CN111778231A - 一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，属于酶工程技术领域。该纯化方法包括以下步骤：用平衡液平衡硅胶层析填料，将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；使用流动相梯度洗脱，紫外线监测，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶。本发明通过一步纯化的方式将蛋白电泳纯度在60％以上的工业生产用赖氨酰肽链内切酶纯化至HPLC纯度大于95％的质谱分析用赖氨酰肽链内切酶，操作简单，且活性收率稳定在80％以上。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法。
背景技术
赖氨酰肽链内切酶(Lysyl Endopeptidase)，EC3.4.21.50，属于丝氨酸蛋白酶，其最初来源于无色杆菌和产酶溶杆菌，但表达量不高。目前，许多研究机构陆续报道采用重组表达的方式提高赖氨酰内切酶的产量。由于重组表达的固有优势，目前市面上在售的赖氨酰内切酶重组表达的比例已经越来越高。赖氨酰肽链内切酶可以特异切割肽链中赖氨酸残基或氨乙基半胱氨酸C端的肽键，能显著提高酶切转化率和纯度。因此，在胰岛素、GLP-1类似物等蛋白药物生产和蛋白质质谱分析中有着广泛的应用。在蛋白药物生产中往往只需要赖氨酰肽链内切酶产生酶切作用即可，因此其对赖氨酰内切酶的纯度要求往往不高，一般电泳纯度大于85％即可满足基本要求。但在蛋白质质谱分析中，赖氨酰内切酶中的杂质会产生质谱峰，对目的蛋白质的分析会产生极大的干扰，因此其对于赖氨酰肽链内切酶的纯度要求更高，一般要求采用HPLC方法进行分析且纯度不低于95％，如Promega公司的质谱级赖氨酰肽链内切酶。目前，无论是天然发酵还是重组表达的赖氨酰肽链内切酶我国基本都依赖进口，且未见高纯度质谱级赖氨酰肽链内切酶的制备方法报道。
CN103865836B报道采用产酶溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)的突变菌株TGJZC-041发酵，并通过XAD1180大孔吸附纯化、S-Sepharose ff阳离子层析纯化以及超滤制备赖氨酸肽链内切酶，最终产品的电泳纯度为91％，因此无法应用于高纯度需要的质谱分析领域。CN105950593A报道了采用大肠杆菌进行重组表达制备赖氨酰内切酶，其对发酵后的蛋白通过变性、复性、激活、硫酸铵沉淀纯化、亲和层析纯化、分子筛纯化和超滤等多步反应制备重组赖氨酰内切酶，并通过酶切验证了其活性。但报道也是采用蛋白电泳进行检测，且未说明其纯化后的纯度，同时其纯化收率也只有5.4％，无法大规模产业化生产。Philip A.Kuhlman等报道了利用Lysobacter enzymogenes菌株制备赖氨酰内切酶的方法，其制备工艺同样复杂，采用了DEAE、PPA亲和纯化、反液层析纯化和ω-AminoHexyl亲和纯化四步纯化方法，但制备获得的产品纯度同样不高，且收率只有15％。申请人在前期的研究《一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法》(CN201811392504.7)中报道了采用添加标签的方式来优化赖氨酰内切酶的制备，通过添加组氨酸标签和精氨酸末端采用一步纯化的方式来实现赖氨酰内切酶的制备，但产品同样纯度不高，不适用于质谱分析领域。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可满足蛋白质谱分析的高纯度赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，通过该方法得到的赖氨酰肽链内切酶HPLC纯度高、活性收率高，工艺稳定性好，易于线性放大，适于大规模工业生产。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其包括以下步骤：
S1、用平衡液平衡硅胶层析填料，将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；所述平衡液由体积百分比为70～90％的A液和10～20％的B液组成；
S2、使用A液-B液梯度洗脱，紫外线监测，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶；
