CN106589115B - 一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法 - Google Patents

一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及蛋白质的分离纯化，具体公开了一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法，将脱脂大豆粉，先后经粗提取、凝胶柱预纯化和分子筛色谱分离纯化得到大豆蛋白酶抑制因子；其中，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis‑Tris‑HCl缓冲液按照1g：20～40mL的比例混合，室温提取2～3h，然后在3～8℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液。本发明步骤简单，操作可控，环境温和，方法重复性好，且整个纯化过程的损失率低于10％，产品纯度达95％以上，可作为分析标准品用于检测大豆及其加工样品中的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子含量，也可添加在动物饲料中用于其抗营养机理的研究。

Description

一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质的分离纯化，具体地说，涉及大豆蛋白酶抑制因子的分离纯化。
背景技术
大豆蛋白酶抑制因子是大豆中的主要抗营养因子之一。生大豆抗营养作用的40％是由蛋白酶抑制因子引起的。这类抗营养因子能抑制人和动物肠道内胰腺分泌的蛋白水解酶，如胰蛋白酶、糜蛋白酶和弹性蛋白酶等的活性，引起生长停滞、胰腺增生和肥大等，动物采食含蛋白酶抑制因子的日粮会使采食量和日增重下降，饲料转化率降低。植物中的蛋白酶抑制因子有10多种，其中Kunitz型胰蛋白酶抑制因子(分子量在22-24KD之间)为国内外研究的热点。
到目前为止已经有许多学者研究了大豆胰蛋白酶抑制因子分离和纯化方法，包括等电点沉淀法、萃取法、超滤法、不同组合的色谱方法联合应用等对豆科种子中的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子进行分离纯化。如谷春梅等建立了以脱脂豆粉为原料，经pH7.6磷酸溶液抽提、65℃热变性、硫酸铵分步沉淀等提取技术制备粗提液，之后再经过DEAE-52离子交换、亲和层析和葡聚糖凝胶过滤等纯化技术研究大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化方法。但是这些方法不是分离纯化过程冗长、步骤繁琐，就是纯化效果差，产品纯度低。因此，研究出一种快速、高效的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子分离纯化方法是非常有必要的，这不仅减少了资源的浪费，提高了工作效率，而且有利于开发这些蛋白质的新特性，研究其抗营养作用机制，为大豆及大豆加工产品在畜禽饲料中的高效利用提供技术保障。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法。该方法克服了现有分离纯化技术操作复杂，纯化效果差的缺点，建立了一种采用等电点沉淀法初步提取，进一步利用弱阴离子凝胶柱结合高效分子筛色谱柱的技术从生大豆中提取高纯度的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的方法，并优化了所有纯化过程中的条件，损失率低于10％，产品纯度达95％以上。且所述方法步骤相对简单，操作可控，环境温和，方法重复性好。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法，将脱脂大豆粉，先后经脱脂、粗提取、凝胶柱预纯化和分子筛色谱分离纯化得到大豆蛋白酶抑制因子。
所述大豆蛋白酶抑制因子经质谱鉴定为Kunitz型大豆胰蛋白酶抑制因子。
本发明经试验优化了粗提取、凝胶柱预纯化和分子筛色谱分离纯化的条件。
其中，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：20～40mL的比例混合，室温提取2～3h，然后在3～8℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液。
使用pH 6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，能够降低大豆球蛋白的溶解度，消除乳白色的穿透峰的现象，且在一定程度上减少了杂蛋白与离子交换层析介质的结合。提取时间为2～3h的样品中蛋白质的色谱峰面积无显著差异，且样品平行性较好。设定离心机温度为4℃，可在一定程度上降低大豆球蛋白的溶解度，进一步减少了提取液中杂蛋白与离子交换层析介质的结合。对于本领域技术人员来说，可以推想到当离心温度为3～8℃时，也能实现相似效果。
作为优选，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，室温提取2h，然后在4℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液。为了节约提取时间，优选提取时间为2h，且实验证明，质量体积比为1g:30mL样品中蛋白质的色谱峰面积较高且基线较为平稳。
更为优选，将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，1200rpm室温提取2h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液。
