CN101205553A - 一种重组灵芝免疫调节蛋白制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法。该方法按以下步骤：构建工程菌，设计编码LZ－8蛋白基因，将其与酿酒酵母α－因子前导肽编码序列相连成为融合基因，将此基因转入毕赤酵母表达系统GS115进行重组表达，获得高效表达rLZ－8蛋白菌株；100L发酵罐规模下的发酵，使用改良种子培养基和发酵培养基，调整甘油、甲醇加入量，发酵后期补加0.5M(NH₄)₂SO₄；经离心分离，上柱纯化，超滤出盐，冷冻干燥制成干粉。该方法发酵规模大，工艺条件优化，产率高。

Description

一种重组灵芝免疫调节蛋白制备方法

技术领域

本发明属于发酵工程领域，具体地涉及重组灵芝免疫调节蛋白制备方法。

背景技术

灵芝免疫调节蛋白(Immunoregulatory Protein of Ganoderma lucidium)，由日本Kino等人1989年从赤灵芝菌丝体提取物中分离和纯化的小分子蛋白质(Kohsuke Kino et al.，J.Boil.Chem.1989，1：472-478)，命名为LZ-8，并测定其氨基酸顺序和免疫生理活性。蛋白质测序表明LZ-8由110个氨基酸残基组成，氨基端乙酰化，分子量为12.4KD，等电点为4.4。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的增生，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子(如白细胞介素，肿瘤坏死因子和干扰素等)，进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康，实现免疫调节功能。

由于野生灵芝资源缺乏，免疫调节蛋白含量低(80mg.kg^-1干重)，直接提取纯化真菌免疫调节蛋白工艺复杂，因此限制了灵芝免疫调节蛋白的大量制备和应用。

专利PCT/CN2004/001044公开了通过构建表达重组灵芝免疫调节蛋白酵母菌方法，并提供了使用50L发酵罐来表达和纯化重组灵芝免疫调节蛋白方法。

发明内容

发明目的：提供一种高效表达重组灵芝免疫调节蛋白的工程菌，提供一种100升规模制备灵芝免疫调节蛋白的发酵工艺和纯化技术，提高产率，克服现有技术存在的生产规模小，产率低的不足。

技术方案：一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法，按以下步骤进行：

(1)构建工程菌：

设计编码LZ-8蛋白基因，将其与酿酒酵母α-因子前导肽编码序列相连成为融合基因，将此基因转入毕赤酵母表达系统GS115进行重组表达，获得高效表达rLZ-8蛋白菌株。

(2)100L发酵罐规模下的发酵：

制种：将冻存菌液涂布于含G418抗性2000μg·ml^-1的YPD平板，激活菌种，挑取一个单克隆放入装有10ml改良BMGY种子培养基的50毫升离心管中，置于恒温摇床250rpm·min^-1，28℃培养18小时；将10ml菌液平分入两个装有1L改良BMGY培养基的10L三角烧瓶，置于恒温摇床250rpm·min^-1，28℃培养18hr。将菌液稀释十倍测吸光值OD_600nm＝1.012，可以用于接种；上罐：将配方为H₃PO₄85％21ml，CaSO₄·2H₂O 6g，K₂SO₄ 96g，MgSO₄·7H₂O 78g，KOH 26g，Glycerol 2L，Peptone 20g的发酵培养基，加入去离子水至40L，经在罐灭菌，冷却后，通过加入氨水，将培养基的pH值调至5.0，接入种液2L；发酵过程中补加生物素Biotin，PTM1微量元素盐；发酵温度28-30℃，转速500-800rpm，通气量0.1-1.0vvm；接种后恒化培养约20h左右，每隔6h取样测菌体湿重和发酵液OD₆₀₀值，待菌体湿重增至120g/L左右时，以120ml/h补入配制好的50％甘油，菌体湿重增至180g/L左右时停止，饥饿胁迫30min。设定初始补料速度为80ml/h，每2h增加50％，至8h结束，并以此流速恒定补料8h后，将流速提至400ml/L，保持此流速30h左右，在10h之内将流速降至80ml/L，保持此流速40h；补加甲醇，自发酵开始每隔一定时间调整甲醇加入量，0-2ml/h/L(0-2h)、2-5ml/h/L(3-8h)、5-10ml/h/L(9-16h)、10ml/h/L(17-47h)、10-2ml/h/L(48-58h)、2ml/h/L(59-103h)；发酵进入48-58h根据菌体湿重大于或小于350g/L减小或加大甲醇补入流量；在发酵后期即诱导开始70h后，以1ml/h/L速率补加0.5M的(NH₄)₂SO₄10h；