其中，所述A液为缓冲盐的水溶液，所述B液为三氟乙酸的有机溶液。
作为本发明优选的实施方式，所述A液中的缓冲盐浓度为1-50mM。
作为本发明优选的实施方式，所述A液的pH值为2.0～4.0，优选的为pH3.0。
作为本发明优选的实施方式，所述缓冲盐为柠檬酸盐、乙酸盐、甘氨酸盐中的一种或任意两种以上的混合，优选的为乙酸盐。作为本发明优选的实施方式，所述B液是将三氟乙酸溶于有机溶剂中配制而成，所述有机溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇中的一种或任意两种以上的混合，优选的为乙腈。
作为本发明优选的实施方式，所述B液中三氟乙酸的体积分数为0.5-5‰。
作为本发明优选的实施方式，所述硅胶层析填料的配基为C4-C8的烷烃，优选的为C4烷烃。
作为本发明优选的实施方式，所述硅胶层析填料的孔径为
优选为
作为本发明优选的实施方式，所述赖氨酰肽链内切酶粗品的上样量为2～8g/L硅胶层析填料，优选为4g/L。
作为本发明优选的实施方式，所述紫外线的波长为200～280nm。
作为本发明优选的实施方式，所述步骤S2梯度洗脱过程中A液的体积比范围由50～60％变化为30～80％。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明通过一步纯化的方式将蛋白电泳纯度在60％以上的工业生产用赖氨酰肽链内切酶纯化至HPLC纯度大于95％的质谱分析用赖氨酰肽链内切酶，操作简单，且活性收率稳定在80％以上。同时，本发明的纯化方法具有以下优势：
(1)首次发明采用硅胶层析填料，在酸性条件下进行赖氨酰肽链内切酶的纯化制备，可一步将粗样品由电泳纯度50-80％提高至HPLC纯度95.0％以上，且活性收率稳定在80％以上，纯化后样品纯度和收率都远高于现有技术所获得的成果；
(2)本发明中赖氨酰肽链内切酶粗样品的上样量大，超过4克/升床层体积，远大于现有技术中提到的上样量，极大的节省了纯化成本；
(3)本发明色谱纯化过程稳定性好，易于线性放大，适于大规模工业生产。
附图说明
图1为本发明实施例1赖氨酰肽链内切酶粗品的蛋白电泳纯度检测图谱；
图2为本发明实施例2赖氨酰肽链内切酶粗品的HPLC检测图谱；
图3为本发明实施例2赖氨酰肽链内切酶纯化样品的HPLC检测图谱；
图4为本发明实施例3采用
孔径硅胶填料纯化赖氨酰肽链内切酶的纯化过程图谱；
图5为本发明实施例3采用
孔径硅胶填料纯化赖氨酰肽链内切酶的纯化过程图谱；
图6为本发明实施例4采用pH值2.0的A液处理得到的赖氨酰肽链内切酶纯化样品的HPLC检测图谱；
图7为本发明实施例4采用pH值4.0的A液处理得到的赖氨酰肽链内切酶纯化样品的HPLC检测图谱。
图8为本发明实施例5采用柠檬酸三钠缓冲液处理得到的赖氨酰肽链内切酶纯化样品的HPLC检测图谱。
图9为本发明实施例5采用甘氨酸缓冲液处理得到的赖氨酰肽链内切酶纯化样品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。
一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其包括以下步骤：
S1、用平衡液平衡色谱级硅胶层析填料，按2～8g/L硅胶层析填料的上样量将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；所述平衡液由体积百分比为70～90％的A液和10～20％的B液组成，优选为由90％的A液和10％的B液组成；
S2、使用A液-B液梯度洗脱，洗脱过程中A液的体积比范围由50～60％变化为30～80％，其余为B液，采用波长为200～280nm的紫外线监测纯化过程，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶；
其中，A液为缓冲盐的水溶液，所述B液为三氟乙酸的有机溶液。
步骤S1中还包括采用盐酸或三氟乙酸调节A液pH值的步骤，A液的pH值为2.0～4.0，优选的为pH3.0。A液中缓冲盐的浓度为1-50mM。A液中的缓冲盐为柠檬酸盐、乙酸盐、甘氨酸盐中的一种或任意两种以上的混合，优选的为乙酸盐。B液是将三氟乙酸溶于有机溶剂中配制而成，所述有机溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇中的一种或任意两种以上的混合，优选的为乙腈。B液中三氟乙酸的体积分数为0.5-5‰。
其中，硅胶层析填料的配基为C4-C8的烷烃，优选的为C4烷烃；孔径为
优选为
