲該多肽之分泌訊息序列。由此可知該多肽之分泌前的先質體肽係由序列3 2所列記之胺基酸序列所成，其胺基酸序列係被序列3 2所示鹼基序列所編碼者。爲此將此確認鹼基序列的重組D N A命名爲「p A G A 1」。實驗例9 藉由本發明之轉形體產生多肽實驗例9 一 1 轉形體B G C 2 在5 0 0m 1容量之三角燒瓶中放入1 0 〇m 1含有 5 g / 1澱粉部份分解物「Paindex #4」、2 0 g / 1多腺、2 0 g / 1酵母萃取物及1 g / 1磷酸氫鈉之水溶液，以熱壓器於1 2 1 °C處理1 5分鐘’經冷却，調製成無菌 ρ Η 7 · 0後，無菌下添加1 〇mg胺苄青黴素鈉鹽，調製爲液體培養基。在此液體培基中接種實驗例6 - 2之方法所得轉形體「B G C 2」，於2 7 °C通氣攪拌培養約本紙張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（21〇><297公t) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 B7 五、發明説明⑺） 4 8小時。爲調查此培養物中有無該多肽，依常法離心分離此培養物，分離培養上澄液與菌體然後個別回收。菌體係分別藉超音波軋碎法自細胞調製全萃取物，藉由滲透壓衝擊法自細胞周質之萃取物。上述超音波軌碎法係採用懸濁菌體於1 0 m Μ磷酸緩衝液（p Η 7 · 0 )後’於冰水中一邊冷却該菌體懸濁液，一邊以超音波勻漿器（ U Η - 6 0 0型」S Μ Τ公司製）軋碎細胞，以該軋碎物做細胞全萃取物之方法。上述滲透壓衝撃法係採用以含有 30mM氯化鈉之10mM Tr i s —鹽酸緩衝液（ Ρ Η 7 . 3 )洗淨菌體後，懸濁洗淨菌體於含2 Ο 0 g / 1蔗糖及ImM EDTA之33mM Tris-鹽酸緩衝液（P Η 7 . 3 )，於2 7 °C振盪2 0分鐘，繼而離心分離，回收菌體，將該菌體懸濁於預先冷却爲約4 °C之 0 . 5 m m Μ氯化鎂水溶液，於冰水中振盪2 0分鐘自細胞周質萃取之方法。然後經離心分離，回收上澄液，以該上澄液做爲細胞周質之萃取物。分別對如上述所得培養上澄液，細胞全萃取物，細胞周質萃取物測定α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，換算出每1 m 1培養物各活性値。結果示於表1 2。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -74- 1269810 A7 B7 五、發明説明（72 ) 表 12 試料 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性 (單位/ml-培養物）培養上澄液 0.0 細胞全萃取物 1.1 細胞周質萃取物 1.0 由表1 2之結果可知，轉形體「B G C 2」係在細胞內產生本發明之多肽其大部份可被分泌至細胞周質。又，做爲第1對照在培養基中不添加胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體一樣條件培養大腸菌「X L 2 - B 1 u e」株，自培養物調製培上澄液與菌體軋碎物。做爲第二對照在培養基中除不含胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體時一樣條件培養圓孢芽孢桿菌C 1 1株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。在第一對照之培養上澄液，菌體軋碎物的完全看不出α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性。第二對炅之培養上澄液及菌體軋碎物雖可看到^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，但這時每單位培養物分別約〇 . 3 7 單位，約0 . 0 2單位，與轉形體「B G C 2」相比顯然爲較低數値。另外，再依實驗例1之方法鹽析、透析上述所得細胞周質萃取物，以使用Sepabeads FP-DA13凝膠、Sephacryl HR S-200凝膠、Butyl-Toyopearl 650M凝膠之管柱層析精製，依實驗例1所示方法分析本發明之多肽。藉由s D s - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（73 ) 聚丙烯醯胺凝膠電泳法的分子量約1 3 7，0 0 〇土 2 0，0 0 0達爾頓，等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法所得等電點爲約5 · 2±0 · 5，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之至適溫度爲約4 5 °C ( C a 2 +離子不存在下），約50°C (Ca2 +離子存在下），至適pH約6 . 〇，温度安定性係約4 0 °C爲止（C a 2 +離子不存在下），約 5 0 °C ( C a 2 +離子存在下），p Η安定性係約5 v 〇至 1 0 · 0。由此結果可知，此重組型多肽係與實驗例1之方法所得具有α _異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的理化學上性質爲實質上相同者。實驗例9 一 2 轉形體B G Ν 2 在5 0 〇m 1容量之三角燒瓶中放入1 〇〇m 1含有 5 g / 1澱粉部份分解物「Paindex #4」、2 0 g / 1多腺、2 0 g / 1酵母萃取物及1 g / 1磷酸氫鈉之水溶液，以熱壓器於1 2 1 °C處理1 5分鐘，經冷却，調製成無菌 PH7 . 0後，無菌下添加10mg胺苄青黴素鈉鹽，調製爲液體培養基。在此液體培養基中接種實驗例7 - 2之方法所得轉形體「B G N 2」，於2 7 °C通氣攪拌培養約 4 8小時。爲調查此培養物中有無該多肽，與實驗例9 -1之方法一樣，分別調製培上澄液與細胞全萃取物與細胞周質萃取物。分別針對培養上澄液，細胞全萃取物，細胞周質萃取物測定α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，將各活性値換算爲每1 m 1培養物之活性値，結果示於表1 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公' ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（74 ) 表 13 試料 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性 (單位/ml-培養物）培養上澄液 0.54 細胞全萃取物 0.91 細胞周質萃取物 0.85 由表1 3之結果可知，轉形體「B G N 2」係在細胞內產生本發明之多肽其細胞內中大部份可被分泌至細胞周質。又，做爲第1對照在培養基中不添加胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體一樣條件培養大腸菌「X L 2 -B 1 u e」株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。做爲第二對照在培養基中除不含胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體時一樣條件培養圓孢芽孢桿菌N 7 5株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。在第一對照之培養上澄液，菌體軋碎物的完全看不出α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性。第二對照之培養上澄液及菌體軋碎物雖可看到 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，但這時每單位培養物分別約0 · 2 1單位，約0 . 0 1單位，與轉形體「B G Ν 2」相比顯然爲較低數値。另外，再依實驗例2之方法鹽析、透析上述所得細胞周質萃取物，以使用 Sepabeads FP-DA13凝膠、Sephacryl 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（75 ) HR S-200凝膠、Butyl-Toyopearl 650M凝膠之管柱層析精製，依實驗例2所示方法分析本發明之多肽。藉由S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳法的分子量約136， 000土 2 0，0 〇〇達爾頓，等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法所得等電點爲約7 · 3±0 · 5，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之至適溫度爲約5 0 °C ( C a 2 +離子不存在下），約5 5 °C ( C a 2 +離子存在下），至適P Η約6 · 0，溫度安定性係約4 5 °C爲止（C a 2 +離子不存在下），約 5 0 °C ( C a 2 +離子存在下），P Η安定性係約5 · 0至 9 . 0。由此結果可知，此重組型多肽係與實驗例2之方法所得具有α _異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的理化學上性質爲賨質上相同者。實驗例9 一 3 轉形體A G A 1 在5 0 〇m 1容量之三角燒瓶中放入1 0 〇m 1含有 5 g / 1澱粉部份分解物「Paindex #4」、2 0 g / 1多腺、2 0 g / 1酵母萃取物及1 g/ 1磷酸氫鈉之水溶液，以熱壓器於1 2 1 °C處理1 5分鐘’經冷却，調製成無菌 PH7 · 0後，無菌下添加1〇«^3胺苄青黴素鈉鹽，調製爲液體培養基。在此液體培基中接種實驗例8 - 2之方法所得轉形體「A G A 1」，於2 7 °C通氣攪拌培養約 4 8小時。爲調查此培養物中有無該多肽，與實驗例9 -1之方法一樣，分別調製培上澄液與細胞全萃取物與細胞周質萃取物。分別針對培養上澄液，細胞全萃取物，細胞本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公® ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

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7 7 A B 五、發明説明（76 ) 周質萃取物測定α -異麥芽糖基蔔糖質生成酶活性，將各活性値換算爲每1 m 1培養物之活性値，結果示於表1 4 表 14 試料 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性 (單位/ml-培養物）培養上澄液 0.51 細胞全萃取物 2.5 細胞周質萃取物 2.4 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — 由表1 4之結果可知，轉形體「A G A 1」係在細胞內產生本發明之多肽其大部份可被分泌至細胞周質。又，做爲第1對照在培養基中不添加胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體一樣條件培養大腸菌「X L 2 - B 1 u e」株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。做爲第二對照在培養基中除不含胺苄青黴素以外其他均與上述轉形體時一樣條件培養球形節桿菌A 1 9株，自培養物調製培養上澄液與菌體軋碎物。在第一對照之培養上澄液，菌體軋碎物的完全看不出α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性。第二對炅之培養上澄液及菌體軋碎物雖可看到α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性，但這時每單位培養物分別約0 . 3 3 單位，約0 · 0 1單位，與轉形體「A G A 2」相比顯然爲較低數値。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）、\5口