(3)纯化：

发酵液用缸式分离机离心3000rpm，将上清用管式分离机16000rpm，利用100000Da超滤膜组件去除菌体，保留透过液，以3000Da膜组件浓缩料液至500ml，上强阳离子交换色谱柱Sp Sepharose XL，流动相A相为HAc-NaAc 50mM pH3.1，B相为HAc-NaAc 50mM 50mMpH3.1，NaCl 1.5M，超滤除盐，冷冻干燥制成干粉。

有益效果：本发明提供目前已知最大规模的灵芝免疫调节蛋白生产方法，达到100升的中试规模，为实现工业化生产提供料有利条件。经过发明人反复实验，采取一系列技术措施，优化了工艺条件：建立了高效表达灵芝免疫调节蛋白菌株；发酵后期，调低甲醇补加速率，避免递增甲醇补加速率所带来的后期发酵液中甲醇过量造成菌体中毒而引起的表达量下降，从而提高产率，同时减少过量甲醇带来的后处理的麻烦、降低生产成本，同时该方法可以控制发酵后期菌体过量增殖，使菌体始终维持在高效表达状态；发酵后期补加硫酸铵，可以明显提高表达量，使产率提高10-15％；上述技术措施使本发明发酵产率达到800mg·L^-1。本发明使用改良的种子培养基，使原有的缓冲系统K₂HPO₄-KH₂PO₄改为Na₂HPO₄-柠檬酸，与原BMGY相比在酸性条件下具有更好的缓冲作用，并且在高压灭菌时不容易出现蛋白质变性而发生的沉淀，与YPD和MGY等已报道的种子培养基，相比营养更丰富，并且由于改良后的BMGY具有稳定的缓冲系统，为菌体生长提供稳定的酸碱环境，避免了菌体代谢产酸带来的不利影响。本发明使用的发酵培养基配方，其离子强度仅为传统基础盐培养基离子强度的20％，使下罐料液的电导率降低，便于超滤浓缩及利用色谱柱纯化产品，虽然其盐浓度略高于FM21培养基，但其可使菌体恒化培养阶段较早的达到对数生长期，缩短恒化培养时间5-6h。本培养基的另外一个特点就是增加了新的组分-蛋白胨(0.5g/L)，其主要作用有以下三个方面：首先，它弥补了盐浓度低所带来的缺点-恒化培养效率差，可在18h内使菌体达到对数生长期，与传统的基础盐培养基一致；其次，蛋白胨富含多种氨基酸可抑制菌体破碎所释放的羧肽酶Y对产品的降解作用；蛋白胨还可使目的蛋白的表达时间提前。

具体实施方式

实施例1：构建工程菌

1.实验材料

Pichia pastoris宿主菌GS115和质粒pPIC9K购自Invitrogen公司，酵母整合型表达载体p819由中国疾病预防控制中心构建。

Yeast Nitrogen Base(without amino acid)、D-Biotin和Casein(Acid hydrolysates)为Sigma公司进口分装试剂，G418为GIBCOBRL公司产品。

