CN102964430B - 一种替考拉宁的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种替考拉宁的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：(1)调节替考拉宁发酵液至碱性后进行过滤；(2)将步骤(1)得到的滤液调节至酸性后通过大孔吸附树脂，依次用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；(3)将步骤(2)得到的洗脱液过滤，滤液通过硅胶层析分离，收集体积比为10-50％乙醇水溶液的洗脱液；(4)将步骤(3)得到的洗脱液调节至酸性后通过截流分子量为5000～30000Da，优选为10000Da的超滤膜进行超滤，得到超滤液；以及(5)将步骤(4)得到的超滤液通过截流分子量为100～1000Da，优选为200Da的纳滤膜进行纳滤，浓缩得到替考拉宁。本发明的纯化方法最大限度地提高了替考拉宁的生产效率从而实现了高纯度替考拉宁的产业化生产。

Description

一种替考拉宁的纯化方法

技术领域

本发明涉及一种替考拉宁的纯化方法。

背景技术

替考拉宁(teicoplanin)是比较有代表性的糖肽系列抗生素。临床上主要用于治疗金葡菌及链球菌属等敏感菌所致的严重感染，如心内膜炎、骨髓炎、败血症及呼吸道、泌尿道、皮肤、软组织等的感染。其抗菌机理在于该物质可以阻碍革兰氏阳性菌株细胞壁合成过程中肽聚糖合成中间体的相互结合，从而起到抑制上述细菌成长的作用。

在现有的替考拉宁生产方法中，一般采用替考游动放线菌作为替考拉宁的生产菌株，并需要对发酵获得的替考拉宁粗品进行纯化。中国专利申请200710107185.6公开了一种高纯度替考拉宁的生产方法，该方法具体如下：对替考拉宁粗品溶解于碳酸钠和碳酸氢钠的缓冲液，后采用GE公司的葡聚糖凝胶或琼脂糖类凝胶进行层析。层析液调pH7.0后通过大孔吸附树脂JD-I再次进行分离，用60％乙醇洗脱；分离液进行炭脱、超滤、纳滤得到纳滤浓缩液，浓缩液加入丙酮，至丙酮浓度为68％，过滤除去析出的杂质，再加入丙酮，至90％丙酮浓度，析出替考拉宁，过滤干燥后得到替考拉宁成品。该方法的缺陷在于工艺复杂，分离纯化效果差，提炼收率低，实际操作难度大；采用进口葡聚糖凝胶和琼脂糖类凝胶进行层析，价格昂贵，设备投入高；结晶时使用大量丙酮，影响生产环境和人员健康。因此，迫切需要开发出新的能够适用于产业化生产的替考拉宁提纯方法。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种替考拉宁的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：

(1)调节替考拉宁发酵液至碱性后进行过滤；

(2)将步骤(1)得到的滤液调节至酸性后通过大孔吸附树脂，依次用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；

(3)将步骤(2)得到的洗脱液过滤，滤液通过硅胶层析分离，收集10-50％(体积比)乙醇水溶液的洗脱液；

(4)将步骤(3)得到的洗脱液调节至酸性后通过截流分子量为5000～30000Da，优选为10000Da的超滤膜进行超滤，得到超滤液；

(5)将步骤(4)得到的超滤液加入环氧乙烷，升温到30-50℃，优选为40℃，搅拌，然后通过截流分子量为100～1000Da，优选为200Da的纳滤膜进行纳滤，浓缩得到替考拉宁。

优选地，在步骤(1)中，所述碱性是指pH为9-11；更优选地，所述过滤为陶瓷膜过滤。

优选地，在步骤(2)中，所述酸性是指pH为6.5-7.5。

优选地，在步骤(2)中，所述大孔吸附树脂选自D101、DA201、JD-1、FX-06、FX-03，优选大孔吸附树脂FX-06。

优选地，在步骤(3)中，所述洗脱液先进行如下处理，然后再过滤：

向所述洗脱液中加入30％的丙酮，在80摄氏度下反应2个小时，倒入冰水中，盐析出白色沉淀物，然后过滤掉沉淀物。

优选地，在步骤(3)中，所述洗脱液经活性碳脱色后再过滤；更优选地，所述活性炭脱色的温度为15-20℃。

优选地，在步骤(3)中，通过所述硅胶层析分离的滤液的pH为6.5-7.5。

优选地，在步骤(4)中，所述酸性是指pH为6.5-7.5；更优选地，所述超滤温度为10-15℃。

优选地，在步骤(5)中，升温后的超滤液经药用炭脱色，然后再进行纳滤。

优选地，在步骤(5)中，所述纳滤温度为10-15℃。

优选地，所述纯化方法还包括将得到的替考拉宁在-40～-50℃下冻干的步骤。

本发明的纯化方法最大限度地提高了替考拉宁的生产效率，从而实现了高纯度替考拉宁的产业化生产。

与现有技术相比，本发明的方法至少具备以下有益效果：

本发明用新的大孔吸附树脂，例如FX06与硅胶层析代替了现有技术中的DJ-1大孔树脂或Q sepharose凝胶，并用冻干方法代替了原有专利中丙酮结晶的方法。减少了有机溶剂的使用，这不仅仅保护了环境，更避开了有机溶剂残留这个问题。并且通过本发明纯化方法得到的替考拉宁有效成分得到了提高，外观颜色得到明显改观，并且提纯的成本得到有效降低。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