进一步地，所述脱脂大豆粉的制备方法为：将生大豆粉碎为60目粒度的生大豆粉，与正己烷按照1g：30mL的比例混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，室温条件下离心15min后，弃掉上清液，置于通风橱中，将残存正己烷挥发干净后即得脱脂大豆粉。
进一步地，优化得到的所述凝胶柱预纯化为：将所述样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后注入经20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡后的弱阴离子交换柱，流动相由缓冲液A相和缓冲液B相两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为含1M NaCl的20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，洗脱梯度程序如下：
Figure BDA0000947045690000031
Figure BDA0000947045690000041
收集4-5个柱体积的目标蛋白洗脱液。
也可选择自动收集装置，在紫外检测器存在的情况下，收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液。
本发明分别研究了强阴离子交换柱和弱阴离子交换柱的分离效果，经检测发现强阴离子交换柱的目的蛋白洗脱峰左侧有一个杂蛋白峰，且两者的分离度很低，而弱阴离子交换柱消除了该杂蛋白峰的干扰，因此优选弱阴离子交换柱。按照上述流动相和洗脱程序进行操作，仅需要收集4-5个柱体积的含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的洗脱液即可，既可以选择人工收集(在没有紫外检测器的情况下，根据上述洗脱流程仅收集4-5个柱体积的含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的洗脱液)，也可以选择自动收集装置，灵活性更强，节省人力和时间，所以本发明最终确定使用三个阶段线性梯度洗脱程序。
进一步地，优化得到的所述分子筛色谱分离纯化为：将所述目标蛋白洗脱液通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0000947045690000042
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000043
柱(7.8×300mm，3.5μm)；流动相为50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。
本发明分别使用Waters ACQUITY
Figure BDA0000947045690000044
BEH300C4柱(2.1×100mm，1.7μm)柱和Waters
Figure BDA0000947045690000045
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000046
柱(7.8×300mm，3.5μm)，均选择大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子标准品上机检测。经检测发现标准品流经Waters ACQUITY
Figure BDA0000947045690000047
BEH300C4柱后，出现多个色谱峰，无法实现根据标准品对样品中目标蛋白进行定性和定量，而Waters
Figure BDA0000947045690000048
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000049
column柱的色谱峰仅有一个，且色谱峰形较好，最终优选使用Waters
Figure BDA00009470456900000410
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000051
柱。且研究发现，当磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min时，色谱峰能够得到较好的峰形和分离度。
更进一步地，本发明综合上述各优选方案后，提供一个最佳的分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法，具体包括如下步骤：
S1、粗提取：
将50mg脱脂大豆粉与1.5mL 20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液；
S2、凝胶柱预纯化：
S21、将弱阴离子交换柱(DEAE Fast Flow)安装在蛋白纯化仪上，随后用20mMpH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积；
S22、将S1所得的样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后，取1mL样品提取液注入蛋白纯化仪，流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，洗脱梯度程序如下：
Figure BDA0000947045690000052
收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液；
S3、分子筛色谱分离纯化：
将S22收集到的目标蛋白洗脱液，装入进样小瓶，通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0000947045690000061
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000062