2.实验方法和试验结果

2.1α-rLZ-8融合基因的构建

1)根据毕赤酵母遗传密码偏爱性，重新设计编码LZ-8碱基序列，委托上海生工生物技术服务有限公司合成灵芝免疫调节蛋白基因的全序列，合成后的重组质粒命名为pUC57-rLZ-8。重新设计的rLZ-8基因如下：

CTCGAGAAAAGAATGTCTGATACTGCTTTGATCTTCAGATTGGCTTGGGATGTTAAGAAGTTGTCTTTTGATTACACTC

CAAACTGGGGTAGAGGTAACCCAAACAACTTCATTGATACTGTTACTTTTCCTAAGGTTTTGACTGATAAGGCTTACAC

TTACAGAGTTGCTGTTTCTGGTAGAAACTTGGGTGTTAAGCCATCTTACGCTGTTGAATCTGATGGTTCTCAAAAGGTT

AACTTCTTGGAATACAACTCTGGTTACGGTATTGCTGATACTAACACTATTCAAGTTTTCGTTGTTGATCCAGATACTA

ACAACGATTTCATTATCGCTCAATGGAACTAGTAAGAATTC

2)以pUC57-rLZ-8为模板，PrLZ-8-up和PrLZ-8-down为引物，通过PCR得到rLZ-8基因。引物序列如下：

PrLZ-8-up：5’-CCGCTCGAGAAAAGAATGTCTGATACTGCTTTGATCTTC-3’

PrLZ-8-down：5’-ACGAATTCTTACTAGTTCCATTGAGCG-3’

3)以含有酿酒酵母α-因子前导肽编码序列的质粒pPIC9K为模板，利用Pa-up和Pa-down进行PCR扩增，得到α-因子前导肽序列。引物序列如下：

Pa-up：5’-ACTTCGAAACGATGAGATTTCCTTCAATTTTTAC-3’

Pa-down：5’-CCGGTCTTCTCGTAAGTGCCCA-3’

4)把纯化后的上述两种PCR产物分别用限制酶XhoI进行消化，对两种酶切产物进行连接。以连接产物为模板，利用引物Pa-up和LZ-8-down进行PCR扩增，得到可用于分泌表达的融合基因α-rLZ-8。

5)将α-LZ-8基因克隆到pMD18-T载体中，挑选阳性克隆，进行测序。测序结果显示与设计编码序列完全一致。

2.2重组质粒p819-α-LZ-8的构建

测序正确的α-LZ-8融合基因EcoRI和AsuII双酶切，克隆入同样酶切的质粒p819，酶切鉴定。

2.3分泌表达LZ-8的重组毕赤酵母菌的构建

1)转化P.pastoris宿主菌GS115

取20μg限制性内切酶SalI线性化的p819-α-LZ-8质粒DNA，电穿孔法转化P.pastoris宿主菌GS115，转化菌液涂布MD限制性平板。

2)稳定整合转化子的筛选

挑取菌落生长最快的转化子接种到含0.25mg·ml^-1的G418的YPD平板上，编号，30℃培养72小时。挑取转化子接种至含2mg·ml^-1的G418的YPD平板上，30℃培养72小时。

3)表达菌株甲醇利用表型的鉴定

挑取稳定整合转化子，在MM和MD平板上先后划线，30℃培养48小时。在MM平板上不生长或生长缓慢而在MD平板上正常生长的菌株为Mut^s(Mut^s-Methanol utilization slow)表型，在两种平板上都能正常生长的菌株为Mut⁺(Mut⁺-Methanol utilization plus)表型。结果均为Mut⁺表型。

4)α-LZ-8在P.pastoris中的分泌表达

挑取抗2mg·ml^-1G418的菌落，接种含5ml YPD-甘油培养基的15ml试管，30℃培养24-36小时，至菌液OD₆₀₀＞10，5000rpm离心15min，弃上清。重悬菌体于5ml YPD-甲醇培养基，30℃继续培养72小时，每隔24小时按培养液1％的体积补充无水甲醇，每隔12小时取样，离心，SDS-PAGE检测培养液上清中的LZ-8表达量，筛选出表达最高的菌株。试管表达试验表明，开始诱导48小时后，稳定转化子可以高效分泌表达rLZ-8蛋白，取未浓缩的培养基上清10μl进行SDS-PAGE电泳，可见明显的表达条带，表达量超过20mg·L^-1发酵液。