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（77 ) 另外，再依實驗例3之方法鹽析、透析上述所得細胞周質萃取物，以使用 Sepabeads FP-DA13凝膠、Sephacryl HR S-200凝膠、Butyl-Toyopearl 650M凝膠之管柱層析精製，依實驗例3所示方法分析本發明之多肽。藉由S D S -聚丙烯醯胺凝膠電泳法的分子量約94， 000土 2 0，0 0 0達爾頓，等電點聚丙烯醯胺凝膠電泳法所得等電點爲約4 · 3±0 . 5，α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之至適溫度爲約6 0 °C ( C a 2 +離子不存在下），約65°C(Ca2 +離子存在下），至適pH約8. 4，溫度安定性係約5 5 °C爲止（C a 2 +離子不存在下），約 6 0 °C ( C a 2 +離子存在下），P Η安定性係約5 . 0至 9 · 0。由此結果可知，此重組型多肽係與實驗例3之方法所得具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的理化學上性質爲實質上相同者。以下藉由實施例具體說明本發明之多肽的製造方法，與使用本發明之多肽製造環狀四糖或含其之糖質的方法。實施例1 製造本發明之多肽在5 0 〇m 1容量之三角燒瓶中放入1 〇 0m !含有 5 g / 1澱粉部份分解物「Paindex #4」、2 0 g / 1多腺、2 0 g / 1酵母萃取物及1 g/ 1磷酸氫鈉之水溶液，以熱壓器於1 2 1 °C處理1 5分鐘，經冷却，調製成無菌 p Η 7 . 0後，無菌下添加1 〇 // g / m 1胺苄青黴素鈉鹽。在此液體培養基中接種實驗例5 - 2之方法所得轉形本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ 297〕>釐） " ' -80- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（78 ) 體「B G C 2」，於2 7 °C，2 3 0 r p m旋轉振盪培養 2 4小時接種培養液。其次在3 0 1容量之培養器中放入約1 8 1與上述同樣組成之液體培養基，同樣經殺菌，冷却至3 7 °C後加入5 0 // g / m 1胺苄青黴素鈉鹽，接種 1 v / v %種培養液，於2 7 °C通氣培養4 8小時，離心分離培養物，回收菌體，懸濁於1 0 m Μ磷酸緩衝液（ Ρ Η 7 · 0 )後，經超音波處理軋碎菌體，離心分離除去不溶物得上澄液。測定此上澄液中之酶活性，結果每1 1 培養物檢測出約1 1 0 0單位之酶活性。使用此上澄液依實驗例1之方法精製，得約7 0 m 1每1 m 1含約6 1單位之比活性約1 3 . 5單位/ m g蛋白質之本發明多肽的水溶液。實施例2 製造本發明之多肽在5 0 〇m 1容量之三角燒瓶中放入1 〇〇m 1含有 5 g / 1澱粉部份分解物「Paindex #4」、2 0 g / 1多腺、20g/l酵母萃取物及lg/1磷酸氫鈉之水溶液，以熱壓器於1 2 1 °C處理1 5分鐘，經冷却，調製成無菌 PH7 . 0後，無菌下添加10/zg/ml胺苄青黴素鈉鹽。在此液體培養基中接種實驗例6 - 2之方法所得轉形體「B G N 2」，於3 7 °C，2 3 0 r p m旋轉振盪培養 2 4小時接種培養液。其次在3 0 1容量之培養器中放入約1 8 1與上述同樣組成之液體培養基，同樣經殺菌，冷却至2 7 °C後加入5 0 // g / m 1胺苄青黴素鈉鹽，接種 1紙張尺度適用中國國家標準（〇灿）八4規格（210父297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-81 - 1269810 A7 B7 五、發明説明（79 ) 1 V / V %種培養液，於2 7 °C通氣培養4 8小時，離心分離培養物，回收培養上澄。測定此上澄液中之酶活性，結果每1 1培養物檢測出約7 5 0單位之酶活性。使用此上澄液依實驗例2之方法精製，得約7 5 m 1每1 m 1含約7 2單位之比活性約1 2 . 6單位/m g蛋白質之本發明多肽的水溶液。實施例3 製造含環狀四糖之糖漿狀物轉移酶之濃縮酶液。使木薯澱粉成爲約2 5 %濃度之澱粉乳，對每1 g澱粉固體物加入0 . 2 % α -澱粉酶 (商品名·· Neospitase、Nagase生化學工業公司製），於 8 5〜9 0 °C反應約2 0分鐘，繼而於1 2 0 t熱壓處理 2 0分鐘，再急速冷却至約3 5 °C，得D E約4之液化溶液，在其中對每1 g澱粉固體物分別添加2 . 2單位與 6 . 6單位之實施例1之方法所得本發明多肽，與實驗例 1 -4之方法所得α -異麥芽糖基轉移酶，再對每1 gg 粉固體物添加1 0單位環麥芽糖糊精聚葡糖轉移酶（林原生物化學硏究所製），於p Η 6 · 0，溫度3 5 °C，反應 4 8小時。於9 5 °C保持該反應液3 0分鐘後，調整爲 PH5 · 0，溫度50°C後，對每lg固體物加入300 單位之α -配糖酶劑（商品名：「Transglucosidase L、 Amano」，天野製藥公司製），對每lg固體物再加入30 單位葡糖澱粉酶劑（商品名「Glucoteam」長瀨生化學公司製），反應1 7小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保持3 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -82- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（8〇 ) 分鐘後，經冷却，依常法以活性碳脫色所得之濾液，藉由 Η型及OH型離子交換樹脂脫鹽，精製，再予濃縮，對每單位原料澱粉固體物以收率約9 0 %得濃度6 0 %之含環狀四糖的糖漿。此糖漿係以固體單位而言含3 8 · 4%葡萄糖、 58.1%環狀四糖、及3.5%其他糖質，具有溫和之甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物。實施例4 製造環狀四糖結晶性粉末使玉米澱粉成爲濃度2 0%之澱粉乳，加入碳酸鈣 0 · 1%，調整爲ΡΗ6 . 5，對每lg澱粉加入α —澱粉酶劑（Nobo公司製，商品名「Tarmameel 60L」）使其可成爲0 _ 3%，於95 反應15分鐘，繼而於120 °C 熱壓2 0分鐘，急速冷卻爲約3 5 °C，得D E約4之液化溶液，在每lg澱粉固體物加入0.25ml實施例1之方法所得多肽與實驗例1 - 4之方法所得α -異麥芽糖基轉移酶之濃縮酶液，對每1 g澱粉固體物再添加1 0單位環麥芽糖糊精聚葡糖轉移酶（林原生物化學硏究所製），於P Η 6 . 0，溫度3 5 °C，反應4 8小時。於9 5 °C保持該反應3 0分鐘後，調整爲p Η 5 . 0，溫度5 0 °C後，對每1 g固體物加入3 0 0單位之α -配糖酶劑（商品本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ^ -83- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 五、發明説明（81 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 名：「Transglucosidase L、Amano」，天野製藥公司製），反應2 4小時，對每1 g固體物再加入3 0單位葡糖澱粉酶劑（商品名「Glue 〇 team」長瀬生化學公司製），反應 1 7小時，加熱該反應液爲9 5 °C，保持3 0分鐘後，經冷却，經過濾依常法以活性碳脫色所得濾液，藉由Η型及〇Η型離子交換樹脂脫鹽，精製，再予濃縮，得到對每單位固體物34 . 2%葡萄糖、62 _ 7%環狀四糖、及 3.1%其他糖質之濃度60%之含環狀四糖的糖漿。使用強酸性陽離子交換樹脂（Amberlight CR-1310，Na 型Organo公司製）對所得含環狀四糖之糖液進行管柱分餾。將樹脂塡充於4支內徑5 · 4 c m附套不銹鋼製管柱，直排連接使樹脂層之全長爲2 0 m。維持管柱內溫度爲 6 0 °C，對樹脂加入5 v / v %糖液，以S V 〇 . 1 3 灌入6 0 °C溫水予以分餾，以Η P L C法監視溶出液之糖組成，採取高含環狀四糖之餾份，經精製以固體單位。此高含有液係固體單位約含約9 8 %環狀四糖之高含環狀四糖液。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製濃縮上述溶液爲約7 0 %濃度後，放入助晶罐中，加入約2 %環狀四糖5〜6含水結晶做爲晶種緩緩冷却，得晶出率約4 5 %的糖膏。自乾燥塔上的噴嘴以1 5 0 k g /cm2高壓噴霧此糖膏。同時自乾燥塔上方送入8 5 °C熱風，在底部所設移送用金屬網輸送帶上搜集結晶粉末，自輸送帶下方一邊送4 5 °C溫熱風，將該粉末慢慢移動至乾燥塔外，取出。將此結晶粉末塡充於熟成塔，一邊送溫風本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -84- 1269810 A7 ______ B7 五、發明説明（82 ) ’ 一邊使其熟成1 〇小時，完成晶化與乾燥，得收率約 2 0 %環狀四糖5〜6含水結晶粉末。此品係實質上還原性極低，很難引起胺羰基反應，亦不具吸濕性’很容易保存處理，具有溫和的低甜味，適度之粘度、保濕性、包合性、難消化性、做爲甜味料、低熱量食品材料、呈味改良劑、風味改良劑、品質改良劑、防離水劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等，可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等組成物。實施例5 製造環狀四糖結晶性粉末使玉米澱粉成爲濃度3 0 %之澱粉乳，加入碳酸鈣〇 . 1%，調整爲pH6 . 5，對每lg澱粉加入α —澱粉酶劑（Nobo公司製，商品名「Tarmameel 60L」）使其可成爲0 . 3 %，於9 5 °C反應1 5分鐘，繼而於 1 2 0 °C熱壓2 0分鐘，急速冷卻爲約3 5 °C，得D E、約 4之液化溶液，在每1 g澱粉固體物分別加入2 . 4單位與8 · 0單位實施例2之方法所得多肽及實驗例2 - 4之方法所得α -異麥芽糖基轉移酶，對每1 g澱粉固體物再添加3單位環麥芽糖糊精聚葡糖轉移酶（林原生物化學硏究所製），於p Η 5 · 5，溫度5 1 °C，反應4 8小時。於9 5 t保持該反應3 0分鐘後，調整爲P Η 5 . 0，溫度5 0°C後，對每1 g固體物加入3 0 〇單位之^ 一配糖酶劑（商品名·· 「Transglucosidase L、Amano」’天野製藥公司製），對每lg固體物再加入3 0單位葡糖澱粉酶劑 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1269810 Α7 Β7 五、發明説明（83 ) (商品名「Glue 〇 team」長瀨生化學公司製），反應17小時’加熱該反應液爲9 5 °C，保持3 0分鐘後，經冷却過濾’依常法以活性碳脫色過瀘所得瀘液，藉由Η型及〇Η 型離子交換樹脂脫鹽，精製，再予濃縮，對每單位固體物含46 · 8%葡萄糖、44 . 0%環狀四糖、及9 · 8% 其他糖質濃度6 0%之含環狀四糖的糖漿。以所得含環狀四糖之糖漿做爲原糖液，爲提高環狀四糖之含量，依實施例5之方法，使用強酸性陽離子交換樹脂對此糖液進行管柱分餾，採取高含環狀四糖餾份，經精製、濃縮、噴霧乾燥，得每1原料澱粉固體單位得收率約 4 5 %的高含環狀四糖液。此糖漿係以固體單位而言含3 · 7 %葡萄糖、 80.5%環狀四糖、及15·8%其他糖質，具有溫和之甜味適度之粘度、保濕性、包合性，做爲甜味料、呈味改良劑、品質改良劑、離水防止劑、安定劑、賦形劑、包合劑、粉末化基材等可以有利地利用於各種飮食物、化粧品、醫藥品等之組成物。本發明係具有如上述顯著效果之發明，對斯業界之貢獻巨大，乃爲極有意義之發明。圖面之簡單說明第1圖係示使具有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽作用於麥芽四糖時生成之生成物X的1Η—NMR譜圖。第2圖係示使具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -86 - !26981〇經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（84 ) 肽作用於麥芽五糖時生成之生成物Y的1Η—NMR譜圖。第3圖係示使具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽作用於麥芽四糖時生成之生成物X的13 C - NMR譜圖〇第4圖係示使具有^ -異麥芽糖基葡糖質生成酶之多肽作用於麥芽五糖時生成之生成物X的13C - NMR譜圖〇第5圖係示溫度影響及圓孢芽孢桿菌C 1 1株由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第6圖係示溫度影響及圓孢芽孢桿菌Ν 7 5株由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第7圖係示溫度影響及球形節桿菌A 1 9株由來之^ 一異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第8圖係示pH影響及圓孢芽孢桿菌C 9株由來之^ 一異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第9圖係示pH影響及圓孢芽孢桿菌Ν7 5株由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第1 0圖係示pH影響及球形節桿菌A 1 9株由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶之酶活性之圖。第1 1圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之 α -異麥芽糖基葡糖質生成酶的溫度安定性圖。第1 2圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌Ν7 5由來之 ^ -異麥芽糖基轉移酶的溫度安定性圖。第1 3圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之^ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-87- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A 7 _____B7___ 五、發明説明（85 ) 〜異麥芽糖基葡糖質生成酶的酶活性之溫度安定性圖。第1 4圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌C 1 1由來之 α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶的p Η安定性圖。第1 5圖係表示本發明之圓孢芽孢桿菌Ν 7 5由來之 ^ -異麥芽糖基轉移酶的ρ Η安定性圖。第1 6圖係表示本發明之球形節桿菌A 1 9由來之α 〜異麥芽糖基葡糖質生成酶酶活性之ρ Η安定性圖。第1 7圖係示本發明之重組D N A「p B G C 2」的限制酶圖，圖中以粗線表示之部份係可編碼圓孢芽孢桿菌 C l 1由來之具有本發明α 一異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的D Ν Α。第1 8圖係示本發明之重組DNA「pBGN2」的限制酶福，圖中以粗線表示之部份係可編碼圓孢芽孢桿菌 N 7 5由來之具有本發明α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的D Ν Α。第1 9圖係示本發明之重組D N A「p B G A 1」的限制酶圖，圖中以粗線表示之部份係可編碼球形節桿菌 A 1 9株由來之具有本發明α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽的D Ν Α。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 公告本經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明麫）序列表〈11 〇>林原生物化學硏究所株式會社 <12〇>士有α -異麥芽糖基葡糖質生成酶活性之多肽 <130> W0879 <160> 32 —

<210> i <211> 1249 <212> PRT <213〉 Microorganism <220〉 <400> 1

Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu lie Ser Ser Ser Yal Thr Gly Asp 1 5 10 15 T, Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser Asp Asp Leu 20 25 30

Leu lie Val Gin Ala Val Gin Asn Gly lie Leu Lys Yal Asp Tyr Arg 35 40 45

Pro Asn Ser lie Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn 50 55 60

Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr lie Asn Thr Thr Ala Asn Pro 65 70 75 80

Met Thr lie Thr Thr Ser Asn Met Lys lie Glu lie Thr Lys Asn Pro 85 90. 95

Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu Phe Trp Glu 100 105 110

Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Ala 115 120 125

Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly lie Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser 130 135 140

Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala His Ala Gly 145 150 155 160

Glu Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu lie Trp Ser Thr Ala Gly Tyr 165 170 175

Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr Asp Ser Thr 180 185 190

Thr Gly Gin Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg 195 200 205

Arg Tyr Ala Lys Gin Asn Val Glu Tyr Tyr lie Met Leu Gly Thr Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-89 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 ___ 五、發明説明F ) 210 215 220

Lys Glu lie Met Thr Asp Val Gly Glu lie Thr Gly Lys Pro Pro Met 225 230 235 240

Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn 245 250 255

Gin Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn lie 260 265 270

Pro lie Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu 275 280 285

Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe Pro Ser Ala 290 295 300

Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly lie Lys Met 305 310 315 320 lie Gly lie Thr Lys Pro Arg lie Val Thr Lys Asp Ala Ser Ala Asn 325 330 335

Val Thr Thr Gin Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro 340 345 350

Gly His Asn Glu Tyr Gin Asp Tyr Phe lie Pro Val Thr Val Arg Ser 355 360 365 lie Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp Asn His Ser 370 375 380

Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly lie Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr 385 390 395 400

Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr 405 410 415

Thr Gly His Met Ser Gin Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg Ala Tyr Thr 420 425 430

Ser Gly Ala Gin Arg Val Trp Gin Thr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly 435 440 445

Ala Gin Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp lie Gly He Gin 450 455 460

Tyr Asn Lys Gly Glu Arg lie Asn Trp Ala Ala Gly Met Gin Glu Gin 465 470 475 480

Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gin Val Lys Trp Gly 485 490 495

Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gin Gin Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro 500 505 510

Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gin Phe Ser Ala Leu Thr Pro 515 520 525

Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gin Gin Arg Gin Pro Trp Tyr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-90- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明妒 ) 530 535 540

Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala He Gin Leu Arg 545 550 555 560

Tyr Ser Leu lie Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu 565 570 575

Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gin Ala Tyr Pro Thr Asp 580 585 590

Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu 595 600 605

Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gin Gin Thr Ser Lys Asp lie Tyr 610 615 620

Leu Pro Ser Gly Ser Trp lie Asp Tyr Ala Arg Gly Asn Ala He Thr 625 630 635 640

Gly Giy Gin Thr lie Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp 645 650 655

Met Pro Leu Phe lie Lys Lys Gly Ala lie lie Pro Thr Gin Lys Val 660 665 670

Gin Asp Tyr Val Gly Gin Ala Ser Val Thr Ser Val Asp Val Asp Val 675 680 685

Phe Pro Asp Thr Thr Gin Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly 690 695 700

Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gin Asn Met Thr 705 710 715 720

Aia Gin Asp Asn Gly Ser Giy Ser Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys 725 730 735

Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gin Ser Tyr lie Val Lys Leu His 740 745 750

Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Ala Met Thr Ser 755 760 765

Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu Gly Trp Ala 770 775 780

Thr Gly Lys Asp lie Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Val Thr Ala 785 790 795 800

Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser lie Ala Val Thr Gly Val Ala Ala Val 805 810 815

Ser Ala Thr Thr Ser Gin Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser Leu Ser Gly 820 825 830

Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser lie Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr 835 840 845

Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-91 - 1269810 A7B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明fe9 ) 850 855 860 Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu 865 870 875 880 Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser He Phe Val 885 890 895 Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp 900 905 910 Asp Thr Trp Ser Thr Gin Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Val 915 920 925 Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn 930 935 940 Val Asn lie Asp Asn lie Thr Val Pro Phe Ala Pro lie lie Gly Lys 945 950 955 960 Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser Leu Asn Thr 965 970 975 Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Ser Ala 980 985 990 Val Gly Ala Gin Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser Ala Gly Ser 995 1000 1005 Tyr Gin Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala Thr Lys Thr 1010 1015 1020 Leu Ser Thr Tyr lie Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gin Thr Ser Phe Thr 1025 1030 1035 1040 Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gin Asp Asn Val Gin Thr Val 1045 1050 1055 Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr lie Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Ala 1060 1065 1070 Asp Ser Gly Asn lie Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala 1075 1080 1085 Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gin Asn Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe 1090 1095 1100 Glu Arg Asp Thr Ser Gin Thr Asn Asn Trp lie Glu Trp His Pro Gly 1105 1110 1115 1120 Thr Gin Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr Thr Asn Pro 1125 1130 1135 Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Phe Ala Ala 1140 1145 1150 Gly Ala Tyr Gin Gin Ser lie His Gin Thr lie Ser Val Pro Val Asn 1155 1160 1165 Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys Asn Thr Thr (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼

、1T

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -92- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明釔） 1170 1175 1180 Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu lie Gin Asn Tyr Gly Gly Ser Ala lie 1185 1190 1195 1200 Tyr Ala Asn lie Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr lie Ser Val Ser 1205 1210 1215 Asp He Met Val Thr Asn Gly Gin lie Asp Val Gly Phe Tyr Val Asp 1220 1225 1230 Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His lie Asp Asp Val Arg Val Thr Lys 1235 1240 1245 Gin 〈210〉 2 <211〉 1251 〈212〉 PRT 〈213〉 Microorganism <220> <400> 2 His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr lie Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp lie 20 25 30 Leu Val Leu Gin Ala Val Gin Asn Gly lie Leu Lys Val Asp Tyr Arg 35 40 45 Pro Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn 50 55 60 Lys Thr Trp Pro Ser lie Gly Ala Val lie Asn Thr Ala Ser Asn Pro 65 70 75 80 Met Thr lie Thr Thr Pro Ala Met Lys lie Glu lie Ala Lys Asn Pro 85 90 95 Val Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu 100 105 110 Pro Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly 115 120 125 Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly He Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser 130 135 140 Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gin Ala Ala Arg Ala Gly 145 150 155 160 Asp Gin Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu lie Trp Ser Thr Ala Gly Tyr 165 170 175 Gly Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21OX297公釐） 93- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（91 ) 180 185 190 Thr Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg 195 200 205 Arg Tyr Thr Lys Gin Asp Val Glu Tyr Tyr lie Met Leu Gly Thr Pro 210 215 220 Lys Glu lie Met Ser Gly Val Gly Glu lie Thr Gly Lys Pro Pro Met 225 230 235 240 Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn 245 250 255 Glu Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn lie 260 265 270 Pro lie Asp Gly Tyr Ala lie Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu 275 280 285 Asn Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Ala Asn Phe Pro Ser Ala 290 295 300 Ala Thr Thr Ala Leu Lys Ser Gin Met Asp Ala Lys Gly lie Lys Met 305 310 315 320 lie Gly lie Thr Lys Pro Arg lie Ala Thr Lys Asp Phe Ser Asn Asn 325 330 335 Pro Thr Val Gin Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly Gly Tyr Phe Tyr Pro 340 345 350 Gly His Ser Glu Tyr Lys Asp Tyr Phe lie Pro Val Phe Val Arg Ser 355 360 365 lie Asp Pro Tyr Asn Pro Ala Ala Arg Ser Trp Phe Trp Asn His Ser 370 375 380 Lys Asp Ala Phe Asp Lys Gly lie Val Gly Trp Trp Asn Asp Glu Thr 385 390 395 400 Asp Ala Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Tyr Trp Phe Gly Asn Phe Thr 405 410 415 Thr Gly His Met Ser Gin Ala Leu Tyr Glu Gly Gin Arg Ala Tyr Thr 420 425 430 Ser Asn Ala Gin Arg Val Trp Gin Tnr Ala Arg Thr Phe Tyr Pro Gly 435 440 445 Ala Gin Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp He Gly lie Gin 450 455 460 Tyr Thr Lys Gly Glu Arg lie Asn Trp Ala Ala Gly Met Gin Glu Gin 465 470 475 480 Arg Ala Val Met Leu Ser Ser He Asn Asn Gly Gin Val Lys Trp Gly 485 490 495 Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gin Gin Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pro (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -94 - 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（92 ) 500 505 510

Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gin Phe Ser Ala Leu Thr Pro 515 520 525

Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gin Gin Arg Gin Pro Trp Tyr 530 535 540

Tyr Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gin Leu Arg 545 550 555 560

Tyr Ser Leu lie Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu 565 570 575

Asn Gly Asn Giy Leu Val Arg Pro Leu Met Gin Glu Tyr Pro Ala Asp 580 585 590

Ala Asa Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu 595 600 605

Leu Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gin Gin Thr Ser Lys Glu lie Tyr 610 615 620

Leu Pro Ala Gly Thr Trp lie Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr 625 630 635 640