柱(7.8×300mm，3.5μm)；进样量：20μL；流动相为磷酸盐缓冲液：50mM pH7.5PB缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。
本发明的有益效果在于：
本发明建立一种由弱阴离子凝胶柱与高效分子筛色谱柱相结合的分离技术从生大豆中提取高纯度的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。
本发明步骤简单，操作可控，环境温和，方法重复性好，同一样品不同平行间的相对标准偏差低于10％，且整个纯化过程的损失率低于10％，产品纯度达95％以上。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和高分辨质谱鉴定结果表明分离出的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子分子量为24275KD，纯度达95％以上，可作为分析标准品用于检测大豆及其加工样品中的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子含量，也可添加在动物饲料中用于其抗营养机理的研究。
附图说明
图1为本发明对比例3中所述Kunitz型胰蛋白酶抑制因子纯化前后色谱对照图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 高纯度大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的制备
本实施例以生大豆中Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的纯化为例，用以说明本发明所述方法。
1、配制所需溶液
(1)20mM pH 6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液按照如下方法制备：209.2g Bis-Tris碱，加800mL纯水，溶解后，用浓盐酸调节pH值到6.4，然后用纯水再定容到1L，配制成1M的母液，然后用纯水按照1:49的体积比稀释成20mM pH 6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液。
(2)20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl含1M NaCl缓冲液按照如下方法制备：量取800mL上述制备的20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，向其中加入58.44g NaCl，溶解后，然后用20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液再定容到1L即可。
(3)50mM pH7.5PB缓冲液按照如下方法制备：
A液：取NaH2PO4·H2O 27.6g溶于蒸馏水，定容至1000ml；
B液：取Na2HPO4·7H2O53.6g溶于蒸馏水，定容至1000ml。
取A液16.0ml与B液84.0ml混合，用水定容至400ml，调pH至7.5，配制成500mM的母液，然后用纯水按照1:9的体积比稀释成50mM pH7.5PB缓冲液。
2、仪器设备
高效液相色谱：Agilent Technologies 1200，美国Agilent Technologies公司；高速冷冻离心机3-30K，美国Sigma公司；涡旋振荡器：Vortex-genie2，美国SI公司；弱阴离子交换柱：DEAE Fast Flow预装柱，规格1mL，美国GE公司；蛋白纯化仪：AKTApure，美国GE公司；分子筛柱：
Figure BDA0000947045690000071
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000072
美国Waters公司；超纯水仪：Milli-Q Biocel型，美国Millipore公司；移液枪：P1000、P200、P100、P20和P2型，法国Gilson公司；电泳仪：PowerPac3000型，美国Bio-Rad公司。
3、样品制备
将100mg生大豆与3mL正己烷混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后离心15min(12000rpm，室温)后，弃掉上清液，置于通风橱中，使样品中残存正己烷挥发干净，得到89mg脱脂大豆粉。
4、样品前处理
取50mg脱脂后的大豆粉与1.5mL 20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取2h，然后离心20min(12000rpm，4℃)后，收集上清液，即为样品提取液。
5、色谱分离
弱阴离子交换层析：
(1)先将弱阴离子交换柱(DEAE Fast Flow)安装在蛋白纯化仪上，随后用20mMpH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积；
(2)将上述样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后，取1mL样品提取液注入蛋白纯化仪，流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mMpH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，洗脱梯度程序如下：
Figure BDA0000947045690000081
Figure BDA0000947045690000091
在280nm处监测洗脱液的吸光度，收集第5.1-9.0min的目标蛋白洗脱液1。
6、分子筛色谱柱进一步纯化
(1)将上述收集到的目标蛋白洗脱液1，装入进样小瓶，通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0000947045690000092