实施例2：100L发酵罐规模下的发酵工艺

发酵中试结果：rLZ-8产量达到800mg·L^-1，约为摇瓶表达量的10倍，菌体湿重为420g·L^-1。具体过程如下：

1.器材及设备

数字显示蠕动泵(7523-47)，发酵罐(BioFlo-5000)，低温离心机(Microfuge R)，低温离心机(Allegra 6R)，恒温摇床(Scientific Allegra 6)，生物安全柜(Scientific Model 1205A)，凝胶分析系统(Biotech)，超低温冰箱，紫外分光光度计(DU7400)，培养箱(Scientific Model 3111)，层析紫外检测系统(REC 112)，3K中空纤维柱，阳离子交换树脂(SP Sepharose XL)，三足式沉降离心机(SSC-600-NG)，管式分离机(GQLB-105)，垂直电泳仪(OYC-40B)，转移电泳仪(DYY-7B)，蠕动泵(313S)，超滤装置(VIVAFLOW).

2.主要试剂和溶液

1)10×磷酸盐缓冲液(pH 6.0)：1mol·L^-1K₂HPO₄(132ml)，1mol·L^-1KH₂PO₄(868ml)。共1L，121℃，15min高压灭菌。

2)分别配制1mol·L^-1Na₂HPO₄，0.5mol·L^-1柠檬酸各300ml，高压灭菌，用于配制不同pH值的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液，来缓冲调节不同pH值的BMGY和BMMY培养基。

3)10×YNB(13.4％Yeast Nitrogen Base)：YNB(不含硫酸铵)(34g)，硫酸铵(100g)，加入去离子水至1L，过滤除菌。

4)10×GY(10％Glycerol)：甘油(100ml)，去离子水(900ml)。共1L，121℃，15min高压灭菌。

5)YPD培养基：蛋白胨(20g)，酵母提取物(10g)，葡萄糖(20g)，加入去离子水1L，高压灭菌。

6)BMGY培养基：蛋白胨(20g)，酵母提取物(10g)。加入去离子水700ml，121℃，15min高压灭菌，而后加入无菌的10×GY，10×YNB各100ml，即配成BMGY培养基，使用时，按所需pH值加入1/10体积的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液。

7)改良BMMY培养基：蛋白胨(20g)，酵母提取物(10g)。加入去离子水795ml，121℃，15min高压灭菌，而后加入无菌的10×YNB 100ml和甲醇5ml，即配成BMMY培养基，使用时，按所需pH值加入1/10体积的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液，即为改良BMMY改良培养基。

8)PTM1微量元素：CuSO₄·5H₂O(6.0g)，NaI(0.08g)，MnSO₄·H₂O(3.0g)，NaMoO₄·2H₂O(0.2g)，H₃BO₃(0.02g)，CoCl₂(0.5g)，ZnCl₂(20.0g)，FeSO₄·7H₂O(65.0g)，H₂SO₄(5.0ml)。加入去离子水至1L，用0.22μm的滤膜过滤除菌。

9)生物素贮备液：生物素(Biotin)20mg用0.01mol·L^-1NaOH溶解后，0.22μm的滤膜过滤除菌。

10)泡敌(消泡剂)

11)溶液A 200mmol·L^-1HAc-NaAc缓冲液(pH3.0)

12)溶液B 20mmol·L^-1HAc-NaAc缓冲液(pH3.0)

13)溶液C溶液B含0.1mol·L^-1NaCl

14)溶液D终浓度为20mmol·L^-1K₂HPO₄，1mol·L^-1NaCl溶液(pH7.0)

