CN101463080B - 一种纯化奈西利肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种奈西利肽的纯化方法，主要通过将奈西利肽粗肽与固相结合，用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱，浓缩洗脱液，将浓缩的粗肽溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。本发明的纯化方法适于产业化纯化奈西利肽，纯度高且收率好，达到产业化要求，为大量纯化制备奈西利肽原料药提供了一种有效纯化工艺。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及反相高效液相色谱法纯化奈西利肽的方法。
背景技术
奈西利肽(Nesiritide)又称人脑利钠肽，由Sudoh于1988年从猪脑组织中分离出来，是内源性利钠家族的重要成员之一，主要由心脏分泌。其结构与心钠素相似，具有利钠、利尿、扩张血管和抑制肾素分泌等作用，主要用于治疗心力衰竭等，其效果较好且副作用小，是一种很有市场前景的多肽药物。
奈西利肽(Nesiritide)序列如下所示：
现有技术纯化奈西利肽的方法得到的精肽奈西利肽纯度不高，收率低。
发明内容
本发明提出了一条适于产业化纯化奈西利肽的方法，使用反相高效液相色谱法纯化奈西利肽，纯度高且收率好，达到产业化要求。
为实现上述目的，本发明采取纯化奈西利肽的方法，包括以下步骤：
a、以反相硅胶为固相，以体积比为80-95∶20-5的水和乙腈为流动相，将奈西利肽粗肽与固相结合；
b、用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱；
c、浓缩洗脱液；
d、上述浓缩的粗肽溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：B％：5％-45％，A相的pH应小于5，不小于1.5；
e、采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。
步骤a、以反相硅胶为固相，以体积比为80-95∶20-5的水和乙腈为流动相，将奈西利肽粗肽与固相结合；所述体积比为80-95∶20-5的水和乙腈的含义是水∶乙腈的体积比为80∶20至95∶5之间的任意一个比例，下面所述的“用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液”，“优选20-50∶80-50的水和乙腈为洗脱液”，“更优选30-40∶70-60的水和乙腈为洗脱液”，“优选90-95∶10-5水和乙腈为流动相”等表达含义的解释逻辑相同。
其中所述的“反相硅胶”是C8或C18的硅胶；将“奈西利肽粗肽与固相结合”可以通过将奈西利肽粗肽溶液过硅胶柱实现；奈西利肽粗肽指采用固相合成法等合成获得未曾精制的奈西利肽；优选90-95∶10-5水和乙腈为流动相，更优选95∶5的水和乙腈为流动相；
步骤b、用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱；
水和乙腈的体积乙腈含量的升高，洗脱效果越好，其中优选20-50∶80-50的水和乙腈为洗脱液，更优选30-40∶70-60的水和乙腈为洗脱液；所述的“对固相进行洗脱”为常规的洗脱操作，并收集洗脱液。
步骤c、浓缩洗脱液；
将步骤b所收集的洗脱液进行浓缩至10-15mg/mL，优选旋转蒸发浓缩方式。
步骤d、上述浓缩的粗肽溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中：梯度：B％：5％-45％，A相的pH应小于5，不小于1.5；
其中A相的pH优选为小于4.5，不小于2.5；。梯度B％优选为：12％-38％。
步骤e、采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。
通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂，如Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41等进行离子交换，将奈西利肽的磷酸根或三氟醋酸根转换成醋酸根实现。
纯化规模包括以下规格色谱柱：5cm×25cm(柱子直径×长度)、15cm×25cm、30cm×25cm。
本发明的方法纯化奈西利肽操作简单可行、纯度高、收率好，达到产业化要求。
具体实施方式
下面给出实施例以对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明作进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据本发明内容对本发明作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例一：
1、样品处理：将奈西利肽粗肽稀溶液用反相硅胶为固相，以水和乙腈为液相，调整水和乙腈的比例为95∶5，将粗肽与固相结合。然后调整水和乙腈比例为大于1∶99，使得粗肽完全溶于液相中，旋转蒸发浓缩至10-15mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：5cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用磷酸调pH至3.0-4.5；B相：色谱纯乙腈。流速：50-80ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％-32％30-40min。进样量为1.5-3g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为150-200ml样品溶液。线性梯度洗脱40-50min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。
3、转盐：取6.2g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，上样量1g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8ml/g后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的奈西利肽，收率46.7％。