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000093
柱(7.8×300mm，3.5μm)；进样量：20μL；流动相为磷酸盐缓冲液：50mM pH7.5PB缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的目标蛋白洗脱液2。
7、蛋白纯度鉴定
将上述目标蛋白洗脱液2进行SDS-PAGE电泳，进一步鉴定该洗脱液及其纯度。分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％，以分子量标准蛋白(条带大小分别为180、130、95、72、55、43、34、26、17和10KDa)上述目标蛋白洗脱液2以及标准品电泳，电泳条件为浓缩胶恒压90V运行30min，分离胶恒压120V运行1h。电泳结束后用考马斯亮兰G250染色液染色1小时以上，脱色观察。如果目标蛋白洗脱液2与标准品条带在同一22KD的位置，且通过Quantity One对目标蛋白洗脱液2的电泳条带进行灰度分析，纯度达到95％以上，则纯化出来的目的蛋白为高纯度的Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。
对比例1 提取条件的优化
将生大豆样品用粉碎机粉碎，粒度为60目。将上述生大豆粉与正己烷按照1g：30mL的比例混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后离心15min(12000rpm，室温)后，弃掉上清液，置于通风橱中，尽量使样品中残存正己烷挥发干净。
1、样品提取液的优化：
分别使用20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液以及20mM pH7.5的Tris-HCl缓冲液提取脱脂大豆粉，经检测发现使用20mM pH7.5Tris-HCl作为样品提取液进入下一步弱阴离子交换柱预纯化时，穿透峰的紫外吸收很强，且呈现为乳白色的液体，经SDS-PAGE鉴定含有大豆球蛋白等多个高丰度蛋白以及Kunitz型胰蛋白酶抑制因子，其中高丰度蛋白在聚集沉淀的过程中，一定程度上干扰了目标蛋白与离子交换层析介质的结合能力，降低了Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的回收率，而使用pH 6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，降低了大豆球蛋白的溶解度，消除了乳白色的穿透峰的现象，且在一定程度上减少了杂蛋白与离子交换层析介质的结合，最终优选使用20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液作为样品提取液。
2、原料与提取液固液比的优化：
分别选取脱脂大豆粉与Bis-Tris-HCl缓冲液质量体积比为1g:30mL，1g:100mL和1g:500mL，在相同的提取时间条件下，经检测发现质量体积比为1g:100mL和1g:500mL，样品中蛋白质的色谱峰面积偏低，不易定量检测，且基线出现漂移，而质量体积比为1g:30mL样品中蛋白质的色谱峰面积较高且基线较为平稳，最终优选脱脂大豆粉与Bis-Tris-HCl缓冲液质量体积比为1g:30mL。
3、提取时间的优化：
分别选取提取时间为0.5h，1h，2h，和3h，在相同的样品量的条件下，经检测发现提取时间为0.5h，样品中蛋白质的色谱峰面积偏低，说明提取不充分，当提取时间为1h时，样品间平行性较差，而提取时间为2h和3h的样品中蛋白质的色谱峰面积无显著差异，且样品平行性较好，但考虑到节约时间，所以最终确定提取时间为2h。
4、离心机温度的优化：
分别选取25℃和4℃，在相同的转速和离心时间的前提下，后者可在一定程度上降低大豆球蛋白的溶解度，进一步减少了提取液中杂蛋白与离子交换层析介质的结合，最终优选离心机温度为4℃。
在第一步优选方案的基础上，依次以前述优选方案得到的结果作为对后续条件进行优化的前提，最终得到的最佳提取步骤方案，具体为：将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取2h，然后离心20min(12000rpm，4℃)后，收集上清液，即为样品提取液。
对比例2 凝胶柱预纯化条件的优化
1、阴离子凝胶柱的优化：
考虑到Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的等电点，其适合用阴离子交换柱进行分离，分别研究了强阴离子交换柱和弱阴离子交换柱的分离效果，经检测发现强阴离子交换柱的目的蛋白洗脱峰左侧有一个杂蛋白峰，且两者的分离度很低，而弱阴离子交换柱消除了该杂蛋白峰的干扰，最终优选使用弱阴离子交换柱。
2、洗脱梯度程序的优化：
流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，分别使用两种洗脱梯度，第一种为线性梯度洗脱即B相30min内从0％变为100％，第二种为三个阶段线性梯度洗脱即B相0-5min从0％变为15％，第5.0-5.1min从15％变为25％，第9.1-14min，从25％变为100％，在进行下一个样品纯化前，需要用100％A相平衡5-10分钟。两种方法均采用洗脱液自动收集装置，前者需要收集多管洗脱液，且含有目标蛋白的洗脱液内杂蛋白较多，分离度较差，而后者仅需要收集4-5个柱体积的含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子的洗脱液即可，既可以选择人工收集，也可以选择自动收集装置，灵活性更强，节省人力和时间，所以本发明最终确定使用三个阶段线性梯度洗脱程序。