Gly Gly Gin Lys lie Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp 645 650 655 lie Pro Leu Phe lie Lys Lys Gly Ala lie lie Pro Ser Gin Lys Val 660 665 670

Gin Asp Tyr Val Gly Gin Ala Pro Val Gin Thr Val Asp Val Asp Val 675 680 685

Phe Pro Asn Thr Ala Gin Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly 690 695 700

Ser Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gin Leu Met Thr 705 710 715 720

Ala Gin Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys 725 730 735

Thr Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gin Ser Tyr lie Val Lys Leu His 740 745 750

Gly Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser 755 760 765

Tyr Ala Ser Leu Gin Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala 770 775 780

Lys Gly Lys Asp lie Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala 785 790 795 800

Gly Ala Ala Ala Ala Lys Ala He Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val 805 810 815

Ser Val Ala Asp Val Gin Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-95· 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（93 ) 820 825 830 Asn Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr 835 840 845 Thr Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val 850 855 860 Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu 865 870 875 880 Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser lie Phe Val 885 890 895 Asn Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp 900 905 910 Asp Thr Trp Gly Thr Gin Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr 915 920 925 Asn Val Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser 930 935 940 Val Asn Leu Asp Asn He Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala lie Gly Lys 945 950 955 960 Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gin 965 970 975 Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala 980 985 990 Pro Gly Ala Gin Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser 995 1000 1005 Tyr Gin lie Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr 1010 1015 1020 Leu Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gin Thr Ala Phe Ala 1025 1030 1035 1040 Ser Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gin Asp Ser Val Gin Thr Val 1045 1050 1055 Ala Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr lie Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly 1060 1065 1070 Asp Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala 1075 1080 1085 Ala Ala Pro Gly Val Pro Yal Ser Glu Gin Asn Leu Leu Asp Asn Gly 1090 1095 1100 Gly Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gin Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His 1105 1110 1115 1120 Pro Ala Ser Gin Ala lie Ala Tyr Gly lie Asp Ser Gly Ser Gly Met 1125 1130 1135 Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr (請先閱讀背面之注意事項再填寫本百〇

衣_ 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇x297公釐） 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（94 ) 1140 1145 1150

Ala Ala Gly Pro Tyr Gin Gin Ser lie His Gin Thr Val Ser Val Pro 1155 1160 1165

Val Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn 1170 1175 1180

Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu lie Gin Asn Tyr Gly Gly Ser 1185 1190 1195 1200

Pro lie Phe Thr Asn lie Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr lie Ser 1205 1210 1215

Val Ser Asp lie Gin Val Thr Asn Gly Gin lie Asp lie Gly Phe Tyr 1220 1225 1230

Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr ThrLeu His lie Asp Asp Val Arg Yal 1235 1240 1245

Thr Lys Gin 1250

〈210〉 3 〈211〉 929 <212> PRT 〈213〉 Microorganism 〈220〉 <400> 3

Ala Pro Leu Gly Val Gin Arg Ala Gin Phe Gin Ser Gly Ser Ser Tyr 15 10 15

Leu Val Val Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala 20 25 30

Gly Gly Gly Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro 35 40 45

Gin Val Ala Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gin Thr 50 55 60

Gly Ser Val Leu Gin Thr Ala Ala Met Arg lie Glu Val Asp Pro Ala 65 70 75 80

Asp Leu Cys Val Thr Ala Thr Asp lie Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val 85 90 95

Leu His Glu Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gin Ala Trp Lys Gly Leu 100 105 110

Asn lie Thr Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gin Gin 115 120 125

Phe Phe Thr Gly Gly Ser Ala Asp Gly Asp Trp Val Gly Arg Thr Arg 130 135 140 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-97- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（95) Thr Pro Gly Gly Thr Tyr Gly Asn Ala Met Yal Phe Asp Pro Glu Asn 145 150 155 160 Gly Pro Yal Gly Asn Thr Gin lie Pro Val Leu Phe Ala Val Gly Asp 165 170 175 Asp Asn Ala Asn Tyr Gly Leu Phe Val Asp Gin Leu Tyr Lys Gin Glu 180 185 190 Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg Met Trp Gly Asp Gin 195 200 205 Val Arg Trp Tyr Leu Met Ser Gly Asp Asp Leu Pro Asp Leu Arg His 210 215 220 Asp Tyr Met Glu Leu Thr Gly Thr Pro Pro Val Pro Pro Lys Lys Ala 225 230 235 240 Phe Gly Leu Trp Val Ser Glu Phe Gly Tyr Asp Asn Trp Ser Glu Yal 245 250 255 Asp Asn Thr lie Ala Gly Leu Arg Ser Ala Asp Phe Pro Val Asp Gly 260 265 270 Ala Met Leu Asp Val Gin Trp Phe Gly Gly Val Thr Ala Asp Ser Asp 275 280 285 Asp Thr Arg Met Gly Thr Leu Asp Trp Asp Thr Ser Arg Phe Pro Asp 290 295 300 Pro Ala Gly Lys lie Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly lie lie 305 310 315 320 Pro He Glu Glu Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg 325 330 335 Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro 340 345 350 Pro Val Tyr Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met lie 355 360 365 Asp Trp Thr Gin Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gin Arg 370 375 380 Gin His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly 385 390 395 400 Glu Pro Glu Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val lie Pro 405 410 415 Gly Lys His Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp 420 425 430 Ala Gin Ser lie Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gin Lys Arg 435 440 445 Pro Phe Met Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly lie Gin Arg His Gly 450 455 460 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

衣. 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -98 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明説明（96 )

Ala Gly Met Trp Ser Ala Asp lie Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly 465 470 475 480

Ser Gin Gin Asn Ala Gin Met His Met Ser Met Ser Gly lie Asp Tyr 485 490 495

Tyr Gly Ser Asp lie Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp 500 505 510

Val Asn Glu Leu Tyr Thr Gin Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp 515 520 525

Thr Pro Leu Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr 530 535 540

Ser Pro Asp Ser lie Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Val 545 550 555 560

Arg Arg Tyr Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala 565 570 575

His Gin Phe Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Yal Tyr Tyr Tyr Gin 580 585 590

Asn Asp Asp His Val Arg Glu Met Gly His Gin Lys Met Leu Gly Arg 595 600 605

Asp Leu Leu lie Ala lie Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp 610 615 620

Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu Trp lie Asp lie His Thr Asn Glu Arg 625 630 635 640 lie Gin Ser Thr Gly Gin Trp lie Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp 645 650 655

Gly Val Phe Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala lie lie Pro 660 665 670

Lys Ala Phe Val Asp Ala Ser Thr Lys Asp lie Thr Gly Lys Arg Glu 675 680 685

Asp Ala Ala Val Arg Asn Glu Leu He Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp 690 695 700

Val Ala Ser Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala 705 710 715 720

Tyr Ala Asp Gly Ala Val Arg Thr Thr Gin He Ser Gin Ser Leu Thr 725 730 735

Asn Gly Val Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser 740 745 750

Gly Ala Pro Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly 755 760 765

Thr Gin Ala Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Val Pro Leu Thr Glu His 770 775 780 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-99 - 1269810 A7 B7 五、發明説明（97 )

Ala Asn Lys Ala Ala Phe Asp Aia Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala 785 790 795 800 Gly Gly Gly Leu Val Yal Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr 805 810 815 Ala Lys Thr Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr 820 825 830 Phe Ser Cys Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gin Ser Val Tyr Val 835 840 845 Val Gly Asn Yal Pro Gin Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val 850 _ 855 860 Lys Leu Glu Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Val Arg Asn 865 870 875 880 Leu Pro Pro Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys lie Lys Arg Gin Glu 885 890 895 Ala Gly Leu Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn 900 905 910 lie Leu Ser Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly lie Thr Thr Gly Ala 915 920 925 Phe 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 4 <211> 3747 <212〉 DNA <213> Microorganism <400> 4 tatgtcagca gcctaggaaa tctcatttct tcgagtgtca ccggagatac actgttgata acggtgcgga gccgagtgat gacctcttga ttgttcaagc ggtattttga aggtggatta tcgtccaaat agcataacgc cgagcgcgaa ctggatccga acaaaacttg gtcagctgta ggagctacga ttaatacgac atgaccatca cgacttccaa tatgaagatt gagattacca agaatccagt gtcaagaagg cggacggcac tacgctattc tgggaaccat caggcggagg gacggtgtgc gcttccttca tgccacaggg gataatatgt atggcatccg gcttttgata gcgggggtga cctgctgcgg aattcgtcca atcatgccgc gaacagggag attccggtgg tccgcttatt tggagtacgg caggatatgg gatagcgatg gcggctaccc ctatacagat agcacaaccg gtcaaatgga ggtgggaccc ctcctgaggg acgtcgttat gcgaaacaaa acgtggaata ctcggaaccc ccaaggaaat tatgaccgac gtaggggaaa tcacagggaa ctgcctaagt ggtcgcttgg attcatgaac tttgagtggg atacgaatca acgaataatg tggatacgta tcgtgccaaa aatatcccca tagatgctta tatgactgga aaaagtacgg ggaaaccaac tatggtgaat tcgcgtggaa cttgacgcta 60 ggtgcaaaac 120 gacgccgatg 180 agccaatcca 240 acgaatgacg 300 ggtattctca 360 gagcttcaat 420 ccatgcgggt 480 actattagtc 540 gttttattat 600 ttatattatg 660 accgcctatg 720 aacggagttt 780 cgccttcgac 840 tacgactaat 900 (請先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -100 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（98 ) ttcccttctg cgtcaacgac ttctttaaag tcaacaatgg atgctaaagg catcaaaatg 960 atcggaatta caaaaccccg catcgttacg aaggatgctt cagcgaatgt gacgacccaa 1020 gggacggacg cgacaaatgg cggttatttt tatccaggcc ataacgagta tcaggattat 1080 ttcattcccg taactgtgcg tagtatcgat ccttacaatg ctaacgaacg tgcttggttc 1140 tggaatcatt ccacagatgc gcttaataaa gggatcgtag gttggtggaa tgacgagacg 1200 gataaagtat cttcgggtgg agcgttatat tggtttggca atttcacaac aggccacatg 1260 tctcagacga tgtacgaagg ggggcgggct tacacgagtg gagcgcagcg tgtttggcaa 1320 acggctagaa ccttctaccc aggtgcccag cggtatgcga ctacgctttg gtctggcgat 1380 attggcattc aatacaataa aggcgaacgg atcaattggg ctgccgggat gcaggagcaa 1440 agggcagtta tgctatcctc cgtgaacaat ggccaggtga aatggggcat ggataccggc 1500 ggattcaatc agcaggatgg cacgacgaac aatccgaatc ccgatttata cgctcggtgg 1560 atgcagttca gtgccctaac gcctgttttc cgagtgcatg ggaacaacca tcagcagcgc 1620 cagccatggt acttcggatc gactgcggag gaggcctcca aagaggcaat tcagctgcgg 1680 tactccctga tcccttatat gtatgcctat gagagaagtg cttacgagaa tgggaatggg 1740 ctcgttcggc cattgatgca agcctatcca acagatgcgg ccgtcaaaaa ttacacggat 1800 gcttggatgt ttggtgactg gctgctggct gcacctgtgg tagataaaca gcagacgagt 1860 aaggatatct atttaccgtc tgggtcatgg attgactatg cgcgaggcaa tgcaataact 1920 ggcggtcaaa ccatccgata ttcggttaat ccggacacgt tgacagacat gcctctcttt 1980 attaaaaaag gtgccattat tccaacacag aaagtgcagg attacgtagg gcaggcttcc 2040 gtcacttccg ttgatgtgga tgtgtttccg gatacgacgc agtcgagttt cacgtactac 2100 gatgatgatg gcgccagtta taactatgag agcggcactt attttaagca aaatatgact 2160 gctcaggata atgggtcagg ctcgttaagt tttactttag gagcaaagag tggcagttac 2220 acgccggctc tccaatccta tatcgttaag ctgcacggtt ctgctggaac ttctgttacg 2280 aataacagcg cagctatgac atcttatgca agcttggaag cattaaaagc tgctgctggg 2340 gaaggctggg cgactgggaa ggacatttat ggggatgtca cctatgtgaa agtgacggca 2400 ggtacagctt cttctaaatc tattgctgtt acaggtgttg ctgccgtgag cgcaactact 2460 tcgcaatacg aagctgagga tgcatcgctt tctggcaatt cggttgctgc aaaggcgtcc 2520 ataaacacga atcataccgg atatacggga actggatttg tagatggttt ggggaatgat 2580 ggcgctggtg tcaccttcta tccaaaggtg aaaactggcg gtgactacaa tgtctccttg 2640 cgttatgcga atgcttcagg cacggctaag tcagtcagta tttttgttaa tggaaaaaga 2700 gtgaagtcca cctcgctcgc taatctcgca aattgggaca cttggtctac acaatctgag 2760 acactgccgt tgacggcagg tgtgaatgtt gtgacctata aatattactc cgatgcggga 2820 gatacaggca atgttaacat cgacaacatc acggtacctt ttgcgccaat tatcggtaag 2880 tatgaagcag agagtgctga gctttctggt ggcagctcat tgaacacgaa ccattggtac 2940 tacagtggta cggcttttgt agacggtttg agtgctgtag gcgcgcaggt gaaatacaac 3000 gtgaatgtcc ctagcgcagg aagttatcag gtagcgctgc gatatgcgaa tggcagtgca 3060 gcgacgaaaa cgttgagtac ttatatcaat ggagccaagc tggggcaaac cagttttacg 3120 agtcctggta cgaattggaa tgtttggcag gataatgtgc aaacggtgac gttaaatgca 3180 ggggcaaaca cgattgcgtt taaatacgac gccgctgaca gcgggaacat caacgtagat 3240 cgtctgcttc tttcaacttc ggcagcggga acgccggttt ctgagcagaa cctgctagac 3300 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

-101 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（99 ) aatcccggtt tcgagcgtga cacgagtcaa accaataact ggattgagtg gcatccaggc 3360 acgcaagctg ttgcttttgg cgttgatagc ggctcaacca ccaatccgcc ggaatccccg 3420 tggtcgggtg ataagcgtgc ctacttcttt gcagcaggtg cctatcaaca aagcatccat 3480 caaaccatta gtgttcctgt taataatgta aaatacaaat ttgaagcctg ggtccgcatg 3540 aagaatacga cgccgacgac ggcaagagcc gaaattcaaa actatggcgg atcagccatt 3600 tatgcgaaca taagtaacag cggtgtttgg aaatatatca gcgtaagtga tattatggtg 3660 accaatggtc agatagatgt tggattttac gtggattcac ctggtggaac tacgcttcac 3720 attgatgatg tgcgcgtaac caaacaa 3747

<210〉 5 〈211〉 3753 <212> DNA <213> Microorganism <400> 5 catgtgagcg cgctgggcaa cctgctttcc tcggcggtga ccggggatac gctcacgctg 60 acgatcgata acggcgcgga accgaatgac gatattctag ttctgcaagc agtccagaac 120 ggtattctga aggtggacta ccggccgaac ggtgtagctc caagcgcgga tacgccgatg 180 ctggatccca ataaaacctg gccgtccata ggcgccgtta tcaatacagc ctctaatccg 240 atgacgatca caacgccggc gatgaagatt gagattgcca aaaatccggt gcgcctgacc 300 gtgaaaaaac cggacggcac cgctctgtta tgggaacccc cgaccggcgg cgtcttctcg 360 gacggcgtcc gtttcttgca cgggacgggc gacaatatgt acggcatccg cagcttcaat 420 gcttttgaca gcggcgggga tctgctgcgc aacagctcca cccaagccgc ccgtgcaggc 480 gaccagggca actccggcgg cccgctgatc tggagcacag ccgggtacgg ggtgctcgtt 540 gacagcgacg gtgggtatcc gttcacggac gaggctaccg gcaagctgga gttctattac 600 ggcggcacgc ctccggaagg ccggcgctat acgaagcagg atgtggagta ctacatcatg 660 ctcggcacgc cgaaagagat catgtccggc gtcggggaaa ttacgggcaa accgccgatg 720 ctgcccaagt ggtccctggg ctttatgaac ttcgagtggg atctgaatga agctgagctc 780 aagaaccatg tggatacgta ccgggccaaa aatattccga tcgacggcta tgcgatcgat 840 ttcgattgga agaagtacgg cgagaataat tacggcgaat tcgcttggaa tacggccaat 900 ttcccttccg ccgccacgac ggcgctgaag tcgcagatgg acgccaaggg cattaaaatg 960 atcggcataa ccaagcctcg catcgcgacg aaggattttt cgaacaatcc taccgtgcag 1020 ggaacggacg cggcgagcgg cggttatttt tatccgggac atagcgaata caaggactac 1080 ttcatcccgg tctttgtgcg cagcatcgac ccttataacc ctgctgcacg ctcctggttc 1140 tggaaccact ccaaggatgc gttcgataaa ggcatcgtag gctggtggaa cgacgagacg 1200 gatgcggtat cgtcgggagg ggcctcctac tggttcggca attttacgac cggccatatg 1260 tcccaggcgc tttacgaggg acagcgggca tatacgtcga acgcccagcg cgtctggcag 1320 acagcgcgca cgttctatcc cggggcgcag cgttatgcga cgacgctctg gtcgggagac 1380 atcgggattc agtataccaa gggggaaaga atcaactggg ctgccggcat gcaggagcag 1440 cgggcggtga tgctttcttc gatcaacaac ggccaggtca aatggggaat ggacacaggc 1500 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