(1)将100L替考拉宁发酵液用4％氢氧化钠调整pH为9～11，进行含量测定，含量为1257mg/L，经50nm的陶瓷膜过滤，过滤温度小于25℃，顶水量为300L，最终得到陶瓷膜过滤液为376L，进行测定含量为330mg/L，回收替考拉宁124.08g，收率为98.71％。

(2)将步骤(1)中得到的陶瓷膜过滤液，用5％盐酸调整pH为6.5～7.5，通过大孔吸附树脂FX-06吸附，用水顶洗树脂至流出的水无色后，用0.1mol的氨水进行解析，流速为2BV/hr，得到解析液21.5L；调整pH为5.0～6.0，进行测定含量为4963mg/L，回收替考拉宁106.7g，收率为85.99％。解析液经HPLC分析，替考拉宁A2的峰面积为总峰面积的89.1％。

(3)向步骤(2)中解析液21.5L，加入30体积％的丙酮，在80摄氏度下反应2个小时，倒入冰水中，盐析出白色沉淀物，然后过滤掉沉淀物，得到剩余解析液，加入针用炭106g，控制温度为15～20℃，搅拌30～50min，过滤后得澄清滤液。滤液回调pH为6.5～7.5，上硅胶层析分离，用8.0L 10％乙醇洗涤，流速1BV/hr；用4.0L 20％乙醇洗涤，流速1BV/hr，最后用50％乙醇溶液以0.5BV/hr的流速洗脱，按先后顺序收集洗脱液，洗脱液混合后得到6.5L溶液，测定含量为10500mg/L，回收替考拉宁68.25g，收率为71.07％；洗脱液经HPLC分析，替考拉宁A2的峰面积为总峰面积的93.6％。

(4)将步骤(3)洗脱液调整pH为6.5～7.5，然后经过截流分子量为10000Da的超滤膜去除大分子杂质，超滤时温度控制在10～15℃，用注射用水进行顶洗，顶洗量为13L，得到超滤液18.66L；

(5)在万级洁净区，将步骤(4)得到的超滤液加入环氧乙烷，升温到40℃，搅拌，加入药用炭，搅拌，趁热过滤除炭，再用分子截流量为200Da的纳滤膜浓缩至0.6L，温度控制在10～15℃，边浓缩边用注射用水进行顶洗，顶洗量为2.4L，最后得浓缩液0.56L，测定含量为100500mg/L，回收替考拉宁56.28g，收率为88.35％；经解析液经HPLC分析，替考拉宁A2的峰面积为总峰面积的93.8％，纯度为95.2％

(6)将步骤(5)浓缩液经0.22μm过滤器过滤后，进行冻干，预冻温度为-40～-50度，预冻时间3小时，升华时间12小时，升华温度到45℃，高温保温1小时，得替考拉宁成品55.7g，水分为3.1％，经HPLC分析，替考拉宁纯度为95.2％。

Claims (8)

1.一种替考拉宁的纯化方法，该纯化方法包括如下步骤：

(1)调节替考拉宁发酵液至pH9-11后进行过滤；

(2)将步骤(1)得到的滤液调节至pH为6.5-7.5后通过大孔吸附树脂，依次用水、氨水洗脱，收集氨水洗脱液；所述大孔吸附树脂为FX-06；

(3)将步骤(2)得到的洗脱液过滤，滤液通过硅胶层析分离，收集体积比为10-50％乙醇水溶液的洗脱液；通过所述硅胶层析分离的滤液的pH为6.5-7.5；

(4)将步骤(3)得到的洗脱液调节至pH为6.5-7.5后通过截流分子量为10000Da的超滤膜进行超滤，得到超滤液；以及

(5)将步骤(4)得到的超滤液加入环氧乙烷，升温到30-50℃，搅拌，然后通过截流分子量为200Da的纳滤膜进行纳滤，浓缩得到替考拉宁；

所述纯化方法还包括将得到的替考拉宁在-40～-50℃下冻干的步骤；

其中，在所述步骤(3)中，所述洗脱液先进行如下处理，然后再过滤：

向所述洗脱液中加入30％的丙酮，在80摄氏度下反应2个小时，倒入冰水中，盐析出白色沉淀物，然后过滤掉沉淀物。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述过滤为陶瓷膜过滤。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述洗脱液经活性碳脱色后再过滤。

4.根据权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述活性炭脱色的温度为15-20℃。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述超滤温度为10-15℃。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中，所述升温到40℃。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，在步骤(5)中，升温后的超滤液经药用炭脱色，然后再进行纳滤。

8.根据权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述纳滤温度为10-15℃。