在前述优选方案的基础上，依次以前述优选方案得到的结果作为对后续条件进行优化的前提，最终得到的最佳样品预纯条件为：将上述样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后，取1mL溶液注入蛋白纯化仪，分离柱为1mL弱阴离子交换柱(DEAE Fast Flow)，流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，洗脱梯度程序如下：
Figure BDA0000947045690000121
在280nm处监测洗脱液的吸光度，洗脱液采用自动收集器的峰收集程序，即当洗脱液紫外吸收值不小于5mAU时，收集该洗脱液。洗脱阶段共收集了3个洗脱液，分别为第0-5.0min的洗脱液1、第5.1-9.0min的洗脱液2以及第9.1-14.0min的洗脱液3。将上述各洗脱液装入进样小瓶，利用高效液相色谱仪进行检测，根据标准品的保留时间来确定哪个洗脱峰内含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。检测结果表明，弱阴离子交换柱洗脱液2中含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子，即收集第5.1-9.0min的洗脱液作为目标蛋白洗脱液1。
对比例3 分子筛色谱柱分离条件的优化
1、色谱柱填料的优化：
分别使用Waters ACQUITY
Figure BDA0000947045690000122
BEH300C4柱(2.1×100mm，1.7μm)柱和Waters
Figure BDA0000947045690000131
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000132
柱(7.8×300mm，3.5μm)，均选择大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子标准品上机检测。经检测发现标准品流经Waters ACQUITY
Figure BDA0000947045690000133
BEH300C4柱后，出现多个色谱峰，无法实现根据标准品对样品中目标蛋白进行定性和定量，而Waters
Figure BDA0000947045690000134
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000135
column柱的色谱峰仅有一个，且色谱峰形较好，最终优选使用Waters
Figure BDA0000947045690000136
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000137
柱。
2、流动相的种类、pH和浓度的优化：
分别使用50mM pH6.0的柠檬酸盐缓冲液以及50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液，经检测发现目的蛋白洗脱液1在50mM pH6.0的柠檬酸盐缓冲液中，目标蛋白的色谱峰附近有多个干扰峰，且色谱峰形较差，而50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液进行分离时色谱峰的峰形和分离度都得到明显的改善，此外在相同的pH7.5的条件下，分别使用50mM和250mM的磷酸盐缓冲液进行分离时对色谱峰的峰形和分离度没有显著差异，考虑到生产成本，所以本发明最终确定使用50mM pH7.5磷酸盐缓冲液；最后是流速的优化，分别使用0.3、0.5和0.8mL/min，经检测发现流速为0.8mL/min时，色谱峰的分离度较低，当流速为0.3mL/min时，虽然色谱峰虽然能够得到较好的峰形和分离度，但分离纯化时间延长，而流速为0.5mL/min时，不仅色谱峰能够得到较好的峰形和分离度，而且缩短了分离纯化时间，所以本发明最终确定磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min。最佳色谱条件为：将上述目标蛋白洗脱液1，装入进样小瓶，通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure BDA0000947045690000138
BEH SEC
Figure BDA0000947045690000139
柱(7.8×300mm，3.5μm)；进样量：20-40μL；流动相为磷酸盐缓冲液：50mM pH7.5PB缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min。
在280nm处监测洗脱液的吸光度，根据标准品的保留时间来确定哪个色谱峰含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。上述色谱图结果如图1所示，自上到下分别为Kunitz型胰蛋白酶抑制因子标准品色谱图、样品提取液色谱图以及过BEH SEC
Figure BDA0000947045690000141
柱的色谱图。图1表明，经弱阴离子交换柱纯化后的样品溶液经过BEH SEC
Figure BDA0000947045690000142
分子筛后，仅有一个高峰度的洗脱峰，保留时间约为19min左右，与标准品的保留时间相吻合，说明该洗脱液内含有大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子，即第18.8-19.2min收集到的洗脱液为目标蛋白洗脱液2。
4、蛋白纯度鉴定
将上述目标蛋白洗脱液2馏分收集后进行高分辨质谱鉴定，结果表明，目标蛋白洗脱液2为Kunitz型胰蛋白酶抑制因子，分子量为24275KD。