102- 1269810 A7 B7 五、發明説明（1〇〇) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、11

ggct tcaacc atgcagttca cagcct tggt tactccctga cttgtccggc gcctggatgt aaggaaatct ggcggccaga attaagaagg gtccaaacgg gacgatgacg gctcaggaca agccccgcac agcaatgggg gaaggctggg ggggcagcgg gtgcagtacg gtgaatacga ggagcggcgg cgctacgcta gtcaaatcca acactgccgc gatacgggct tacgaggcgg tacagcggca gtgaacgccc gctgcgaaga agccctggcg ggtacgaaca ctggaccgtc ctcgataacg ccggcttcgc tcgccatggg atccatcaaa ttgctgaaga ccgatct tea caggtcacga ctccacatcg 〈210〉 6 ageaggaegg gcgcgctgac attatggctc t tcct tatat egetgatgea teggegattg atctccctgc agatcagcta gegegattat tggatgtgga gcagcagcta acggatccgg tgcaatccta cggcgctggc ccaagggcaa cggccaaggc aageegaaga accacgcagg ttacgttcta attegaeggg cgtcgctggc tgacggcggg eggt taacct agagegeega cggcatttgt cggccgcagg cgctcagcac gcaactggaa egategegtt tgttgctctc ggggctttga aggegattge caggcgataa cagtcagcgt atacaacacc cgaacatcag acggccaaat acgatgtgcg cacgacgaac tccggtgttc gacagccgag gtatgcttac ggaataccct gctgctggcg aggeaettgg cgccgtcaat cccttcgcag tgtattcccg caattatgaa tgegetgage tatcgtcaag ctcctatgcc ggacatctac gattgeegte agettegetg ctacacgggc tccgaaggtg agcggcaaag gaacctgccg gaegaaegt t ggacaacatc getgagegge agatggetta cagctaccag gtatgtgaac cgtgtggcag caagtacgat tgccgcagcg acgcgatccg ttaeggeate gcgcgcctat gcctgtcaat gacaacggcc taaagacggc egatattgge ggtcaccaag aatccgaatc cgcgtgcatg gaggcatcca gaaagaagcg gccgatgcca gcgcctgtgg attgactaca cccgacacgc aaggtgcagg aataeggeae ageggagett tttacgctgg cttcacgggg agcctgcaag ggcgatgtca accggcaaca tccggcaata ageggetteg aaaacgggcg agegteagea aactgggata gtcacctaca acggtgccct ggeageaegg accgcaccgg atcgcgcttc gggaegaage gacagcgtgc gccggcgaca ccaggcgtgc tcgcagagca gacagcggct t tetatgegg aatgccaagt cgggtggaga gtctggaaat t tctatgtgg caa cggacctgta gcaacaatca aggaagege t cctacgagaa acgccaaaaa tegagaagea accggggcac tgaeggatat actacgtggg aategagett acttcaagca gcgccaaaac ccgcaggcgc cgctgaaagc cgtatgtcaa gcccggtcag cgacagcaac tggatggact gagactacaa tet tcgttaa cgtgggggac agt tctactc tcgctccggc tcaaccagaa gcgcccaagt getatgegaa tggggcaaac agaccgtcgc geggeagegg ccgtgtccga gcaactggac ccgggatgaa caggcccgta acaagttcga ttcaaaatta acatcagcgt attcgcccgg cgccagatgg ccageagegc ccagctccgt cggtaacgga etatetegat gcagacctcc ggtgctcacc tccgctcttc ccaggctccc tacctattat attgatgacg cggcacgtac gtcggtgaca ctcagccagt gctatccgcg cgtggcggat caaggcgacc gagtaatccg tgtctcgctg cggcaagcgc gcaggctgag ggatgccgga catcggcaaa teat tggttc caaatatacc cggcacgggt ggccttcgcc gctcgccgcc cagcgtcaat gcagaacctg cgagtggcat tccgcctgaa tcagcaaagc agcctgggta cggcggttcg cagcgatatt aggcaccacg 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3753 -103 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 OX 297公餐） 1269810 五、發明説明（1〇1) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7

<211> 2787 <212> DNA <213> Microorganism <400> 6 gctcccctgg gcgtgcaacg cgcgcagttc cagtcggggt cgagctacct cgtcgtcgag 60 gtgctcgatg acgacctcgt ccacttcgag ctggccgggg gcggcaccgc ccccggcacg 120 ggctccccgc tgttcacgac gcctcaggtc gcgaagcacg actacgcggg acccgacgtg 180 ttcacccaga ccgggtctgt tctgcagacc gcggcgatgc gcatcgaggt cgatcccgcg 240 gatctgtgcg tgacggccac cgacatcacc cgcaccccga accttgtact gcacgaggcg 300 tgtcccgccg acctcggcca ggcgtggaag gggcigaaca tcacgaggtc ggcgatggag 360 aacgcctacg gtctcgggca gcagttcttc acgggcggca gcgcggacgg cgactgggtg 420 ggccgcaccc gcaccccggg tggcacctac ggcaacgcga tggtgttcga ccccgagaac 480 gggccggtcg gcaacacgca gatcccggtg ctcttcgcgg tcggcgatga caacgcgaac 540 tacgggctgt tcgtcgatca gctgtacaag caggaatgga acctcaccgg cgacccgtgg 600 acggtgcgca tgtggggcga ccaggtgcgc tggtacctca tgagcggcga cgacctgccc 660 gaccttcgcc acgactacat ggagctgacg ggcaccccgc ccgtgccgcc gaagaaggcg 720 ttcgggctct gggtgtcgga gttcggctac gacaactgga gcgaggtcga caatacgatc 780 gcgggcctgc gctcggccga ctttccggtc gatggcgcga tgctcgacgt acagtggttc 840 gggggcgtca ccgccgactc ggacgacacc cgcatgggca ccctcgattg ggacacgtcg 900 aggtttcccg accctgcggg aaagatcgcc gacctcgccg aggacggcgt cggcatcatc 960 ccgatcgagg agtcgtacgt cggtcgcaac ctgccggagc acgcccggat ggcggcggac 1020 ggttacctcg tgcgctccgg ctgcgctacg tgcccgccgg tgtacctgac ggggaacccc 1080 tggtggggca agggcgggat gatcgactgg acgcagccgg aagccggcgc cgtctggcac 1140 gacgagcagc gccagcatct cgtcgacgag ggcgtactgg gccactggct cgatctcggc 1200 gaaccggaga tgtacgaccc gaacgactgg accgccggcg tcatccccgg caagcacgcg 1260 cacgccgact atcacaacgc gtacaacctg ctgtgggcgc agagcatcgc cgacgggtac 1320 gccgacaacg gcgtgcagaa gcgtcccttc atgctgacgc gcgccgcggc cgccggcatc 1380 cagcgtcatg gcgcgggcat gtggtcagcc gacatcgggt cgaccatgaa ggcgctcggg 1440 agccagcaga acgcgcagat gcacatgtcg atgtcgggga tcgactatta cggctccgac 1500 atcggcgggt tccggcggga gatggccgac ggcgacgtga acgagctcta cacccagtgg 1560 ttcgccgaca gcgcgtggtt cgacactccg ctccggccgc acaccgacaa tctctgcaac 1620 tgcctcgaga cgagccccga ctcgatcggc gacgtcgcga gcaaccgcga gaacctggtg 1680 cgccgctacg agctggctcc gtactactac tcgctcgcgc accgcgctca ccagttcggc 1740 gagccgctcg ctcccccgct cgtgtactac taccagaacg acgaccacgt tcgcgagatg 1800 gggcatcaga agatgctcgg gcgcgacctg ctgatcgcga tcgtcgccgg agagggcgag 1860 cgggaacgcg acgtgtacct tccggcgggc gagtggatcg acatccacac gaacgagcgc 1920 atccagagca cgggtcagtg gatcgacaac gtgccgctgt ggcgtgacgg cgtcttcacc 1980 ctgccggcgt acgcccgggc gggggcgatc atcccgaagg ccttcgtcga cgcctccacg 2040 aaggacatca ccggcaagcg cgaggatgcc gcggtgcgca acgagctgat cgcaaccgtt 2100 tacgccgacg acgtcgcgag cgacttcacc ctgtacgagg atgacggcgc gacgaccgca 2160 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2l〇x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-104 1269810 A7 B7 五、發明説明（1〇2) tacgccgacg acggtgacgg gtcgtcgagc ctgacggagc ggcggggggc tcgttcacgc acct tcggtc gcggatgccg ctgccgccgt aacacggcgg tcggcgggga gggctgtcag tgggagcggc t tgtcactga acgcgaacaa tcgttgtggc tcggtgagga agtcagtgta tgaagctcga cgagcacggt atgcgtggga taaccaccgg gaccacgcag atctggaacc cggcacgcag ggcggcgttc caaggcggcg gtcggtctgg cgtcgtcgga gccgagcgcc cgaatggaag gcccggcggg cgccttc atcagccaat tactccggtg gcctcgaccg gacgcggcga agcagttcgg gcgacgttct aatgttccgc taccccacct tgcatcaaac aacaacatcc cgctcacgaa cgccctccac tctccctcgg gcagcggctg tgaacaccgc cctgcgagaa agctcggcaa ggaccggggt gtcaggaggc tctcgacgcc cggcgtggcc ccgtcccacg cagcgttccg gtacaacgcc caagacct tc cgccacgacg ctggtcgccg ggtgcggaac cggcctgccg accttccggc 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2787 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210> 7 〈211〉 9 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 7 Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu lie 1 5 <210> 8 <211〉 10 〈212〉 PRT <213〉 Microorganism <400> 8 Asp lie Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys 1 5 10 <210> 9 <211> 14 〈212〉 PRT 〈213〉 Microorganism 〈400〉 9 Gin Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys 1 5 10 〈210〉 10 <211> 31 <212〉 PRT <213> Microorganism (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（2⑴X 297公釐） 105- 1269810 A7 B7 五、發明説明（103 ) <400〉 10 Ala Ser lie Asn Thr Asn His Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val 1 5 10 15 Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys 20 25 30 〈210〉 11 <211〉 25 〈212〉 PRT 〈213〉 Microorganism <400> 11 Leu Leu Leu Ser Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gin Asn 1 5 10 15 Leu Leu Asp Asn Pro Gly Phe Glu Arg 20 25 <210〉 12 <211〉 14 <212〉 PRT <213〉 Microorganism <400> 12 Asp lie Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp lie Asp Tyr Ala Arg 1 5 10 <210〉 13 <211〉 33 <212〉 PRT 〈213〉 Microorganism <400〉 13 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

衣·

、1T

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Asp Ala Ser Ala Asn Val Thr Thr Gin Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gin Asp Tyr Phe lie Pro 20 25 30 Val <210〉 14 <211> 24 <212〉 PRT 〈213〉 Microorganism <400〉 14 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -106- 1269810 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7五、發明説明（104) Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Asn Val Asn lie Asp Asn lie 1 5 10 15 Thr Val Pro Phe Ala Pro lie lie 20 <210> 15 <211> 16 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 15 Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gin 1 5 10 15 <210〉 16 <211〉 17 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 16 Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Thr Asn Gin Thr Glu 15 10 15 Phe 〈210〉 17 〈211〉 20 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 17 Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro 15 10 15 Val Val Asp Lys 20 <210〉 18 <211〉 5294 <212〉 DNA <213〉 Microorganism<220〉 <221〉 CDS 〈222〉（937)..· (4785) <400〉 18 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 冒裝_ 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -107- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（105) atctaccggt ttttgtgaag tttggcagta ttcttccgat gaatttgaac gcgcaatatc 60 aagtgggcgg gaccattggc aacagcttga cgagctacac gaatctcgcg ttccgcattt 120 atccgcttgg gacaacaacg tacgactgga atgatgatat tggcggttcg gtgaaaacca 180 taacttctac agagcaatat gggttgaata aagaaaccgt gactgttcca gcgattaatt 240 ctaccaagac attgcaagtg tttacgacta agccttcctc tgtaacggtg ggtggttctg 360 tgatgacaga gtacagtact ttaactgccc taacgggagc gtcgacaggc tggtactatg 420 atactgtaca gaaattcact tacgtcaagc ttggttcaag tgcatctgct caatccgttg 480 tgctaaatgg cgttaataag gtggaatatg aagcagaatt cggcgtgcaa agcggcgttt 540 caacgaacac gaaccatgca ggttatactg gtacaggatt tgtggacggc tttgagactc 600 ttggagacaa tgttgctttt gatgtttccg tcaaagccgc aggtacttat acgatgaagg 660 ttcggtattc atccggtgca ggcaatggct caagagccat ctatgtgaat aacaccaaag 720 tgacggacct tgccttgccg caaacaacaa gctgggatac atgggggact gctacgttta 780 gcgtctcgct gagtacaggt ctcaacacgg tgaaagtcag ctatgatggt accagttcac 840 ttggcattaa tttcgataac atcgcgattg tagagcaata aaaggtcggg agggcaagtc 900 cctcccttaa tttctaatcg aaagggagta tccttg 936 atg cgt cca cca aac aaa gaa att cca cgt att ctt get ttt ttt aca 978

Met Arg Pro Pro Asn Lys Glu lie Pro Arg lie Leu Ala Phe Phe Thr l 5 10 15 geg ttt aeg ttg ttt ggt tea acc ctt gee ttg ctt cct get ccg cct 1026

Ala Phe Thr Leu Phe Gly Ser Thr Leu Ala Leu Leu Pro Ala Pro Pro 20 25 30 geg cat gee tat gtc age age eta gga aat etc att tet teg agt gtc 1074

Ala His Ala Tyr Val Ser Ser Leu Gly Asn Leu lie Ser Ser Ser Val 35 40 45 acc gga gat acc ttg aeg eta act gtt gat aac ggt geg gag ccg agt 1122

Thr Gly Asp Thr Leu Thr Leu Thr Val Asp Asn Gly Ala Glu Pro Ser 50 55 60 gat gac etc ttg att gtt caa geg gtg caa aac ggt att ttg aag gtg 1170

Asp Asp Leu Leu lie Val Gin Ala Val Gin Asn Gly He Leu Lys Val 65 70 75 80 gat tat cgt cca aat age ata aeg ccg age geg aag aeg ccg atg ctg 1218

Asp Tyr Arg Pro Asn Ser lie Thr Pro Ser Ala Lys Thr Pro Met Leu 85 90 95 gat ccg aac aaa act tgg tea get gta gga get aeg att aat aeg aca 1266

Asp Pro Asn Lys Thr Trp Ser Ala Val Gly Ala Thr He Asn Thr Thr 100 105 no gee aat cca atg acc ate aeg act tee aat atg aag att gag att acc 1314

Ala Asn Pro Met Thr lie Thr Thr Ser Asn Met Lys He Glu He Thr 115 120 125 aag aat cca gta ega atg aeg gtc aag aag geg gac ggc act aeg eta 1362 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -108- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

1269810 A7 B7 五、發明説明（1〇6)

Lys Asn Pro Val Arg Met Thr Val Lys Lys Ala Asp Gly Thr Thr Leu 130 135 140 ttc tgg gaa cca tea ggc gga ggg gta ttc tea gac ggt gtg ege ttc 1410

