CN111057142A - 一种特立帕肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种特立帕肽的纯化方法，包括以下步骤：1)以纯化水溶解特立帕肽粗品，控制粗品浓度并用0.45μm滤膜过滤。2)以聚合物填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以TFA水溶液为流动相A，以乙腈水溶液为流动相B。3)以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以硫酸盐缓冲溶液为流动相A，以乙腈水溶液为流动相B。4)，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定的色谱柱，先以醋酸铵和乙腈，按一定的比例进行离子交换；再以醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。5)将转盐后合格馏分，浓缩后上冻干。本发明采用液相自动化设备，利用不同色谱填料结合不同流动相，制备得到单杂小于0.1％，总杂小于0.2％的精肽，且纯化总收率高达70％以上，建立了一种纯度高、纯化收率高、且自动化程度高的特立帕肽纯化工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种肽的纯化方法，尤其涉及特立帕肽的纯化方法。
技术背景
特立帕肽，英文名为Teriparatide，是一个34肽，为人甲状腺旁腺激素PTH的1-34氨基酸片段，氨基酸序列为H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。特立帕肽是首个获得FDA批准的用于治疗骨质疏松症的骨形成促进剂。
特立帕肽分子中因具有9分子的碱性氨基酸残基与4分子的酸性氨基酸残基而呈碱性，对酸较稳定。当前涉及特立帕肽纯化的方法多数为用TFA或者醋酸为流动相，旋蒸浓缩后冻干，得到成品。现有技术纯化效果大部分未能达到最大单杂小于0.1％，且单次纯化量低、纯化收率低、纯化过程自动化程度低，未能满足大工业生产的需要。
为解决现有技术中存在的且单次纯化量小、纯化收率低、纯化过程自动化程度低等难题，进一步提高特立帕肽的纯度，还需进一步研究特立帕肽的纯化方法。
发明内容
本发明提出了一种特立帕肽的纯化方法，纯化效果好、收率高、单次纯化量大，达到大工业生产纯化的需求。
为实现上述目的，并结合特立帕肽的性质，本发明提供的特立帕肽纯化步骤如下：
1)以纯化水溶解特立帕肽粗品，控制特立帕肽粗品溶液浓度为50-100mg/mL，用0.45μm滤膜过滤。
粗品溶液指用纯化水溶解特立帕肽粗品后所得到的溶液，纯化水选用超纯水；将粗品溶液浓度控制在50-100mg/mL有利于粗品溶液的前处理；若粗品溶液浓度太低，体积太大，则上样时间及过滤时间增加，纯化总耗时增加；若粗品溶液浓度太高，样品容易聚集，不易溶解，难过滤，样品损失较大。
2)将特立帕肽粗品溶液以聚合物填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以0.1-0.5％TFA水溶液为流动相A，以70-90％乙腈水溶液为流动相B。
聚合物填料选用纳微单分散聚合物色谱填料，优选UniPS40-300填料。流动相优选0.1-0.2％TFA和75-85％乙腈，进一步优选0.1％TFA和80％乙腈，梯度为乙腈％：32-38％。TFA流动相简单易配制，无需调节pH，操作简单，工艺易重现。
纯化后所得样品纯度大于95％，用于二步纯化，本步骤纯化收率约90％，能有效提高样品纯度及收率，用UniPS40-300填料，150DAC制备柱，单针上样量从含特立帕肽15g增加到90g，大大减少纯化针数，降低生产成本。
3)将2)所得的纯度大于95％的馏分以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以20-200mmol/L硫酸盐缓冲溶液为流动相A，以70-90％乙腈为流动相B。
十八烷基硅烷键合硅胶填料优选Daiso C18。硫酸盐缓冲溶液不局限于硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵等硫酸盐，优选硫酸钠；硫酸盐缓冲溶液浓度优选20-50mmol/L，进一步优选50mmol/L，缓冲液浓度不宜过高，有稳定缓冲作用即可。有机相优选80％乙腈，梯度为乙腈％：32-42％。
缓冲盐溶液pH为2-5，优选pH为2-3，进一步优选pH为2.3。pH调节剂为磷酸，用中强酸调节pH能有效控制流动相pH，增加保留，改善分离效果，避免使用硫酸，可提高生产的安全性。通过pH控制能增大杂质的分离度，起到更有效的纯化效果。
TFA体系中难除去的杂质在硫酸钠体系中有明显的纯化效果，采用硫酸钠缓冲溶液-乙腈体系进行纯化，能有效改善峰型，使得峰型对称，目标峰集中，能避免前延或拖尾峰；收集完馏分后用纯化水稀释，降低馏分中样品浓度，避免样品盐析。
二步纯化后所得样品纯度大于98.5％，纯化收率约90％。
4)将3)得到的纯度大于98.5％的馏分用于转盐，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定的色谱柱，先以20-200mmol/L醋酸铵和乙腈，按一定的比例进行离子交换；再以0.01-0.1％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。
以十八烷基硅烷键合硅胶填料优选Daiso C18填料，醋酸铵浓度优选20-50mmol/L，进一步优选50mmol/L。离子交换比例优选为醋酸铵：乙腈＝95:5。醋酸水溶液浓度优选0.05％，用0.05％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，梯度为乙腈％：20-30％。醋酸铵能将上述纯化步骤中引入的硫酸盐全部置换，并将三氟乙酸根降至0.1％以下，避免成品中引入不必要的离子。采用0.05％的醋酸洗脱，不仅对杂质有较好的分离效果，而且冻干后成品中醋酸含量能精确控制在合格范围内(特立帕肽质量标准中醋酸含量应控制在4％-9％)，从而提高成品质量标准。
5)转盐后合格馏分，浓缩上冻干。所得精肽纯度大于99.8％，纯化总收率高达70％。
本发明工艺操作简单，有利于工业自动化生产。一步纯化采用UniPS40填料，能耐强酸强碱，能除去极性小的分子，更好的保护色谱柱，并能达到分离纯化的效果；二步纯化及转盐采用Daiso C18填料，能更有效分离难除杂质，提高目标峰纯度；两种色谱填料结合使用，更有效保护色谱柱。一步纯化使用TFA-乙腈，二步纯化使用硫酸盐缓冲溶液-乙腈，两种流动相结合使用，能更有效地分离不同类型杂质，针对特定杂质进行控制，有效提高单针纯化收率；增加杂质的分离度，提高成品质量。
采用液相自动化设备能实现自动化控制，在线智能监控，保证工艺精准可控，降低人力成本，解决工艺不稳定问题，从而得到纯度高、纯化收率高、且自动化程度高的生产工艺，特别在放大生产时，产能突出。
本方案工艺操作简单，并能实现自动化操作，通过本方案可制备得到单杂小于0.1％，总杂小于0.2％的精肽，纯化总收率高达70％以上。
附图说明
图1是实施例一中粗品溶液的目标峰HPLC谱图(粗品纯度为62.72％)。
图2是为实施例一中粗品溶液的目标峰HPLC谱图放大图(粗品纯度为62.72％)。
图3是实施例一中第一步纯化后的目标峰HPLC谱图(第一步纯化后纯度为95.24％)。
图4是实施例一中第一步纯化后的目标峰HPLC谱图放大图(第一步纯化后纯度为95.24％)。
图5是实施例一中第二步纯化后的目标峰HPLC谱图(第二步纯化后纯度为99.14％)。
图6是实施例一中第二步纯化后的目标峰HPLC谱图放大图(第二步纯化后纯度为99.14％)。
图7是实施例一中转盐纯化后的目标峰HPLC谱图(转盐后纯度为99.96％)。
图8是实施例一中转盐纯化后的目标峰HPLC谱图放大图(转盐后纯度为99.96％)。
具体实施方式