实施例二：
1、样品处理：将奈西利肽粗肽稀溶液用反相硅胶为固相，以水和乙腈为液相，调整水和乙腈的比例为80∶20，将粗肽与固相结合。然后调整水和乙腈比例为48∶52，使得粗肽溶于液相中，旋转蒸发浓缩至12mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用磷酸调pH至3.0-4.5；B相：色谱纯乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：12％～38％50-70min。进样量为10-20g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1000ml-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱50-70min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。
3、转盐：取48g阴离子交换树脂Wofatit AD-41置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，上样量5.9g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8ml/g后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的奈西利肽，收率49.2％。
实施例三：
1、样品处理：将奈西利肽粗肽稀溶液用反相硅胶为固相，以水和乙腈为液相，调整水和乙腈的比例为90∶10，将粗肽与固相结合。然后调整水和乙腈比例为30∶70，使得粗肽溶于液相中，旋转蒸发浓缩至10mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用磷酸调pH至2.7-4.2；B相：色谱纯乙腈。流速：1900-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：9％～41％100-150min。进样量为55-75g。
纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为5500ml-7500ml样品溶液。线性梯度洗脱100-150min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过37℃下减压旋蒸浓缩至约10-20mg/mL后备用。
3、转盐：取460g阴离子交换树脂Amberlite IRA-93置于合适大小的砂芯漏斗中，用超纯水冲洗至中性后上样，上样量62g，减压抽滤并收集滤液，滤液于不超过35℃下减压旋蒸浓缩至约5-8ml/g后转至合适大小西林瓶，进行冷冻干燥，即可得到纯度大于98.5％的奈西利肽，收率51.3％。
实施例四：
1、样品处理：将奈西利肽粗肽稀溶液用反相硅胶为固相，以水和乙腈为液相，调整水和乙腈的比例为85∶15，将粗肽与固相结合。然后调整水和乙腈比例为30∶70，使得粗肽溶于液相中，旋转蒸发浓缩至10mg/mL，用滤膜过滤后收集滤液备用。
2、纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：30cm×25cm。流动相：A相：磷酸二氢钠水溶液用磷酸调pH至1.5-5；B相：色谱纯乙腈。流速：1900-2200ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：5％～45％100-150min。进样量为55-75g。
其他操作同实施例3，即可得到纯度大于98.5％的奈西利肽，收率50.4％。
综上所述：本发明通过将奈西利肽粗肽与固相结合，用高压反相色谱纯化后采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐，纯化方法适于奈西利肽的规模纯化，纯度高且收率好，达到产业化要求，为大量纯化制备奈西利肽原料药提供了一种有效纯化工艺。
Claims (10)
1.一种纯化奈西利肽的方法，包括以下步骤：
a、以反相硅胶为固相，以体积比为80-95∶20-5的水和乙腈为流动相，将奈西利肽粗肽与固相结合；
b、用1-50∶99-50的水和乙腈为洗脱液对固相进行洗脱；
c、浓缩洗脱液；
d、上述浓缩的粗肽溶液用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中，梯度B％：5％-45％，A相的pH应小于5，不小于1.5；
e、采用阴离子交换法将磷酸盐、三氟醋酸盐转成醋酸盐。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的a步骤中作为流动相的水和乙腈的体积比优选为90-95∶10-5。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于：A相的pH应小于4.5，不小于2.5。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于：A相的pH应小于4.5，不小于2.5。
5.根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于：所述d步骤的梯度B％：12％-38％。
6.根据权利要求1至4任意一项所述方法，其特征在于：所述的阴离子交换法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于：所述的阴离子交换法为通过采用能够提供醋酸根的阴离子交换树脂进行离子交换实现，所述的阴离子交换树脂是Amberlite IRA-93或Wofatit AD-41。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的a步骤中作为流动的水和乙腈的体积比优选为95∶5。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于：所述的b步骤中作为流动相的水和乙腈的体积比优选为20-50∶80-50。
10.根据权利要求1或9所述方法，其特征在于：所述的b步骤中作为流动相的水和乙腈的体积比优选为30-40∶70-60。
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