1、色谱柱及仪器
纯化色谱柱：已装填硅胶层析填料的纯化色谱柱，规格为4.6mm×250mm。
分析色谱柱：购自waters公司，规格为Symmetry Shield RP 8Column,
3.5μm,3mmX150mm。
设备：分析与制备型高效液相仪器为赛默飞U3000。
2、检测方法：
蛋白浓度采用中国药典2015版0731《蛋白质含量测定法》第六法。
蛋白电泳纯度采用中国药典2015版0541《电泳法》中第四法聚丙酰胺凝胶电泳法。
HPLC纯度采用反相层析方法进行检测，仪器为赛默飞U3000型高效液相，柱子采用Kromasil 100-3.5-C4 4.6×250mm色谱柱。流动相A液：水：TFA＝1000:1(体积比))；流动相B相：乙腈：TFA＝1000:1(体积比)。流速为1.0ml/min，柱温为40℃，检测波长为276nm。28-80％B相梯度洗脱25min。保留时间在13-15min左右的主峰即为目的产物。纯度计算采用面积归一法。
酶活性采用CN109486800A中公开的方法。
实施例1：赖氨酰肽链内切酶粗样品的制备
参照专利CN109486800A中的方法制备赖氨酰肽链内切酶粗样品，并用电泳法，检测其电泳纯度为76.5％，详细见图1。制备的样品检测其浓度为2mg/ml,置于2-8℃保存备用。
实施例2：采用C4配基的硅胶层析填料纯化赖氨酰肽链内切酶
选用C4配基的Kromasil 300-10-C4 4.6×250mm，其中流动相A液：10mM醋酸铵缓冲液，使用三氟乙酸(TFA)调节pH至3.0；流动相B液：乙腈：TFA＝1000:1(体积比)，检测波长为280nm。
赖氨酰肽链内切酶的纯化过程如下：
S1、采用体积比10％的流动相B液(即流动相A液体积比为90％)作为平衡液平衡柱子至基线稳定；取8mg赖氨酰肽链内切酶粗样品加入10％乙腈后，调节pH至3.0上样至色谱柱，然后采用10％流动相B液平衡色谱柱至基线稳定。
S2、采用如表1所示的梯度洗脱程序进行洗脱，280nmUV检测仪监测出峰后，对主峰进行收集。使用HPLC检测赖氨酰肽链内切酶粗品以及收集后的样品其纯度分别为67.2％和98.6％，酶活性收率为86％，详见图2和图3。
表1梯度洗脱程序
| 时间(min) | A液 | B液 |
| 0 | 90 | 10 |
| 5 | 90 | 10 |
| 5.01 | 70 | 30 |
| 20 | 65 | 35 |
| 25 | 65 | 35 |
| 45 | 55 | 45 |
由图2和图3可以看出，赖氨酰肽链内切酶粗品使用HPLC检测其纯度为67.2％，杂质峰比较多，此类杂质峰在质谱分析时很容易导致结果的干扰和偏差。而使用硅胶层析填料纯化后的赖氨酰肽链内切酶的纯度可以达到98.6％，杂质的数量和含量都大大降低，因此可以很好地满足蛋白质谱分析的需要。
实施例3：采用不同孔径的C8配基硅胶层析填料纯化赖氨酰肽链内切酶
选用C8配基的Kromasil 300-10-C8 4.6×250mm和Kromasil 200-10-C8 4.6×250mm进行纯化，其粒径均为10um，孔径分别为
和
其余条件与实施例2相同，收集后的样品使用HPLC检测其纯度分别为为97.1％和96.6％，其酶活性回收率分别为84％和91％，其纯化过程图谱详见图4和图5。
由图4和图5可以看出，色谱图17-22min之间的杂质在
孔径的硅胶层析填料上分离度更好，各杂质峰与25min左右的目的峰分离度也更高。
对比实施例2和实施例3，可以看出采用C4烷烃的硅胶层析填料，其纯度可以达到98.6％，采用C8烷烃的硅胶层析填料其纯度为97.1％，同等条件下采用C4烷烃的硅胶层析填料的效果相对更好。
实施例4：采用不同的pH值流动相A液纯化赖氨酰内切酶
选用C4配基的Kromasil 300-10-C4 4.6×250mm，其中流动相A液：10mM醋酸铵缓冲液，使用TFA分别配置pH值为2.0和4.0的A液；流动相B液：乙腈：TFA＝1000:1(体积比)，检测波长为280nm，其余条件与实施例2相同。对收集后的样品使用HPLC检测其纯度分别为98.2％、和95.8％，酶活性回收率为82％和93％。其中pH2.0和4.0的检测色谱图详见图6和图7。
与实施例2对比可以发现，在pH值2.0-4.0之间，都可以实现大于95％纯度的赖氨酰肽链内切酶的制备，以pH3.0的条件最佳。虽然pH2.0条件下的纯度与pH值3.0的纯度差异不大，但一般认为低于pH值2.5的A液长期使用，对硅胶层析填料使用寿命有影响，因此选择pH值3.0的A液为最优。