15)溶液E 20mmol·L^-1K₂HPO₄溶液(pH8.0)

16)溶液F 20mmol·L^-1K₂HPO₄，20mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液(pH8.0)

17)溶液G 20mmol·L^-1K₂HPO₄，20mmol·L^-1Tris-HCl缓冲液，0.1mol·L^-1NaCl(pH8.0)

3.发酵前准备阶段

3.1调试并标定仪器

标定补甲醇用蠕动泵，使其最高速率达到30ml·h^-1·L^-1，由于预期最高的补料速率为15-18ml·h^-1·L^-1，应使补料速率位于整个补料速率范围的前半段。

根据BioFlo-5000型发酵罐说明书，对pH电极进行维护、调试和标定，使测量的主要范围在3-7之间。以饱和亚硫酸钠溶液对溶氧电极进行调零，标定空气混合器的给气速率。检查罐体灭菌用的蒸汽发生器的气体出口和压力仪表。

3.2制种

种龄应该处于对数生长期的末端，工程菌的生长曲线表明对数生长期的中后段为18-22h，这个时期的菌体生长能力比较强，代谢旺盛，产量高，缩短发酵周期。制种工艺过程大致如下：

1)将冻存菌液涂布于含G418抗性(200μg·ml^-1)的YPD平板，重新激活菌种，用牙签挑取一个单克隆放入装有10ml BMGY培养基的50毫升离心管中，置于恒温摇床(250rpm·min^-1，28℃)培养18小时。

2)将10ml菌液平分入两个装有1L BMGY培养基的10L三角烧瓶，置于恒温摇床(250rpm·min^-1，28℃)培养18hr。将菌液稀释十倍测吸光值OD_600nm＝1.012，可以用于接种。

3.3中试发酵用培养基

毕赤酵母表达系统采用补料连续发酵的技术，采用New Brunswick Scientific公司生产的BioFlo-5000型发酵罐，罐体体积为100L。

发酵初始放入培养基体积为40L，参照毕赤酵母发酵工艺手册上提供的FM21基础盐培养基配成含4％甘油的连续补料发酵培养基。具体配方如下：

FM21发酵培养基：

H₃PO₄85％(21ml)，CaSO₄·2H₂O(6g)，K₂SO₄(96g)，MgSO₄·7H₂O(78g)，KOH(26g)，Glycerol(2L)，Peptone(20g)(在初始恒化培养过程中最大限度的增加菌体湿重，且可以在发酵初始阶段帮助菌体适应发酵培养基)，加入去离子水至40L。

经在罐灭菌，冷却后，通过补料蠕动泵加入氨水，将培养基的pH值调至5.0。而氨水也为菌体生长和代谢提供了除种液含氮成分之外的氮源。生长所需的维生素主要靠发酵过程中补加生物素(Biotin)，发酵时还需要补加PTM1微量元素盐，由于这个盐的混合液高温时会出现沉淀，所以只能通过过滤灭菌，和补料蠕动泵补加。PTM1的具体配方如下：

CuSO₄·5H₂O(6.0g)，NaCI(0.08g)，MnSO₄·H₂O(3.0g)，NaMoO₄·2H₂O(0.2g)，H₃BO₃(0.02g)，CoCl₂(0.5g)，ZnCl₂(20.0g)，FeSO₄·7H₂O(65.0g)，H₂SO₄(5.0ml)，加入去离子水至1L，用0.22μm的滤膜过滤除菌。

补加的甘油和甲醇：

1)每升甘油加12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素，每升初始发酵体积约加入75ml这种配液。

2)每升甲醇加12ml PTM1微量元素的比例在100％甲醇中加入PTM1微量元素，每升初始发酵体积约加入740ml这种配液。

培养基中可以为菌体提供碳源有两个方面，一少部分来自种液中酵母提取物，主要碳源来自培养基本身所含4％的甘油和发酵时补加的甘油和甲醇。而氮源的补充小部分来自种液中的蛋白胨和YNB，主要的氮源来自调节溶液pH值(克服菌体代谢产酸)的氨水。