实施例一：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为45.6％，粗品用超纯水进行溶解；取198.6g粗品加入2.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.1％TFA，B：80％乙腈；梯度：流动相B为32-38％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：198.6g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：50mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝2.30，B：80％乙腈；梯度：流动相B为32-42％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：198.6g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用50mmol/L醋酸铵：乙腈＝95:5进行转盐，再用0.05％醋酸水溶液：乙腈＝95:5平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约76.2g合格的精肽，纯化总收率为84.1％。
实施例二：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为43.9％，粗品用超纯水进行溶解；取198.4g粗品加入2.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS10-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.5％TFA，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-44％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：198.4g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：200mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝3.50，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-48％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：198.4g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用100mmol/L醋酸铵：乙腈＝95:5进行转盐，再用0.01％醋酸水溶液：乙腈＝95:5平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，检测所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约67.0g合格的精肽，纯化总收率为76.9％。
实施例三：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为43.2％，粗品用超纯水进行溶解；取189.1g粗品加入1.9L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS10-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.5％TFA，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-34％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：189.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：100mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝5.00，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-38％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：189.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用200mmol/L醋酸铵：乙腈＝95:5进行转盐，再用0.10％醋酸水溶液：乙腈＝95:5平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，检测所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约61.2g合格的精肽，纯化总收率为74.9％。
实施例四：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为38.4％，粗品用超纯水进行溶解；取209.2g粗品加入2.1L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为中压层析柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为70mm*310mm。流动相：A：0.3％TFA，B：75％乙腈；梯度：流动相B为34-40％。流速：150mL/min；检测波长：220nm；进样量：104.6g。
纯化过程：粗品溶液分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分并合并，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。流动相：A：60mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝2.40，B：75％乙腈；梯度：流动相B为34-44％。流速：220mL/min；检测波长：220nm；进样量：104.6g。
纯化过程：一步纯化并样分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。用180mmol/L醋酸铵：乙腈＝94:6进行转盐，再用0.05％醋酸水溶液：乙腈＝94:6平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约62.2g合格的精肽，纯化总收率为77.4％。
实施例五：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为34.5％，粗品用超纯水进行溶解；取203.1g粗品加入2.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.2％TFA，B：85％乙腈；梯度：流动相B为33-36％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：203.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装YMC C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：20mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝2.00，B：85％乙腈；梯度：流动相B为30-40％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：203.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装YMC C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用20mmol/L醋酸铵：乙腈＝90:10进行转盐，再用0.02％醋酸水溶液：乙腈＝90:10平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约55.0g合格的精肽，纯化总收率为78.5％。