Phe Trp Glu Pro Ser Gly Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe 145 150 155 160 ett cat gee aca ggg gat aat atg tat ggc ate egg age ttc aat get 1458

Leu His Ala Thr Gly Asp Asn Met Tyr Gly lie Arg Ser Phe Asn Ala 165 170 175 ttt gat age ggg ggt gac ctg ctg egg aat teg tee aat cat gee gee 1506

Phe Asp Ser Gly Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Asn His Ala Ala 180 185 190 cat geg ggt gaa cag gga gat tee ggt ggt ccg ett att tgg agt aeg 1554

His Ala Gly Glu Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu lie Trp Ser Thr 195 200 205 gca gga tat gga eta tta gtc gat age gat ggc ggc tac ccc tat aca 1602

Ala Gly Tyr Gly Leu Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Tyr Thr 210 215 220 gat age aca acc ggt caa atg gag ttt tat tat ggt ggg acc cct cct 1650

Asp Ser Thr Thr Gly Gin Met Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro 225 230 235 240 gag gga cgt cgt tat geg aaa caa aac gtg gaa tat tat att atg etc 1698

Glu Gly Arg Arg Tyr Ala Lys Gin Asn Val Glu Tyr Tyr lie Met Leu 245 250 255 gga acc ccc aag gaa att atg acc gac gta ggg gaa ate aca ggg aaa 1746

Gly Thr Pro Lys Glu lie Met Thr Asp Yal Gly Glu lie Thr Gly Lys 260 265 270 ccg cct atg ctg cct aag tgg teg ett gga ttc atg aac ttt gag tgg 1794

Pro Pro Met Leu Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp 275 280 285 gat aeg aat caa aeg gag ttt aeg aat aat gtg gat aeg tat cgt gee 1842

Asp Thr Asn Gin Thr Glu Phe Thr Asn Asn Val Asp Thr Tyr Arg Ala 290 295 300 aaa aat ate ccc ata gat get tac gee ttc gac tat gac tgg aaa aag 1890

Lys Asn He Pro lie Asp Ala Tyr Ala Phe Asp Tyr Asp Trp Lys Lys 305 310 315 320 tac ggg gaa acc aac tat ggt gaa ttc geg tgg aat aeg act aat ttc 1938

Tyr Gly Glu Thr Asn Tyr Gly Glu Phe Ala Trp Asn Thr Thr Asn Phe 325 330 335 cct tet geg tea aeg act tet tta aag tea aca atg gat get aaa ggc 1986

Pro Ser Ala Ser Thr Thr Ser Leu Lys Ser Thr Met Asp Ala Lys Gly 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -109- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（107) 340 345 350 ate aaa atg ate gga att aca aaa ccc ege ate gtt aeg aag gat get 2034 He Lys Met lie Gly He Thr Lys Pro Arg lie Val Thr Lys Asp Ala 355 360 365 tea geg aat gtg aeg acc caa ggg aeg gac geg aca aat ggc ggt tat 2082 Ser Ala Asn Yal Thr Thr Gin Gly Thr Asp Ala Thr Asn Gly Gly Tyr 370 375 380 ttt tat cca ggc cat aac gag tat cag gat tat ttc att ccc gta act 2130 Phe Tyr Pro Gly His Asn Glu Tyr Gin Asp Tyr Phe lie Pro Val Thr 385 390 395 400 gtg cgt agt ate gat cct tac aat get aac gaa cgt get tgg ttc tgg 2178 Val Arg Ser lie Asp Pro Tyr Asn Ala Asn Glu Arg Ala Trp Phe Trp 405 410 415 aat cat tee aca gat geg ett aat aaa ggg ate gta ggt tgg tgg aat 2226 Asn His Ser Thr Asp Ala Leu Asn Lys Gly lie Val Gly Trp Trp Asn 420 425 430 gac gag aeg gat aaa gta tet teg ggt gga geg tta tat tgg ttt ggc 2274 Asp Glu Thr Asp Lys Val Ser Ser Gly Gly Ala Leu Tyr Trp Phe Gly 435 440 445 aat ttc aca aca ggc cac atg tet cag aeg atg tac gaa ggg ggg egg 2322 Asn Phe Thr Thr Gly His Met Ser Gin Thr Met Tyr Glu Gly Gly Arg 450 455 460 get tac aeg agt gga geg cag cgt gtt tgg caa aeg get aga acc ttc 2370 Ala Tyr Thr Ser Gly Ala Gin Arg Val Trp Gin Thr Ala Arg Thr Phe 465 470 475 480 tac cca ggt gee cag egg tat geg act aeg ett tgg tet ggc gat att 2418 Tyr Pro Gly Ala Gin Arg Tyr Ala Thr Thr Leu Trp Ser Gly Asp lie 485 490 495 ggc att caa tac aat aaa ggc gaa egg ate aat tgg get gee ggg atg 2466 Gly lie Gin Tyr Asn Lys Gly Glu Arg lie Asn Trp Ala Ala Gly Met 500 505 510 cag gag caa agg gca gtt atg eta tee tee gtg aac aat ggc cag gtg 2514 Gin Glu Gin Arg Ala Val Met Leu Ser Ser Val Asn Asn Gly Gin Val 515 520 525 aaa tgg ggc atg gat acc ggc gga ttc aat cag cag gat ggc aeg aeg 2562 Lys Trp Gly Met Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gin Gin Asp Gly Thr Thr 530 535 540 aac aat ccg aat ccc gat tta tac get egg tgg atg cag ttc agt gee 2610 Asn Asn Pro Asn Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gin Phe Ser Ala 545 550 555 560 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） -110- 1269810 A7 經濟部智慧財產局員工消費舍作社印製 B7五、發明説明（108) eta aeg cct gtt ttc ega gtg cat ggg aac aac cat cag cag ege cag 2658 Leu Thr Pro Val Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gin Gin Arg Gin 565 570 575 cca tgg tac ttc gga teg act geg gag gag gee tee aaa gag gca att 2706 Pro Trp Tyr Phe Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala lie 580 585 590 cag ctg egg tac tee ctg ate cct tat atg tat gee tat gag aga agt 2754 Gin Leu Arg Tyr Ser Leu lie Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser 595 600 605 get tac gag aat ggg aat ggg etc gtt egg cca ttg atg caa gee tat 2802 Ala Tyr Glu Asn Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gin Ala Tyr 610 615 620 cca aca gat geg gee gtc aaa aat tac aeg gat get tgg atg ttt ggt 2850 Pro Thr Asp Ala Ala Val Lys Asn Tyr Thr Asp Ala Trp Met Phe Gly 625 630 635 640 gac tgg ctg ctg get gca cct gtg gta gat aaa cag cag aeg agt aag 2898 Asp Trp Leu Leu Ala Ala Pro Val Val Asp Lys Gin Gin Thr Ser Lys 645 650 655 gat ate tat tta ccg tet ggg tea tgg att gac tat geg ega ggc aat 2946 Asp He Tyr Leu Pro Ser Gly Ser Trp lie Asp Tyr Ala Arg Gly Asn 660 665 670 gca ata act ggc ggt caa acc ate ega tat teg gtt aat ccg gac aeg 2994 Ala lie Thr Gly Gly Gin Thr lie Arg Tyr Ser Val Asn Pro Asp Thr 675 680 685 ttg aca gac atg cct etc ttt att aaa aaa ggt gee att att cca aca 3042 Leu Thr Asp Met Pro Leu Phe lie Lys Lys Gly Ala lie lie Pro Thr 690 695 700 cag aaa gtg cag gat tac gta ggg cag get tee gtc act tee gtt gat 3090 Gin Lys Val Gin Asp Tyr Val Gly Gin Ala Ser Val Thr Ser Val Asp 705 710 715 720 gtg gat gtg ttt ccg gat aeg aeg cag teg agt ttc aeg tac tac gat 3138 Val Asp Val Phe Pro Asp Thr Thr Gin Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp 725 730 735 gat gat ggc gee agt tat aac tat gag age ggc act tat ttt aag caa 3186 Asp Asp. Gly Ala Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Thr Tyr Phe Lys Gin 740 745 750 aat atg act get cag gat aat ggg tea ggc teg tta agt ttt act tta 3234 Asn Met Thr Ala Gin Asp Asn Gly Ser Gly Ser Leu Ser Phe Thr Leu 755 760 765 gga gca aag agt ggc agt tac aeg ccg get etc caa tee tat ate gtt 3282 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -111 - 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（109)

Gly Ala Lys Ser Gly Ser Tyr Thr Pro Ala Leu Gin Ser Tyr lie Val 770 775 780 aag ctg cac ggt tct get gga act tct gtt acg aat aac age gca get 3330

Lys Leu His Gly Ser Ala Gly Thr Ser Val Thr Asn Asn Ser Ala Aia 785 790 795 800 atg aca tet tat gca age ttg gaa gca tta aaa get get get ggg gaa 3378

Met Thr Ser Tyr Ala Ser Leu Glu Ala Leu Lys Ala Ala Ala Gly Glu 805 810 815 ggc tgg geg act ggg aag gac att tat ggg gat gtc acc tat gtg aaa 3428

Gly Trp Ala Thr Gly Lys Asp lie Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys 820 825 830 gtg aeg gca ggt aca get tet tet aaa tet att get gtt aca ggt gtt 3474

Val Thr Ala Gly Thr Ala Ser Ser Lys Ser lie Ala Val Thr Gly Val 835 840 845 get gee gtg age gca act act teg caa tac gaa get gag gat gca teg 3522

Ala Ala Val Ser Ala Thr Thr Ser Gin Tyr Glu Ala Glu Asp Ala Ser 850 855 860 ett tet ggc aat teg gtt get gca aag geg tee ata aac aeg aat cat 3570

Leu Ser Gly Asn Ser Val Ala Ala Lys Ala Ser lie Asn Thr Asn His 865 870 875 880 acc gga tat aeg gga act gga ttt gta gat ggt ttg ggg aat gat ggc 3618

Thr Gly Tyr Thr Gly Thr Gly Phe Val Asp Gly Leu Gly Asn Asp Gly 885 890 895 get ggt gtc acc ttc tat cca aag gtg aaa act ggc ggt gac tac aat 3666

Ala Gly Val Thr Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn 900 905 910 gtc tee ttg cgt tat geg aat get tea ggc aeg get aag tea gtc agt 3714

Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ala Ser Gly Thr Ala Lys Ser Val Ser 915 920 925 att ttt gtt aat gga aaa aga gtg aag tee acc teg etc get aat etc 3762

He Phe Val Asn Gly Lys Arg Yal Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu 930 935 940 gca aat tgg gac act tgg tet aca caa tet gag aca ctg ccg ttg aeg 3810

Ala Asn Trp Asp Thr Trp Ser Thr Gin Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr 945 950 955 960 gca ggt gtg aat gtt gtg acc tat aaa tat tac tee gat geg gga gat 3858

Ala Gly Val Asn Val Val Thr Tyr Lys Tyr Tyr Ser Asp Ala Gly Asp 965 970 975 aca ggc aat gtt aac ate gac aac ate aeg gta cct ttt geg cca att 3906

Thr Gly Asn Val Asn lie Asp Asn He Thr Val Pro Phe Ala Pro lie 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-112- 1269810 A7 B7 五、發明説明（no) 980 985 990 ate ggt aag tat gaa gca gag agt get gag ett tet ggt ggc age tea 3954 lie Gly Lys Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Ser 995 1000 1005 ttg aac aeg aac cat tgg tac tac agt ggt aeg get ttt gta gac ggt 4002

Leu Asn Thr Asn His Trp Tyr Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Yal Asp Gly 1010 1015 1020 ttg agt get gta ggc geg cag gtg aaa tac aac gtg aat gtc cct age 4050

Leu Ser Ala Val Gly Ala Gin Val Lys Tyr Asn Val Asn Val Pro Ser 1025 1030 1035 1040 gca gga agt tat cag gta geg ctg ega tat geg aat ggc agt gca geg 4098

Ala Gly Ser Tyr Gin Val Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Ser Ala Ala 1045 1050 1055 aeg aaa aeg ttg agt act tat ate aat gga gee aag ctg ggg caa acc 4146

Thr Lys Thr Leu Ser Thr Tyr lie Asn Gly Ala Lys Leu Gly Gin Thr 1060 1065 1070 agt ttt aeg agt cct ggt aeg aat tgg aat gtt tgg cag gat aat gtg 4194

Ser Phe Thr Ser Pro Gly Thr Asn Trp Asn Val Trp Gin Asp Asn Val 1075 1080 1085 caa aeg gtg aeg tta aat gca ggg gca aac aeg att geg ttt aaa tac 4242

Gin Thr Val Thr Leu Asn Ala Gly Ala Asn Thr lie Ala Phe Lys Tyr 1090 1095 1100 gac gee get gac age ggg aac ate aac gta gat cgt ctg. ett ett tea 4290

Asp Ala Ala Asp Ser Gly Asn lie Asn Val Asp Arg Leu Leu Leu Ser 1105 1110 1115 1120 act teg gca geg gga aeg ccg gtt tet gag cag aac ctg eta gac aat 4338

Thr Ser Ala Ala Gly Thr Pro Val Ser Glu Gin Asn Leu Leu Asp Asn 1125 1130 1135 ccc ggt ttc gag cgt gac aeg agt caa acc aat aac tgg att gag tgg 4386

Pro Gly Phe Glu Arg Asp Thr Ser Gin Thr Asn Asn Trp lie Glu Trp 1140 1145 1150 cat cca ggc aeg caa get gtt get ttt ggc gtt gat age ggc tea acc 4434

His Pro Gly Thr Gin Ala Val Ala Phe Gly Val Asp Ser Gly Ser Thr 1155 1160 1165 acc aat ccg ccg gaa tee ccg tgg teg ggt gat aag cgt gee tac ttc 4482

Thr Asn Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ser Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe 1170 1175 1180 ttt gca gca ggt gee tat caa caa age ate cat caa acc att agt gtt 4530