4.上罐发酵工艺过程

4.1发酵过程的工艺参数

在整个发酵过程中能显示和控制所涉及的各种参数是至关重要的，表1显示了这其中所涉及的6个参数具体范围及其影响因素。

              表1发酵工艺参数变化范围和参考因素

参数	范围	因素
			温度	28-30℃	当罐内温度超过32℃，对毕赤酵母自身的生长代谢有害，从而妨碍了目的蛋白的表达
pH	5.0	培养基的酸碱度会很大程度上影响具体的生长和蛋白表达
			转速	500-800	可以最大化发酵液中的氧气浓度
通气量	0.1-1.0vvm	提高发酵罐内氧气浓度的上限

消泡		过多的气泡有可能会使表达的蛋白质变性，也使发酵罐的空间减少，能补入补料的空间减少
			补加碳源	多个速率	由于罐内的生物量一直在增加，个体酵母的代谢水平也在变化，因此补加碳源要在不同的速率水平上进行

4.2培养基溶氧值的测量与应用

1)毕赤酵母发酵过程与溶氧的关系

溶氧值是表明发酵液中氧浓度的主要相关数值，100％是溶氧的饱和度。毕赤酵母的整个发酵过程对氧气的需要量比较大，而醇氧化酶主导的甲醇代谢机制，也对发酵液中的氧气浓度有一定的要求，一般要维持在20％以上。溶氧电极是溶氧值的测量工具，要求有很高的精确度，在发酵之前，分两次对电极进行了测试和标定。

2)保持发酵液中氧浓度

A.整个发酵过程始终保持发酵罐内的溶氧值(DO)高于20％，氧气的消耗量是由甲醇的补加量和蛋白质的表达速率决定的。

B.提高空气混合器输送气体中氧气的比例，参数值在发酵的初始阶段定在3.0，如果输送纯氧也不能保持住溶氧值，就得加大氧气输送率。

C.当甲醇的添加量过高或者代谢率低时出现溶氧值快速降低，以上的方法均不能提高溶氧值时，只有降低甲醇的补加速率(见表2)。

            表2溶氧值在发酵过程中出现的各种情况和解决方法

溶氧值(DO)	原因	解决方案
			DO＞50％	①发酵液中碳源比较少②氧气通入量过高，但是这种原因引起的DO值升高出现的时间不会很长，随着罐内生物量的增加而得到解决	①补入甘油或者甲醇②调节空气混合器的各种参数
20％＜DO＜50％	溶氧值保持在这样的数值，而且比较稳定	每6个小时调节一次所有的参数使之保持这个数值
			DO＜20％	①甘油或甲醇的补加速率过高②氧气的通入量不够，也可能是转子的转动速率不够，使发酵液中不能溶解更多的氧气	如果能通过补加氧气和加快转子速度使溶氧稳定在一个良好的数值，就不降低碳源的补加速率。