实施例六：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为49.2％，粗品用超纯水进行溶解；取180.5g粗品加入1.8L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.3％TFA，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-34％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：180.5g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Kromasil C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：110mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝3.00，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-38％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：180.5g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Kromasil C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用110mmol/L醋酸铵：乙腈＝93:7进行转盐，再用0.09％醋酸水溶液：乙腈＝93:7平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约64.3g合格的精肽，纯化总收率为72.4％。
实施例七：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为42.8％，粗品用超纯水进行溶解；取196.9g粗品加入1.9L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.5％TFA，B：85％乙腈；梯度：流动相B为30-36％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：196.9g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Kromasil C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：190mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝3.80，B：85％乙腈；梯度：流动相B为30-40％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：196.9g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Kromasil C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用40mmol/L醋酸铵：乙腈＝95:5进行转盐，再用0.08％醋酸水溶液：乙腈＝95:5平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约66.5g合格的精肽，纯化总收率为78.9％。
实施例八：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为44.2％，粗品用超纯水进行溶解；取195.8g粗品加入2.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为中压层析柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为70mm*310mm。流动相：A：0.2％TFA，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-44％。流速：150mL/min；检测波长：220nm；进样量：97.9g。
纯化过程：粗品溶液分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱80min，收集目标馏分并合并，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Luna C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。流动相：A：35mmol/L硫酸钠，用磷酸调节pH＝2.50，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-48％。流速：220mL/min；检测波长：220nm；进样量：97.9g。
纯化过程：一步纯化并样分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Luna C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。用35mmol/L醋酸铵：乙腈＝92:8进行转盐，再用0.03％醋酸水溶液：乙腈＝92:8平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，检测所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约63.5g合格的精肽，纯化总收率为73.4％。
实施例九：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为45.2％，粗品用超纯水进行溶解；取200.2g粗品加入2.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为中压层析柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为70mm*310mm。流动相：A：0.1％TFA，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-34％。流速：150mL/min；检测波长：220nm；进样量：100.1g。
纯化过程：粗品溶液分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分并合并，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。流动相：A：70mmol/L硫酸铵，用磷酸调节pH＝2.20，B：90％乙腈；梯度：流动相B为28-38％。流速：220mL/min；检测波长：220nm；进样量：100.1g。
纯化过程：一步纯化并样分两针纯化，色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为静态制备柱，内装Daiso C18填料，柱子直径和长度为100mm*250mm。用70mmol/L醋酸铵：乙腈＝90:10进行转盐，再用0.04％醋酸水溶液：乙腈＝90:10平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，检测所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约71.3g合格的精肽，纯化总收率为78.8％。
实施例十：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为38.5％，粗品用超纯水进行溶解；取210.8g粗品加入2.8L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS10-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.4％TFA，B：85％乙腈；梯度：流动相B为30-36％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：210.8g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：90mmol/L硫酸钾，用磷酸调节pH＝4.00，B：85％乙腈；梯度：流动相B为30-40％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：210.8g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Phenomenex C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用150mmol/L醋酸铵：乙腈＝95:5进行转盐，再用0.02％醋酸水溶液：乙腈＝95:5平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，检测所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约58.9g合格的精肽，纯化总收率为72.6％。