Phe Ala Ala Gly Ala Tyr Gin Gin Ser He His Gin Thr lie Ser Val 1185 1190 1195 1200 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -113- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（111) cct gtt aat aat gta aaa tac aaa ttt gaa gcc tgg gtc cgc atg aag 4578 Pro Val Asn Asn Val Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Arg Met Lys 1205 1210 1215 aat acg acg ccg acg acg gca aga gcc gaa att caa aac tat ggc gga 4626 Asn Thr Thr Pro Thr Thr Ala Arg Ala Glu lie Gin Asn Tyr Gly Gly 1220 1225 1230 tea gcc att tat geg aac ata agt aac age ggt gtt tgg aaa tat ate 4674 Ser Ala lie Tyr Ala Asn lie Ser Asn Ser Gly Val Trp Lys Tyr lie 1235 1240 1245 age gta agt gat att atg gtg acc aat ggt cag ata gat gtt gga ttt 4722 Ser Yal Ser Asp lie Met Val Thr Asn Gly Gin lie Asp Val Gly Phe 1250 1255 1260 tac gtg gat tea cct ggt gga act acg ett cac att gat gat gtg cgc 4770 Tyr Val Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His lie Asp Asp Val Arg 1265 1270 1275 1280 gta acc aaa caa taa 4785 Val Thr Lys Gin 1284 acaaacaacc agctctcccg ttaatgggag ggctggttgt ttgttatgat aatccatcta 4845 tttagagtgg attaaacgtt ttgaagtgct tgctgaactt cttgcacaat ggataaegee 4905 gcggtgcggg cacttgagaa ageaegttet gcaagctctc ccttacctgt acagccgtct 4965 ccgcagaagt agaaaggaac gttttccacg egtateggea gcagattatt ggaagcaatg 5025 tttttcacgc tggaaaccat cgctttcttg gaaacccgtt tcacggctgt gacatcgcgc 5085 cagcctggat aatgtttatc aaataagget tccatttgga ggttcttctc ttccaggtac 5145 getttgeget gctcctcgtt atcaaagcgg tegettaagt atgcgatacc ttgeageage 5265 tgcccgcctt ctggtactag tgtgtgatc 5294 <210〉 19 <211> 8 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 19 His Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu 1 5 <210> 20 <211> 19 <212〉 PRT 〈213〉 Microorganism<400〉 20 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（21〇 X 297公釐） -114- 1269810 A7 B7 五、發明説明（112 ) Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg Tyr Ala Asn Ser Thr Gly 15 10 15 Ala Ala Lys <210> 21 〈211〉 20 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 21 Asp Phe Ser Asn Asn Pro Thr Val Gin Gly Thr Asp Ala Ala Ser Gly 1 5 10 15 Gly Tyr Phe Tyr 20 〈210〉 22 <211> 25 <212> PRT <213〉 Microorganism <400> 22 Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr Gin lie Ala Leu Arg 1 5 10 15 Try Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys 20 25 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 <210〉 23 〈211〉 25 <212〉 PRT <213〉 Microorganism <400> 23 Tyr Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gin 1 5 10 15 Asn His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala 20 25 〈210〉 24 <211〉 11 〈212〉 PRT 〈213〉 Microorganism <400> 24 Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） -115 - 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（113) 1 5 10 <210〉 25 〈211> 4991 〈212> DNA <213〉 Microorganism <220〉 <221〉 CDS <222> (466)...(4326) <400> 25 ggtaccggct ttgtcgacgg cttcgatgcg gcaggcgatg cagtgacctt cgacgtatcc 60 gtcaaagcgg ccggcacgta tgcgctcaag gtccggtacg cttccgctgg tggcaacgct 120 tcacgcgcta tctatgtcaa caacgccaag gtgaccgatc tggcgcttcc ggcaacggcc 180 aactgggaca cctgggggac ggcaaccgtc aacgtagcct taaacgccgg ctacaactcg 240 atcaaggtca gctacgacaa caccaatacg ctcggcatta atctcgataa cattgcgatc 300 gtggagcatt gacagcagga atcttcgcga ggaatgagtt agcgaagagt tcatgcaggc 360 agaggggtta cccataattg taaagcccgg cgcagccagg caccaagtat gcccgggagg 420 gccgccggcc ctccctttat ttcaatgatg aaaggcggca tcgat atg ggt eta tgg 477 Met Gly Leu Trp 1 aac aaa ega gtc act ege ate etc tee gta etc gca gca age geg ctg 525 Asn Lys Arg Val Thr Arg lie Leu Ser Val Leu Ala Ala Ser Ala Leu 5 10 15 20 ate ggc tet acc gta cct tet eta geg cca cct ccc get caa gee cat 573 lie Gly Ser Thr Val Pro Ser Leu Ala Pro Pro Pro Ala Gin Ala His 25 30 35 gtg age geg ctg ggc aac ctg ett tee teg geg gtg acc ggg gat aeg 621 Val Ser Ala Leu Gly Asn Leu Leu Ser Ser Ala Val Thr Gly Asp Thr 40 45 50 etc aeg ctg aeg ate gat aac ggc geg gaa ccg aat gac gat att eta 669 Leu Thr Leu Thr He Asp Asn Gly Ala Glu Pro Asn Asp Asp lie Leu 55 60 65 gtt ctg caa gca gtc cag aac ggt att ctg aag gtg gac tac egg ccg 7Π Val Leu Gin Ala Val Gin Asn Gly lie Leu Lys Val Asp Tyr Arg Pro 70 75 80 aac ggt gta get cca age geg gat aeg ccg atg ctg gat ccc aat aaa 765 Asn Gly Val Ala Pro Ser Ala Asp Thr Pro Met Leu Asp Pro Asn Lys 85 90 95 100 acc tgg ccg tec ata ggc gee gtt ate aat aca gee tet aat ccg atg 813 Thr Trp Pro Ser lie Gly Ala Val lie Asn Thr Ala Ser Asn Pro Met (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x297公釐） -116- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（114) 105 Π0 115 acg ate aca acg ccg gcg atg aag att gag att gcc aaa aat ccg gtg 861

Thr lie Thr Thr Pro Ala Met Lys lie Glu lie Ala Lys Asn Pro Val 120 125 130 ege ctg acc gtg aaa aaa ccg gac ggc acc get ctg tta tgg gaa ccc 909

Arg Leu Thr Val Lys Lys Pro Asp Gly Thr Ala Leu Leu Trp Glu Pro 135 140 145 ccg acc ggc ggc gtc ttc teg gac ggc gtc cgt ttc ttg cac ggg aeg 957

Pro Thr Gly Gly Val Phe Ser Asp Gly Val Arg Phe Leu His Gly Thr 150 155 160 ggc gac aat atg tac ggc ate ege age itc aat get ttt gac age ggc 1005

Gly Asp Asn Met Tyr Gly He Arg Ser Phe Asn Ala Phe Asp Ser Gly 165 170 Π5 180 ggg gat ctg ctg ege aac age tee acc caa gee gee cgt gca ggc gac 1053

Gly Asp Leu Leu Arg Asn Ser Ser Thr Gin Ala Ala Arg Ala Gly Asp 185 19〇 195 cag ggc aac tee ggc ggc ccg ctg ate tgg age aca gee ggg tac ggg n〇i

Gin Gly Asn Ser Gly Gly Pro Leu lie Trp Ser Thr Ala Gly Tyr Gly 200 205 210 gtg etc gtt gac age gac ggt ggg tat ccg ttc aeg gac gag get acc 1149

Val Leu Val Asp Ser Asp Gly Gly Tyr Pro Phe Thr Asp Glu Ala Thr 215 220 225 ggc aag ctg gag ttc tat tac ggc ggc aeg cct ccg gaa ggc egg ege 1197

Gly Lys Leu Glu Phe Tyr Tyr Gly Gly Thr Pro Pro Glu Gly Arg Arg 230 235 240 tat aeg aag cag gat gtg gag tac tac ate atg etc ggc aeg ccg aaa 1245

Tyr Thr Lys Gin Asp Val Glu Tyr Tyr lie Met Leu Gly Thr Pro Lys 245 250 255 260 gag ate atg tee ggc gtc ggg gaa att aeg ggc aaa ccg ccg atg ctg 1293

Glu lie Met Ser Gly Val Gly Glu lie Thr Gly Lys Pro Pro Met Leu 265 270 275 ccc aag tgg tee ctg ggc ttt atg aac ttc gag tgg gat ctg aat gaa 1345

Pro Lys Trp Ser Leu Gly Phe Met Asn Phe Glu Trp Asp Leu Asn Glu 280 285 290 get gag etc aag aac cat gtg gat aeg tac egg gee aaa aat att ccg 1339

Ala Glu Leu Lys Asn His Val Asp Thr Tyr Arg Ala Lys Asn He Pro 295 300 305 ate gac ggc tat geg ate gat ttc gat tgg aag aag tac ggc gag aat 1437 lie Asp Gly Tyr Ala lie Asp Phe Asp Trp Lys Lys Tyr Gly Glu Asn 310 315 320 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

-117 14851269810 A7 B7 五、發明説明（115) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 aat tac ggc Asn Tyr Giy 325 acg acg gcg Thr Thr Ala Sgc ata acc Gly lie Thr acc gtg cag Thr Val Gin 375 cat age gaa His Ser Glu 390 gac cct tat Asp Pro Tyr 405 gat gcg ttc Asp Ala Phe gcg gta teg Ala Val Ser ggc cat atg Gly His Met 455 aac gcc cag Asn Ala Gin 470 cag cgt tat Gin Arg Tyr 485 acc aag ggg Thr Lys Gly gcg gtg atg Ala Val Met gac aca ggc gaa ttc Glu Phe ctg aag Leu Lys 345 aag cct Lys Pro 360 gga acg Gly Thr tac aag Tyr Lys aac cct Asn Pro gat aaa Asp Lys 425 teg gga Ser Gly 440 tcc cag Ser Gin ege gtc Arg Val gcg acg Ala Thr gaa aga Glu Arg 505 ett tet Leu Ser 520 ggc ttc get tgg Ala Trp 330 teg cag Ser Gin ege ate Arg He gac gcg Asp Ala gac tac Asp Tyr 395 get gca Ala Ala 410 ggc ate Gly He ggg gee Gly Ala gcg ett Ala Leu tgg cag Trp Gin 475 acg etc Thr Leu 490 ate aac He Asn aat acg Asn Thr atg gac Met Asp gcg acg Ala Thr 365 gcg age Ala Ser 380 ttc ate Phe lie ege tec Arg Ser gta ggc Val Gly tec tac Ser Tyr 445 tac gag Tyr Glu 460 aca gcg Thr Ala tgg teg Trp Ser tgg get Trp Ala gcc aat Ala Asn 335 gcc aag Ala Lys 350 aag gat Lys Asp ggc ggt Gly Gly ccg gtc Pro Val tgg ttc Trp Phe 415 tgg tgg Trp Trp 430 tgg ttc Trp Phe gga cag Gly Gin ege acg Arg Thr gga gac Gly Asp 495 gcc ggc Ala Gly 510 ggc cag Gly Gin ttc cct Phe Pro ggc att Gly lie ttt teg Phe Ser tat ttt Tyr Phe 385 ttt gtg Phe Val 400 tgg aac Trp Asn aac gac Asn Asp ggc aat Gly Asn egg gca Arg Ala 465 ttc tat Phe Tyr 480 ate ggg lie Gly atg cag Met Gin gtc aaa Val Lys teg ate aac aac Ser He Asn Asn 525 aac cag cag gac ggc acg acg aac tec gee gcc Ser Ala Ala 340 aaa atg ate Lys Met [le 355 aac aat cct Asn Asn Pro 370 tat ccg gga Tyr Pro Giy ege age ate Arg Ser lie cac tec aag His Ser Lys 420 sag acg gat Glu Thr Asp 435 ttt acg acc Phe Thr Thr 450 tat acg teg Tyr Thr Ser ecc ggg gcg Pro Gly Ala att cag tat lie Gin Tyr 500 gag cag egg Glu Gin Arg 515 lSg gga atg Trp Gly Met 530 aat CCg 1533 1581 1629 1677 1725 1773 1821 1869 1917 1965 2013 2061 aat 2109 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21 〇x297公釐） -118 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1269810 A7 B7 五、發明说明（116)

Asp Thr Gly Gly Phe Asn Gin Gin Asp Gly Thr Thr Asn Asn Pr〇 Asn 535 540 545 ccg gac ctg tac gcc aga tgg atg cag ttc age gcg ctg act ccg gtg 2157

Pro Asp Leu Tyr Ala Arg Trp Met Gin Phe Ser Ala Leu Thr Pr〇 val 550 555 56〇 ttc ege gtg cat ggc aac aat cac cag cag ege cag cct tgg tat tat 2205

Phe Arg Val His Gly Asn Asn His Gin Gin Arg Gin Pro Trp Tyr Tyr 565 570 575 580 ggc teg aca gee gag gag gca tee aag gaa geg etc cag etc cgt tac 2253

Gly Ser Thr Ala Glu Glu Ala Ser Lys Glu Ala Leu Gin Leu Arg Tyr 585 590 595 tee ctg att cct tat atg tat get tac gaa aga age gee tac gag aac 2301

Ser Leu lie Pro Tyr Met Tyr Ala Tyr Glu Arg Ser Ala Tyr Glu Asn 600 605 610 ggt aac gga ett gtc egg ccg ctg atg cag gaa tac cct gee gat gee 2349

Gly Asn Gly Leu Val Arg Pro Leu Met Gin Glu Tyr Pro Ala Asp Ala 615 620 625 aac gee aaa aac tat etc gat gee tgg atg ttc ggc gat tgg ctg ctg 2397

Asn Ala Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Trp Met Phe Gly Asp Trp Leu Leu 630 635 640 geg geg cct gtg gtc gag aag cag cag acc tee aag gaa ate tat etc 2445

Ala Ala Pro Val Val Glu Lys Gin Gin Thr Ser Lys Glu lie Tyr Leu 645 650 655 660 cct gca ggc act tgg att gac tac aac egg ggc aeg gtg etc acc ggc 2493

Pro Ala Gly Thr Trp lie Asp Tyr Asn Arg Gly Thr Val Leu Thr Gly 665 670 675 ggc cag aag ate age tac gee gtc aat ccc gac aeg ctg aeg gat att 2541

Gly Gin Lys lie Ser Tyr Ala Val Asn Pro Asp Thr Leu Thr Asp lie 680 685 690 ccg etc ttc att aag aag ggc geg att ate cct teg cag aag gtg cag 2589

Pr〇 Leu Phe lie Lys Lys Gly Ala lie lie Pro Ser Gin Lys Val Gin 695 700 705 gac tac gtg ggc cag get ccc gtc caa aeg gtg gat gtg gat gta ttc 2637

AsP Tyr Val Gly Gin Ala Pro Val Gin Thr Val Asp Val Asp Val Phe 7l〇 715 720 cc§ aat aeg gca caa teg age ttt acc tat tat gac gat gac ggc age 2685

Pr〇 Asn Thr Ala Gin Ser Ser Phe Thr Tyr Tyr Asp Asp Asp Gly Ser 725 730 735 740 aSc tac aat tat gaa age gga get tac ttc aag caa ttg atg aeg get 2733

Ser Tyr Asn Tyr Glu Ser Gly Ala Tyr Phe Lys Gin Leu Met Thr Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ

•119- 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（117) 745 750 755 cag gac aac gga tcc ggt gcg ctg age ttt acg ctg ggc gcc aaa acc 2781 Gin Asp Asn Gly Ser Gly Ala Leu Ser Phe Thr Leu Gly Ala Lys Thr 760 765 770 ggc aeg tac age ccc gca ctg caa tee tat ate gtc aag ett cac ggg 2829 Gly Thr Tyr Ser Pro Ala Leu Gin Ser Tyr He Val Lys Leu His Gly 775 780 785 gee gca ggc geg teg gtg aca age aat ggg geg geg ctg gee tee tat 2877 Ala Ala Gly Ala Ser Val Thr Ser Asn Gly Ala Ala Leu Ala Ser Tyr 790 795 800 gee age ctg caa geg ctg aaa gee tea gee agt gaa ggc tgg gee aag 2925 Ala Ser Leu Gin Ala Leu Lys Ala Ser Ala Ser Glu Gly Trp Ala Lys 805 810 815 82〇 ggc aag gac ate tac ggc gat gtc aeg tat gtc aag eta tee geg ggg 2973 Gly Lys Asp lie Tyr Gly Asp Val Thr Tyr Val Lys Leu Ser Ala Gly 825 830 835 gca geg geg gee aag geg att gee gtc acc ggc aac age ccg gtc age 3021 Ala Ala Ala Ala Lys Ala lie Ala Val Thr Gly Asn Ser Pro Val Ser 840 845 850 gtg geg gat gtg cag tac gaa gee gaa gaa get teg ctg tee ggc aat 3069 Val Ala Asp Val Gin Tyr Glu Ala Glu Glu Ala Ser Leu Ser Gly Asn 855 860 865 aeg aca gca acc aag geg acc gtg aat aeg aac cac gca ggc tac aeg 3117 Thr Thr Ala Thr Lys Ala Thr Val Asn Thr Asn His Ala Gly Tyr Thr 870 875 880 ggc age ggc ttc gtg gat gga ctg agt aat ccg gga geg geg gtt aeg 3165 Gly Ser Gly Phe Val Asp Gly Leu Ser Asn Pro Gly Ala Ala Val Thr 885 890 895 900 ttc tat ccg aag gtg aaa aeg ggc gga gac tac aat gtc teg ctg ege 3213 Phe Tyr Pro Lys Val Lys Thr Gly Gly Asp Tyr Asn Val Ser Leu Arg 905 910 915 tac get aat teg aeg gga geg gca aag age gtc age ate ttc gtt aac 3261 Tyr Ala Asn Ser Thr Gly Ala Ala Lys Ser Val Ser He Phe Val Asn 920 925 930 ggc aag ege gtc aaa tee aeg teg ctg geg aac ctg ccg aac tgg gat 3309 Gly Lys Arg Val Lys Ser Thr Ser Leu Ala Asn Leu Pro Asn Trp Asp 935 940 945 acg tgg ggg aeg cag get gag aca ctg ccg ctg aeg geg ggg aeg aac 3357 Thr Trp Gly Thr Gin Ala Glu Thr Leu Pro Leu Thr Ala Gly Thr Asn 950 955 960 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -120- 1269810 A7 B7 五、發明説明（118) gtt gtc acc tac aag ttc tac teg gat gee gga gat aeg ggc teg gtt 3405