同时将上述目标蛋白洗脱液2进行SDS-PAGE电泳测定，进一步鉴定该洗脱峰的纯度。以分子量标准蛋白(条带大小分别为180、130、95、72、55、43、34、26、17和10KDa)、目标蛋白洗脱液2以及标准品电泳，电泳条件为浓缩胶恒压90V运行30min，分离胶恒压120V运行1h。电泳结束后用考马斯亮兰G250染色液染色1小时以上，脱色观察，结果表明目的蛋白洗脱液2与Kunitz型胰蛋白酶抑制因子标准品在同一分子量水平，大约为24KD，且整条泳道上无其它杂蛋白条带。通过Quantity One对目标蛋白洗脱液2的电泳条带进行灰度分析，经过第二次柱纯化后大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制因子得到有效分离，且纯度达到95％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种分离纯化大豆蛋白酶抑制因子的方法，其特征在于，将脱脂大豆粉，先后经粗提取、凝胶柱预纯化和分子筛色谱分离纯化得到大豆蛋白酶抑制因子；其中，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：20～40mL的比例混合，室温提取2～3h，然后在3～8℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液；所述大豆蛋白酶抑制因子为Kunitz型胰蛋白酶抑制因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述粗提取为将脱脂大豆粉与20mM pH6.4Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，室温提取2h，然后在4℃的条件下离心收集上清液，得到样品提取液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将脱脂大豆粉与20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液按照1g：30mL的比例混合，1200rpm室温提取2h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述脱脂大豆粉的制备方法为：将生大豆粉碎为60目粒度的生大豆粉，将生大豆粉与正己烷按照1g：30mL的比例混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，室温条件下离心15min后，弃掉上清液，置于通风橱中，将残存正己烷挥发干净后即得脱脂大豆粉。
5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述凝胶柱预纯化为：将所述样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后注入经20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡后的弱阴离子交换柱，流动相由缓冲液A相和缓冲液B相两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为含1M NaCl的20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，洗脱梯度程序如下：
Figure FDA0002457141950000021
收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分子筛色谱分离纯化为：将所述目标蛋白洗脱液通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure FDA0002457141950000022
BEH SEC
Figure FDA0002457141950000023
柱7.8×300mm 3.5μm；流动相为50mM pH7.5的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。
7.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1、粗提取：
将50mg脱脂大豆粉与1.5mL 20mM pH6.4 Bis-Tris-HCl缓冲液混合，置于涡旋混合仪上，1200rpm室温提取1h，然后在12000rpm，4℃的条件下离心20min后，收集上清液，得到样品提取液；
S2、凝胶柱预纯化：
S21、将弱阴离子交换柱DEAE Fast Flow安装在蛋白纯化仪上，随后用20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液平衡10个柱体积；
S22、将S1所得的样品提取液经过0.2μm滤膜过滤后，取1mL样品提取液注入蛋白纯化仪，流动相由A、B两相组成：缓冲液A相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液，缓冲液B相为20mM pH6.4的Bis-Tris-HCl缓冲液含1M NaCl，洗脱梯度程序如下：
Figure FDA0002457141950000031
收集第5.1-9.0min的280nm紫外吸收值不小于5mAU的目标蛋白洗脱液；
S3、分子筛色谱分离纯化：
将S22收集到的目标蛋白洗脱液，装入进样小瓶，通过高效液相色谱仪进行分子筛柱子的分离纯化，液相色谱条件为：色谱柱：Waters
Figure FDA0002457141950000032
BEH SEC
Figure FDA0002457141950000033
柱7.8×300mm3.5μm；进样量：20μL；流动相为磷酸盐缓冲液：50mM pH7.5 PB缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的流速为0.5mL/min，收集第18.8-19.2min的洗脱液得到纯化的大豆蛋白酶抑制因子。
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