实施例十一：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为44.9％，粗品用超纯水进行溶解；取201.1g粗品加入4.0L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.4％TFA，B：75％乙腈；梯度：流动相B为34-40％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：201.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装YMC C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：80mmol/L硫酸铵，用硫酸调节pH＝4.50，B：75％乙腈；梯度：流动相B为34-44％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：201.1g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装YMC C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用80mmol/L醋酸铵：乙腈＝90:10进行转盐，再用0.06％醋酸水溶液：乙腈＝90:10平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约64.7g合格的精肽，纯化总收率为71.7％。
实施例十二：
1、样品处理：
将固相合成样品裂解，得到固体粗品，粗品含量为37.6％，粗品用超纯水进行溶解；取207.5g粗品加入2.1L超纯水中，搅拌超声助溶，溶解澄清后，用孔径为0.45μm滤膜过滤，得到粗品溶液。
2、一步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装UniPS40-300填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：0.1％TFA，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-44％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：207.5g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，所得馏分纯度大于95％，用纯化水稀释后，备用。
3、二步纯化
纯化条件：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Luna C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。流动相：A：120mmol/L硫酸钾，用硫酸调节pH＝2.80，B：70％乙腈；梯度：流动相B为36-48％。流速：400mL/min；检测波长：220nm；进样量：207.5g。
纯化过程：色谱柱平衡后进样，梯度洗脱60min，收集目标馏分，馏分用纯化水稀释，所得样品纯度大于98.5％，备用待转盐。
4、转盐
转盐过程：色谱柱：制备色谱柱为动态轴向压缩柱，内装Luna C18填料，柱子直径和长度为150mm*250mm。用120mmol/L醋酸铵：乙腈＝91:9进行转盐，再用0.07％醋酸水溶液：乙腈＝91:9平衡，最后按照流动相B为20-30％梯度洗脱60min，收集洗脱液，所得样品经检测单杂小于0.1％，纯度大于99.8％。
样品浓缩后冻干，得到约57.2g合格的精肽，纯化总收率为73.3％。
Claims (15)
1.一种特立帕肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以纯化水溶解特立帕肽粗品，控制特立帕肽粗品浓度为50-100mg/mL，用0.45μm滤膜过滤。
2)将特立帕肽粗品溶液以聚合物填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以0.1-0.5％TFA水溶液为流动相A，以70-90％乙腈水溶液为流动相B。
3)将2)得到的合格馏分以十八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相的色谱柱进行梯度洗脱，以20-100mmol/L硫酸盐缓冲溶液为流动相A，调节pH为2-5；以70-90％乙腈水溶液为流动相B。
4)将3)得到的合格馏分用于转盐，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定的色谱柱，先以20-200mmol/L醋酸铵和乙腈，按一定的比例进行离子交换；再以0.01-0.1％醋酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，进行梯度洗脱。
5)将转盐后合格馏分，浓缩后上冻干。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述聚合物填料为UniPS40-300。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤2)中TFA水溶液浓度为0.1-0.2％，乙腈水浓度为75-85％。
4.根据权利要求1或3任一项所述方法，其特征在于：所述步骤2)中TFA水溶液浓度为0.1％，乙腈水浓度为80％，梯度为乙腈％：32-38％。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述十八烷基硅烷键合硅胶填料为DaisoC18。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐缓冲溶液浓度为20-50mmol/L，乙腈水浓度为70-80％。
7.根据权利要求1或6任一项所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐浓度为50mmol/L，乙腈水浓度为80％。梯度为乙腈％：32-42％。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐为硫酸钠。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐缓冲溶液pH为2-3。
10.根据权利要求1或9任一项所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐缓冲溶液pH为2.3。
11.根据权利要求1、9或10任一项所述方法，其特征在于：所述步骤3)中硫酸盐缓冲溶液pH调节剂为磷酸。
12.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤4)中醋酸铵浓度为20-50mmol/L。
13.根据权利要求1或12任一项所述方法，其特征在于：所述步骤4)中醋酸铵浓度为50mmol/L。
14.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤4)中离子交换的比例为：醋酸铵：乙腈＝95:5。
15.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述步骤4)中醋酸水浓度为0.05％，梯度为乙腈％：20-30％。
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