Yal Val Thr Tyr Lys Phe Tyr Ser Asp Ala Gly Asp Thr Gly Ser Val 965 970 975 980 aac ctg gac aac ate aeg gtg ecc ttc get ccg gee ate ggc aaa tac 3453

Asn Leu Asp Asn lie Thr Val Pro Phe Ala Pro Ala lie Gly Lys Tyr 985 990 995 gag geg gag age gee gag ctg age ggc ggc age aeg gtc aac cag aat 3501

Glu Ala Glu Ser Ala Glu Leu Ser Gly Gly Ser Thr Val Asn Gin Asn 1000 1005 1010 cat tgg ttc tac age ggc aeg gca ttt gta gat ggc tta acc gca ccg 3549

His Trp Phe Tyr Ser Gly Thr Ala Phe Val Asp Gly Leu Thr Ala Pro 1015 1020 1025 ' ggc gee caa gtc aaa tat acc gtg aac gee ccg gee gca ggc age tac 3597 Gly Ala Gin Val Lys Tyr Thr Val Asn Ala Pro Ala Ala Gly Ser Tyr 1030 1035 1040 cag ate geg ett ege tat geg aac ggc aeg ggt get geg aag aeg etc 3645

Gin lie Ala Leu Arg Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Ala Ala Lys Thr Leu 1045 1050 1055 1060 age aeg tat gtg aac ggg aeg aag ctg ggg caa aeg gee ttc gee age 3693

Ser Thr Tyr Val Asn Gly Thr Lys Leu Gly Gin Thr Ala Phe Ala Ser 1065 1070 1075 cct ggc ggc aac tgg aac gtg tgg cag gac age gtg cag acc gtc geg 3741

Pro Gly Gly Asn Trp Asn Val Trp Gin Asp Ser Val Gin Thr Val Ala 1080 1085 logo ctc gcc gcc ggt aeg aac aeg atc geg ttc aag tac gat gee ggc gac 3789

Leu Ala Ala Gly Thr Asn Thr lie Ala Phe Lys Tyr Asp Ala Gly Asp 1095 1 100 nos age ggc age ggc age gtc aat ctg gac cgt ctg ttg etc tet gee gca 3837

Ser Gly Ser Gly Ser Val Asn Leu Asp Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala 1110 U15 1120 geg cca ggc gtg ccc gtg tee gag cag aac ctg etc gat aac ggg ggc 3885

Ala Pro Gly Val Pro Val Ser Glu Gin Asn Leu Leu Asp Asn Gly Gly Π25 1 130 1 135 U4〇 ttt gaa ege gat ccg teg cag age age aac tgg acc gag tgg cat ccg 3933

Phe Glu Arg Asp Pro Ser Gin Ser Ser Asn Trp Thr Glu Trp His Pro 1145 1150 ii55 get teg cag geg att get tac ggc ate gac age ggc tcc ggg atg aat 3931

Ala Ser Gin Ala lie Ala Tyr Gly lie Asp Ser Gly Ser Gly Met Asn Π60 1165 ll7〇 ccg cct gaa teg cca tgg gca ggc gat aag ege gee tat ttc tat geg 4029 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -121 1269810 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明説明（119) Pro Pro Glu Ser Pro Trp Ala Gly Asp Lys Arg Ala Tyr Phe Tyr Ala 1175 .1180 1185 gca ggc ccg tat cag caa age ate cat caa aca gtc age gtg cct gtc 4077 Ala Gly Pro Tyr Gin Gin Ser lie His Gin Thr Val Ser Val Pro Val 1190 1195 1200 aat aat gee aag tac aag ttc gaa gee tgg gta ttg ctg aag aat aca 4125 Asn Asn Ala Lys Tyr Lys Phe Glu Ala Trp Val Leu Leu Lys Asn Thr 1205 1210 1215 1220 aca ccg aca aeg gee egg gtg gag att caa aat tac ggc ggt teg ccg 4173 Thr Pro Thr Thr Ala Arg Val Glu lie Gin Asn Tyr Gly Gly Ser Pro 1225 1230 1235 ate ttc aeg aac ate agt aaa gac ggc gtc tgg aaa tac ate age gtc 4221 1 lie Phe Thr Asn lie Ser Lys Asp Gly Val Trp Lys Tyr lie Ser Val 1240 1245 1250 age gat att cag gtc aeg aac ggc caa ate gat att ggc ttc tat gtg 4269 Ser Asp lie Gin Val Thr Asn Gly Gin lie Asp lie Gly Phe Tyr Val 1255 1260 1265 gat teg ccc gga ggc acc aeg etc cac ate gac gat gtg egg gtc acc 4317 Asp Ser Pro Gly Gly Thr Thr Leu His lie Asp Asp Yal Arg Val Thr 1270 1275 1280 aag caa taa 4326 Lys Gin 1285 tccggtaaca ctagccctcc cccgccttgc ggcaggaggg ctttttgctt ctgtaggttg 4386 tgaaggegat accgagcgat gagaattega ttctgaacag ctcgccctgt gtcctgctaa 4446 attcctctcc tccctggcag ggaageeget tccacatgtc gaattgggga ggtactatga 4506 gaagttagta ctaccgtctg caacggcttt cgctacaatg gaaccaataa gacatcgcga 4566 aggtttggga ggatteggea tgcagagacg cgaggttaaa gtaataggea cgggcaaata 4626 tttgcccgcc catcgagtga ctgcgcagga gatggaccgg eggetaggag tgcccgacgg 4686 atgggtgctg aagaagtegg atgtggccgt tcgttatttc geeggtaegg agaaggcctc 4746 ggagatgggg gegagagegg ctgaggcggc gctggcttcc gcaggcctgg ccttcacgga 4806 tatcgactgc ctgatgtgcg ccagcgggac gatggaacag ccgattccat gcacggcggc 4866 gctcattcag aaggegatag gccaaggaca ctccggagtg ccggcactgg atttgaatac 4926 aacctgtctg agctttgtgg cggctctgga catggtttct tatatggtga eggegggaag 4986 gtacc 4991 <210〉 26 <211〉 13 <212) PRT <213> Microorganism (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -122 1269810 A7 B7 五、發明説明（120) <400> 26

Ala Pro Leu Giy Val Gin Arg Ala Gin Phe Gin Ser Gly 1 5 10

〈210〉 27 <211) 13 <212> PRT 〈213〉 Microorganism <400> 27

Gin Glu Trp Asn Leu Thr Gly Asp Pro Trp Thr Val Arg 1 5 10

〈210〉 28 <211〉 30 <212> PRT <213> Microorganism <400> 28 lie Ala Asp Leu Ala Glu Asp Gly Val Gly lie He Pro lie Glu Glu 1 5 10 15

Ser Tyr Val Gly Arg Asn Leu Pro Glu His Ala Arg Met Ala 20 25 30

〈210〉 29 <211> 30 <212> PRT <213〉 Microorganism 〈400〉 29

Gly Gly Met lie Asp Trp Thr Gin Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His 15 10 15

Asp Glu Gin Arg Gin His Leu Val Asp Glu Gly Val Leu Gly 20 25 30

<210〉 30 <211〉 27 〈212〉 PRT <213〉 Microorganism <400> 30

His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gin Thr Gly Ser Val Leu 15 10 15

Gin Thr Ala Ala Met Arg lie Glu Val Asp Pro 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -123- 1269810 A7 B7 五、發明説明（121 ) 25 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製〈210> 31 <211> 27 <212〉 PRT <213〉 Microorganism <400> 31 Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu lie Ala lie Val Ala Gly Glu Gly Glu 1 5 10 15 Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu Pro Ala Gly Glu 20 25 <210> 32 <211> 5811 <212〉 DNA <213> Microorganism 〈220〉 <221〉 CDS <222> (1655)...(4552) 〈400〉 32 ggtacctcgt cgaggagctc ggtgtcgacg gcttcaagac cgacgggagc gaggcgctct 60 tcgggcgtga cctgatcgtc agcgacgggc gccgcggtga cgagatgcac aacgcctacc 120 cgaacgagta cacctccgcc tacaacgact tcgtgcagga gacgacgggc gccgacggca 180 cgatcttcag ccgggcgggc acctccggcg gccagagcga atccatcttc tgggccgggg 240 accaggcgtc gacgttcggc gctttccagg aggccgtccg ggccgggcag agcgcgggcc 300 agtcgggagt gccgttctgg gcctgggacc tcggcggctt caccgggtcg ttcccaagcg 360 cggagctgta tctgcgctcg accgctcagg cggtgttctc gccgatcatg cagtaccact 420 cggagaaggc cgaccccagt ccgtccgagg cgcgcacgcc ctggaacgtg caggcgcgca 480 ccgggaacac cactgtcgtc cccaccttcg cccgttacgc gaacgtacgg atgaacctcg 540 tgccctatct gtacacggag gcggacgaca gcgcgacgac gggtgtgccg atgatgcgcg 600 cgatgagcct cgcgttcccc gacgacccgg atgccgcgca gtacgaccag cagtacatgt 660 tcgggtctca gctgctggtc gcaccgatta cgaaccaggg ccagaccgtg aaagacgtct 720 acctgcccgc gggcgagtgg tacgacttct ggaacggcgg acgcgcgagc ggcgagggcg 780 tgaagatgta cgacgccgga cccgacggca tccccgtata cgctcgcgcc ggagcggtca 840 tcccgctcaa cctcaacgac gcgtatgagg tgggcggcac gatcggcaac gacgtggaga 900 gctacgacaa ccttgtgttc cgcgtttacc cctccggtga gagcagctac gagtacttcg 960 aagaccaagc gaacgcgcac cgccggatcg atgtctcggc cgaccgcgca gcgcgcacgg 1020 tcgaggtgtc tgctcccgcg ctcacgaccg cgagcacctt ccaggtgtcg ggcaccaagc 1080 ccgacaccgt gaccgtcgcg ggctcggcac tgcctgaggt caacagcgtg agcgcgctgg 1140 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) - 訂

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -124 1269810 A7 B7 五、發明説明（122) ccgcatccac cgaggcctgg tactgggatg cgaagcagca gctgacgtac gtgaaggtcg 1200 gtgcgagcac cggcgagcgc acgatcctcc tgctgggcgt cgacaaggcc gggtacgagg 1260 ccgagttcgc gggtcatacg gccgtctcga cgaacgccga ccacccgggc tacaccgggc 1320 tcggcttcgt cgacggcttc gcgaacgcag gagacgcggt ggagttcgac gtgtgggccg 1380 aggagaacgg cgcgcaccag ctccgcttcc gctacggaaa cggagcggcg acccccgcca 1440 cccgcacgat ccgggtcgac ggagcgcctc tgggaacgct gtcgcttccg cccaccgggt 1500 cgtggagttc gtggggcacg gcctcgatcg acgtgaccct cccacccgga cgccacgccg 1560 tacggatcga gtacgccgga ggcgattccg gcggcgtcaa cctcgacaac ctcgtcctcg 1620 cgcgctgagc gcacacggga aagggagaag aacc atg cct get ett ccg tgg ege 1675

Met Pro Ala Leu Pro Trp Arg 1 5 ege aeg aeg geg etc geg etc acc aeg geg gtg aeg gee geg acc ctg 1723

Arg Thr Thr Ala Leu Ala Leu Thr Thr Ala Val Thr Ala Ala Thr Leu 10 15 20 gtc gee gtc ggg gtg aac gac gee ggt cag geg geg get get ccc ctg 1771

Val Ala Val Gly Val Asn Asp Ala Gly Gin Ala Ala Ala Ala Pro Leu 25 30 35 ggc gtg caa ege geg cag ttc cag teg ggg teg age tac etc gtc gtc 1819

Gly Val Gin Arg Ala Gin Phe Gin Ser Gly Ser Ser Tyr Leu Vai Val 40 45 50 55 gag gtg etc gat gac gac etc gtc cac ttc gag ctg gee ggg ggc ggc 1867

Glu Val Leu Asp Asp Asp Leu Val His Phe Glu Leu Ala Gly Gly Gly 60 65 70 acc gee ccc ggc aeg ggc tee ccg ctg ttc aeg aeg cct cag gtc geg 1915

Thr Ala Pro Gly Thr Gly Ser Pro Leu Phe Thr Thr Pro Gin Val Ala 75 80 85 aag cac gac tac geg gga ccc gac gtg ttc acc cag acc ggg tet gtt 1963

Lys His Asp Tyr Ala Gly Pro Asp Val Phe Thr Gin Thr Gly Ser Val 90 95 100 ctg cag acc geg geg atg ege ate gag gtc gat ccc geg gat ctg tgc 2011

Leu Gin Thr Ala Ala Met Arg lie Glu Val Asp Pro Ala Asp Leu Cys 105 110 115 gtg aeg gee acc gac ate acc ege acc ccg aac ett gta ctg cac gag 2059

Val Thr Ala Thr Asp He Thr Arg Thr Pro Asn Leu Val Leu His Glu 120 125 130 135 geg tgt ccc gee gac etc ggc cag geg tgg aag ggg ctg aac ate aeg 2107

Ala Cys Pro Ala Asp Leu Gly Gin Ala Trp Lys Gly Leu Asn lie Thr 140 145 150 agg teg geg atg gag aac gee tac ggt etc ggg cag cag ttc ttc aeg 2155

Arg Ser Ala Met Glu Asn Ala Tyr Gly Leu Gly Gla Gla Phe Phe Thr 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇x297公羞） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -125 1269810 A7 B7 五、發明説明（123) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ggc ggc Gly Gly ggc acc Gly Thr 185 ggc aac Gly Asn 200 aac tac Asn Tyr acc ggc Thr Gly tac etc Tyr Leu gag ctg Glu Leu 265 tgg gtg Trp Val 280 ate geg lie Ala gac gta Asp Val atg ggc Met Gly aag ate Lys lie 345 gag teg Glu Ser 360 155 age geg Ser Ala 170 tac ggc Tyr Gly aeg cag Thr Gin ggg ctg Gly Leu gac ccg Asp Pro 235 atg age Met Ser 250 aeg ggc Thr Gly teg gag Ser Glu ggc ctg Gly Leu cag tgg Gin Trp 315 acc etc Thr Leu 330 gee gac Ala Asp tac gtc Tyr Yal gac ggc Asp Gly aac geg Asn Ala ate ccg He Pro 205 ttc gtc Phe Val 220 tgg aeg Trp Thr ggc gac Gly Asp acc ccg Thr Pro ttc ggc Phe Gly 285 ege teg Arg Ser 300 ttc ggg Phe Gly gat tgg Asp Trp etc gee Leu Ala ggt ege Gly Arg 365 160 gac tgg gtg Asp Trp Val 175 atg gtg ttc Met Val Phe 190 gtg etc ttc Val Leu Phe gat cag ctg Asp Gin Leu gtg ege atg Val Arg Met 240 gac ctg ccc Asp Leu Pro 255 ccc gtg ccg Pro Val Pro 270 tac gac aac Tyr Asp Asn gee gac ttt Ala Asp Phe ggc gtc acc Gly Vai Thr 320 gac aeg teg Asp Thr Ser 335 gag gac ggc Glu Asp Gly 350 aac ctg ccg Asn Leu Pro ggc ege acc Gly Arg Thr gac ccc gag Asp Pro Glu 195 geg gtc ggc Ala Val Gly 210 tac aag cag Tyr Lys Gin 225 tgg ggc gac Trp Gly Asp gac ett ege Asp Leu Arg ccg aag aag Pro Lys Lys 275 tgg age gag Trp Ser Glu 290 ccg gtc gat Pro Val Asp 305 gee gac teg Ala Asp Ser agg ttt ccc Arg Phe Pro gtc ggc ate Val Gly He 355 gag cac gee Glu His Ala 370 165 ege acc ccg ggt Arg Thr Pro Gly 180 aac ggg ccg gtc Asn Gly Pro Val gat gac Asp Asp gaa tgg Glu Trp cag gtg Gin Val 245 cac gac His Asp 260 geg ttc Ala Phe gtc gac Val Asp ggc geg Gly Ala gac gac Asp Asp 325 gac cct Asp Pro 340 ate ccg lie Pro aac geg Asn Ala 215 aac etc Asn Leu 230 ege tgg Arg Trp tac atg Tyr Met ggg etc Gly Leu aat aeg Asn Thr 295 atg etc Met Leu 310 acc ege Thr Arg geg gga Ala Gly ate gag lie Glu egg atg geg geg Arg Met Ala Ala 375 2203 2251 2299 2347 2395 2443 2491 2539 2587 2635 2683 2731 2779 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210'〆297公釐） -126- 1269810 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