实施例5：采用不同的缓冲盐作为流动相A液纯化赖氨酰肽链内切酶
选用C4配基的Kromasil 300-10-C4 4.6×250mm，其中流动相A液分别使用10mM柠檬酸三钠缓冲液和10mM甘氨酸缓冲液，使用TFA调节pH值3.0；流动相B液：乙腈：TFA＝1000:1(体积比)，检测波长为280nm。其余条件与实施例2相同。对收集后的样品使用HPLC检测其纯度分别为96.4％和97.0％，活性收率分别为87％和84％。其中，10mM柠檬酸三钠缓冲液和10mM甘氨酸缓冲液检测色谱图分别详见图8和图9。
与实施例2对比可以发现，选择醋酸铵缓冲液、柠檬酸三钠缓冲液、甘氨酸缓冲液作为流动相A液，均可以实现大于95％纯度的赖氨酰肽链内切酶的制备，以醋酸铵缓冲液作为流动相A液效果最佳。
实施例6：采用不同的有机溶剂作为流动相B液纯化赖氨酰肽链内切酶
选用C4配基的Kromasil 300-10-C4 4.6×250mm，其中流动相A液10mM醋酸铵缓冲液，使用三氟乙酸(TFA)调节pH至3.0；流动相B液分别配制：甲醇：TFA＝1000:1(体积比)，乙醇：TFA＝1000:1(体积比)和异丙醇：TFA＝1000:1(体积比)，检测波长为280nm。其余条件与实施例2相同。对收集后的样品使用HPLC检测其纯度分别为95.4％、96.0％和95.8％，活性收率分别为82％、84％和82％。
与实施例2相比，采用不同的有机溶剂均可以实现赖氨酰内切酶的纯化回收，但相比于采用乙腈，其收率和纯度都有所下降。这是由于不同的有机溶剂洗脱强度不一致，从而导致采用相同的洗脱程序时，相关的杂质分离状态也不一样。但综合对比，采用乙腈作为B相的有机溶剂相对最优。
综上所述，本发明通过一步纯化的方式对赖氨酰肽链内切酶进行纯化，使得粗样品由电泳纯度50-80％提高至HPLC纯度95.0％以上，且活性收率稳定在80％以上，同时上样量大、极大的节省了纯化成本，操作简单、工艺稳定，易于线性放大，适于大规模工业生产。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、用平衡液平衡硅胶层析填料，将赖氨酰肽链内切酶粗品上样，用平衡液再次平衡硅胶层析填料；所述平衡液由体积百分比为70～90％的A液和10～20％的B液组成；
S2、使用A液-B液梯度洗脱，紫外线监测，收集主峰流出液，得到高纯度赖氨酰肽链内切酶；
其中，所述A液为缓冲盐的水溶液，所述B液为三氟乙酸的有机溶液。
2.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述A液的pH值为2.0～4.0。
3.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述缓冲盐为柠檬酸盐、乙酸盐、甘氨酸盐中的一种或任意两种以上的混合。
4.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述B液是将三氟乙酸溶于有机溶剂中配制而成，所述有机溶剂为乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇中的一种或任意两种以上的混合。
5.根据权利要求4所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述B液中三氟乙酸的体积分数为0.5-5‰。
6.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述硅胶层析填料的配基为C4-C8的烷烃。
7.根据权利要求6所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述硅胶层析填料的平均孔径为
8.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述赖氨酰肽链内切酶粗品的上样量为2～8g/L硅胶层析填料。
9.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述紫外线的波长为200～280nm。
10.根据权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的纯化方法，其特征在于：所述步骤S2洗脱过程中A液的体积比范围由50～60％变化为30～80％。
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