A7 B7 gac ggt tac etc gtg ege tee ggc tgc get aeg tgc ccg ccg gtg tac

Asp Gly Tyr Leu Val Arg Ser Gly Cys Ala Thr Cys Pro Pro Yal Tyr 380 385 390 ct8 aeg ggg aac ccc tgg tgg ggc aag ggc ggg atg ate gac tgg aeg

Leu Thr Gly Asn Pro Trp Trp Gly Lys Gly Gly Met He Asp Trp Thr 395 400 405 cag ccg gaa gee ggc gee gtc tgg cac gac gag cag ege cag cat etc

Gin Pro Glu Ala Gly Ala Val Trp His Asp Glu Gin Arg Gin His Leu 410 415 420

Stc gac gag ggc gta ctg ggc cac tgg etc gat etc ggc gaa ccg gag

Val Asp Glu Gly Yal Leu Gly His Trp Leu Asp Leu Gly Glu Pro Glu 425 430 435 atg tac gac ccg aac gac tgg acc gee ggc gtc ate ccc ggc aag cac

Met Tyr Asp Pro Asn Asp Trp Thr Ala Gly Val lie Pro Gly Lys His 440 445 450 455

Seg cac gee gac tat cac aac geg tac aac ctg ctg tgg geg cag age

Ala His Ala Asp Tyr His Asn Ala Tyr Asn Leu Leu Trp Ala Gin Ser 460 465 470 ate gee gac ggg tac gee gac aac ggc gtg cag aag cgt ccc ttc atg

He Ala Asp Gly Tyr Ala Asp Asn Gly Val Gin Lys Arg Pro Phe Met 475 480 485 ctg aeg ege gee geg gee gee ggc ate cag cgt cat ggc geg ggc atg

Leu Thr Arg Ala Ala Ala Ala Gly lie Gin Arg His Gly Ala Gly Met 490 495 500 tgg tea gee gac ate ggg teg acc atg aag geg etc ggg age cag cag

Trp Ser Ala Asp He Gly Ser Thr Met Lys Ala Leu Gly Ser Gin Gin 505 510 515 aac geg cag atg cac atg teg atg teg ggg ate gac tat tac ggc tee

Asn Ala Gin Met His Met Ser Met Ser Gly lie Asp Tyr Tyr Gly Ser 520 525 530 535 gac ate ggc ggg ttc egg egg gag atg gee gac ggc gac gtg aac gag

Asp lie Gly Gly Phe Arg Arg Glu Met Ala Asp Gly Asp Val Asn Glu 540 545 550 etc tac acc cag tgg ttc gee gac age geg tgg ttc gac act ccg etc

Leu Tyr Thr Gin Trp Phe Ala Asp Ser Ala Trp Phe Asp Thr Pro Leu 555 560 565 egg ccg cac acc gac aat etc tgc aac tgc etc gag aeg age ccc gac

Arg Pro His Thr Asp Asn Leu Cys Asn Cys Leu Glu Thr Ser Pro Asp 570 575 580 teg ate ggc gac gtc geg age aac ege gag aac ctg gtg ege ege tac c请先閱讀背面之注意事項存填寫本頁)

Α4 規格(210X297公釐) -127- 1269810 A7 B7 發明说明（125 ) 5er lie Gly Asp Val Ala Ser Asn Arg Glu Asn Leu Yal Arg Arg Tyr 585 590 595 gag ctg get ccg tac tac tac teg etc gcg cac cgc get cac cag ttc 3499

Glu Leu Ala Pro Tyr Tyr Tyr Ser Leu Ala His Arg Ala His Gin Phe 600 605 610 615 ggc gag ccg etc get ccc ccg etc gtg tac tac tac cag aac gac gac 354^

Gly Glu Pro Leu Ala Pro Pro Leu Val Tyr Tyr Tyr Gin Asn Asp Asp 620 625 630 cac gtt ege gag atg ggg cat cag aag atg etc ggg ege gac ctg ctg 3595

His Vai Arg Glu Met Gly His Gin Lys Met Leu Gly Arg Asp Leu Leu 635 640 645 atc geg ate gtc gee gga gag ggc gag egg gaa ege gac gtg tac ett 3643 j|e Ala He Val Ala Gly Glu Gly Glu Arg Glu Arg Asp Val Tyr Leu 650 655 660 ccg geg ggc gag tgg ate gac ate cac aeg aac gag ege ate cag age 3691

Pro Ala Gly Glu Trp He Asp He His Thr Asn Glu Arg lie Gin Ser 665 670 675 aeg ggt cag tgg ate gac aac gtg ccg ctg tgg cgt gac ggc gtc ttc 3739

Thr Gly Gin Trp lie Asp Asn Val Pro Leu Trp Arg Asp Gly Val Phe 680 685 690 695 acc ctg ccg geg tac gee egg geg ggg geg ate ate ccg aag gee ttc 3787

Thr Leu Pro Ala Tyr Ala Arg Ala Gly Ala lie He Pro Lys Ala Phe 700 705 710 gtc gac gee tee aeg aag gac ate acc ggc aag ege gag gat gee geg 3835

Vai Asp Ala Ser Thr Lys Asp lie Thr Gly Lys Arg Glu Asp Ala Ala 715 720 725 gtg ege aac gag ctg ate gca acc gtt tac gee gac gac gtc geg age 3883

Val Arg Asn Glu Leu lie Ala Thr Val Tyr Ala Asp Asp Vai Ala Ser 730 735 740 gac ttc acc ctg tac gag gat gac ggc geg aeg acc gca tac gee gac 3931

Asp Phe Thr Leu Tyr Glu Asp Asp Gly Ala Thr Thr Ala Tyr Ala Asp . 745 750 755 ggg get gtc agg acc aeg cag ate age caa teg etc aeg aac ggc gtg 3979

Gly Ala Val Arg Thr Thr Gin lie Ser Gin Ser Leu Thr Asn Gly Val 760 765 770 775 gee aeg gtg aeg gtg gga geg gca tet gga acc tac tee ggt geg ccc 4027

Ala Thr Val Thr Val Gly Ala Ala Ser Gly Thr Tyr Ser Gly Ala Pro 780 785 790 tec acc cgt ccc aeg gtc gtc gag dt gtc act gac ggc aeg cag gee 4075

Ser Thr Arg Pro Thr Val Val Glu Leu Val Thr Asp Gly Thr Gin Ala 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣.

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -128- 1269810 A7 ___B7 __ 五、發明説明（126) 795 800 805 teg acc gtc tee etc ggc age gtt ccg ctg aeg gag cac geg aac aag 4123

Ser Thr Val Ser Leu Gly Ser Yal Pro Leu Thr Glu His Ala Asn Lys 810 815 820 geg geg ttc gac geg geg age age ggc tgg tac aac gee ggc ggg ggg 4171

Ala Ala Phe Asp Ala Ala Ser Ser Gly Trp Tyr Asn Ala Gly Gly Gly 825 830 835 etc gtt gtg gee aag geg geg age agt teg gtg aac acc gee aag acc 4219

Leu Val Val Ala Lys Ala Ala Ser Ser Ser Val Asn Thr Ala Lys Thr 840 845 850 855 ttc teg ttc aeg etc ggt gag gag teg gtc tgg geg aeg ttc tee tgc 4267

Phe Ser Phe Thr Leu Gly Glu Glu Ser Val Trp Ala Thr Phe Ser Cys 860 865 870 gag aac gee aeg aeg acc ttc ggt cag tea gtg tac gtc gtc gga aat 4315

Glu Asn Ala Thr Thr Thr Phe Gly Gin Ser Val Tyr Val Val Gly Asn 875 880 885 gtt ccg cag etc ggc aac tgg teg ccg geg gat gee gtg aag etc gag 4363

Val Pro Gin Leu Gly Asn Trp Ser Pro Ala Asp Ala Val Lys Leu Glu 890 895 900 ccg age gee tac ccc acc tgg acc ggg gtg gtg.egg aac ctg ccg ccg 4411

Pro Ser Ala Tyr Pro Thr Trp Thr Gly Val Yal Arg Asn Leu Pro Pro 905 910 915 teg age aeg gtc gaa tgg aag tgc ate aaa cgt cag gag gee ggc ctg 4459

Ser Ser Thr Val Glu Trp Lys Cys lie Lys Arg Gin Glu Ala Gly Leu 920 925 930 935 ccg aac aeg geg gat geg tgg gag ccc ggc ggg aac aac ate etc teg 4507

Pro Asn Thr Ala Asp Ala Trp Glu Pro Gly Gly Asn Asn He Leu Ser 940 945 950 aeg cca cct tee ggc teg geg ggg ata acc acc ggc gee ttc tga 4552

Thr Pro Pro Ser Gly Ser Ala Gly lie Thr Thr Gly Ala Phe 955 960 965 cccagggggg ctcgatcccg gtcgccagcg caagcgcggc gcccggggtc gacgcgtgtt 4612 aggccagtac gcgaaggaac cagccctcta cgacaccggc ctcgaccccg ccgaaggact 4672 ctggcaccgg tcaggctgga tcggacaaca ctgacacgcc ccgacgccat ccactctttt 4732 tggcctacaa cccgttgtcg cacgtgcgcc tcttggcccg ggeaegaega aacccccgcg 4792 atccagggat cggcgggggt ttcggatggc ggtgacggtg ggatttgaac ccacggtagg 4852 gggttaccct acacaacttt tcgagagttg caccttcggc cgctcggaca cgtcaccggg 4912 gtcgagttta cgcgacgttc tcctggcgcg ccaatcggcg gcgccccgcc egegagaate 4972 caggcccgcg ccgagaatcc gcgggcgcct ggattctcag cacggggatg gattctcgcc 5032 gctcatccga gccccgcggc gagcgggctc agtgctcgtc ctccatgagc atgccgaccg 5092 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ----Ί I--訂----- —%l. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -129- 1269810 A7 B7 五、發明说明（127 ) aggtggcgca ggcgtcgccg cgccaggcct cgatgccctc gcgcacggcg aaggcggcga 5152 tgatgaggcc ggtgatcgcg tcggcccacc accagcccag gaggctgttg agcacgaggc 5212 ccgcgagcac ggccgccgac aggtaggtgc agatgagggt ctgcttcgag tcggccacgg 5272 cggtggccga tccgagctcg cggccggcgc ggcgctcggc gaacgacagg aacggcatga 5332 tcgccacgct gagcgccgtg atgacgatgc cgagcgtcga gtgctccacg tccgcgccgc 5392 cgacgagggc caggaccgac gtgacggtga cgtacgcggc gagcgcgaag aaggccacgg 5452 cgatgacgcg cagcgtgccg cgctcccagc gctccgggtc gcgccgcgtg aactgccacg 5512 cgacggcggc ggccgagagc acctcgatgg tcgagtccag gccgaacgcg acgagcgcgg 5572 ccgacgaggc cgcagctccc gcggcgatcg cgacgaccgc ctcgacgacg ttataggcga 5632 tggtcgcggc gacgatccag cggatgcgcc gctgcaggac ggatcgccga tcggcagacg 5692 cggtggcggt catgcgcagg tgcagctctc tccggcgcag cagccgggct cgacgtacag 5752 gacgacgcgc agcagctcgt cgagcgcggg cgcgaggtgg gcgtcggcca gccggtacc 5811 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •130· 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公瘦）

Claims

A8 B8 C8 D8 公告本六、申請專利範圍第9 1 1 003 1 1號專利申請案中文申請專利範圍修正本 (請先閲部背面之注意事項再填寫本頁) 民國9 5年5月23 日修正 1 · 一種多肽，其特徵爲具有可以自做爲非還原末端之結合樣式具有α - 1 ，4葡糖苷結合之葡萄糖聚合度爲 2以上之糖質，在實質上不增加還原力之下，藉由α __葡萄糖基轉移生成做爲非還原末端之結合樣式具有α _ i， 6葡糖若結合，做爲此非還原末端以外之結合式樣具有α - 1 ，4葡糖苷結合之葡萄糖聚合度3以上的酶活性，並 ‘且具有序列表中序列1、2或3所示胺基酸序列，或在此胺基酸序列中，1或複數個胺基酸被缺失，取代或附加之胺基酸序列者。 2 ·如申請專利範圍第1項之多肽，其爲具有以下之理化學上性質者， (1 )分子量經濟部智慧財產局員工消費合作社印製在S D S —凝膠電泳法，具有約7 4，0 0 〇至 160， 000達頓範圍內之分子量， (2 )最適溫度 Ρ Η 6 · 0 ，6 0分鐘反應下，於約4 0 t〜5〇°C 溫度範圍內具有最適溫度， pH6 · 0，60分鐘反應下，lmMCa2 +存在下，於4 5〜5 5°C溫度範圍內具有最適溫度，本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 8 888 ABCD 1269810 六、申請專利範圍 PH8 . 4，60分鐘反應下，於60°C具有最適溫度，或 PH8 · 4，60分鐘反應下，於lmMCa2 +存在下，於6 5 °C具有最適之溫度， (3 )最適p Η 3 5 °C，6 0分鐘反應之條件下，於ρ η約6 · 0〜 8 · 4範圍內具有最適pH， (4 )溫度安定性保持於Ρ Η 6 · 0，6 0分鐘條件下，於4 5 °C以下具有溫度安定區域，保持於Ρ Η 6 · 0，6 0分鐘條件中，1 m M C a 2 + 存在下，於約6 0 °C以下具有溫度安定區域，保持於Ρ Η 8 . 0，6 0分鐘條件下，於5 5 °C以下具有溫度安定區域，保持於Ρ Η 8 · 〇，6 0分鐘條件中，1 m M C a 2 + 存在下，於約6 0 t以下具有溫度安定區域， (5 ) ρ Η安定性保持4 °C，2 4小時之條件下，ρ Η約4 · 5〜 10.0範圍內具有安定pH之區域。 3 · —種D N A，其特徵爲可編碼如申請專利範圍第 1項或第2項之多肽者。本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）請先閲之注意事項再經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -2 - 1269810 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 4 ·如申請專利範圍第3項之D N A，其爲具有序歹[J 表中之序列4、5或6所示鹼基序列，或此等鹼基序列中 (請先閲部背面之注意事項再填寫本頁) ，1或複數個鹼基缺失，取代或附加之鹼基序列，或對此等爲互補之鹼基序列。 5 .如申請專利範圍第3項或第4項之D N A，其爲具有在不改變序列表中之序列1、2或3所示胺基酸序列之下，根據基因之縮聚，序列表之序列4、5或6所示鹼基序列中的一或複數個鹼基爲被其他鹼基所取代之鹼基序列者。 6 ·如申請專利範圍第3項或第4項之D N A，其爲來自芽孢桿菌屬之微生物者。 7 ·如申請專利範圍第3項或第4項之D N A，其爲來自節桿菌屬之微生物者。 8 · —種可複製之重組D N A，其特徵爲含有如申請專利範圍第3項至第7項中任一項之D N A，與可自律複製之載體者。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 9 ·如申請專利範圍第8項之可複製之重組D N A，其中可自律複製之載體爲質體載體Bluescript π SK ( + )。 1 0 . —種轉形體，其特徵爲將如申請專利範圍第8 項或第9項之可複製的重組D N A導入適當之宿主所成者〇 1 1 ·如申請專利範圍第1 〇項之轉形體，其中宿主爲大腸菌。 1 2 · —種多肽之製造方法，其特徵爲在營養培養基本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -3- 1269810 A8 B8 C8 D8 Y、申請專利範圍中培養如申請專利範圍第1 0項或第1 1項之轉形體，自該培養物採取如申請專利範圍第1項或第2項之多肽者。 1 3 ·如申請專利範圍第1 2項之多肽之製造方法，其中以一種或二種以上選自離心分離、過濾、濃縮、鹽析、分離沈澱、離子交換層析、凝膠過濾層析、疏水層析、親和性層析、凝膠電泳及等電點電泳之方法採取培養物中之如申請專利範圍第1項或第2項之多肽者。請先閲意事項再旁 # 訂 S— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -4-