4.3接种菌株的生长

在这段时期主要以增加生物量为主，耗尽培养基中的碳源，不补加任何补料，维持液体培养环境的稳定性，同时也是种液中的菌体适应新培养基的阶段，具体操作如下：

1)在罐灭菌并冷却，设置以下参数：温度(30℃)，转速为(500rpm)，气体通入速率1.0vvm，即空气混合器的参数为3.0。

2)补入氨水将培养基的pH值调节到5.0，加入174ml经灭菌的PTM1。

3)接入种液2L，为整个发酵初始体积的5％，此时溶氧值很高，到这段时期的中期溶氧值会快速下降，要通过调节氧气输入比例来调节使之达到稳定。

4)以接种为发酵过程的0h，在19h的时间点，DO值出现了迅速升高，21h时达到100％，此时，发酵液中的碳源全部代谢完毕，氧没有进入代谢滞留在发酵液中。

5)从接种开始每6小时取样一次，检测样品湿重，保留发酵液离心后上清。到21h时，湿重达到130-150g/L。

4.4通过补加甘油大量扩增罐内的生物量

由于罐内的生物量不能达到诱导表达的要求，因此要继续补加甘油为菌体的生长补充碳源。按照每升甘油加12ml PTM1微量元素的比例在高压灭菌后的50％甘油中加入PTM1微量元素，混匀后，以120ml·h^-1的速率加入到发酵罐中，至菌体湿重达180g·L^-1，继续补加甘油后，观测DO值上升至接近100％后，继续以0.02ml·h^-1·L^-1补加甘油，DO始终保持在一个非常高的水平，维持“甘油半饥饿”状态30min，转入甲醇诱导表达阶段。DO值上升过程比较迅速，证明菌体代谢非常旺盛，对碳源的利用率很高。

4.5补加甲醇诱导表达rLZ-8

设定初始补料速度为80ml/h，每2h增加50％，至8h结束，并以此流速恒定补料8h后，将流速提至400ml/L，保持此流速30h左右，在10h之内将流速降至80ml/L，保持此流速40h；补加甲醇，自发酵开始每隔一定时间调整甲醇加入量，0-2ml/h/L(0-2h)、2-5ml/h/L(3-8h)、5-10ml/h/L(9-16h)、10ml/h/L(17-47h)、10-2ml/h/L(48-58h)、2ml/h/L(59-103h)；发酵进入48-58h根据菌体湿重大于或小于350g/L减小或加大甲醇补入流量；在发酵后期即诱导开始70h后，以1ml/h/L速率补加0.5M的(NH₄)₂SO₄10h；

4.6发酵中试实验结果

1)溶氧对rLZ-8发酵表达产量的影响

氧的供应是发酵的重要限制因素之一，发酵阶段溶氧值要保持在20％以上。在转速800r·min^-1，通入空气的流量为2vvm，纯氧浓度为30-70％(v/v)，罐内压力为10psi，可使溶氧上升，通过调节以上参数可保持溶解氧稳定在20％以上。

溶氧值也在很大程度上控制了发酵液中的甘油含量，甘油在进入发酵液的同时必须被立刻耗尽，否则会抑制醇氧化酶基因的表达。利用HPLC对诱导表达开始后所用取样的上清进行检测，均没有发现甘油的吸收峰。

2)温度对rLZ-8发酵表达产量的影响

毕赤酵母的最佳生长温度为28-30℃。温度升高达到32℃对毕赤酵母是致命的，有时降低发酵温度可增加目的蛋白产量。有报道在甲醇诱导阶段，温度从30℃降至25℃，可使克隆在巴氏毕赤酵母中的半乳糖氧化酶的产量增加4倍。本发明用28℃～30℃进行发酵取得很好的效果。

5.rLZ-8的粗分离和精细纯化的工艺路线

下罐得73L发酵液，通过缸式分离机离心(3000rpm)，保留液体，弃去缸内酵母菌，将上清以管式分离机离心(16000rpm)，保留淡绿色清液，利用100000Da超滤膜组件去除菌体，保留透过液，以3000Da膜组件浓缩料液至500ml，再通过强阳离子交换层析柱进行分离，超滤除盐，冷冻干燥制成干粉。

分离条件：填料为SP Sepharose XL，柱体积为10L，将40L样品用醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM)稀释至120L，将pH值调至3.1，保留每次上样的穿透液，反复上样3次，与最后一次上样完毕，将柱体下段出口的流速调至20ml/min，静置10小时，已含有1.5M NaCl的醋酸-醋酸钠缓冲液(50mM)，进行洗脱，流速80ml/min，峰收集。

实施例3：纯化工艺

根据rLZ-8自身的特点设计纯化工艺，主要流程如下：

发酵液分离机离心(3000rpm)→将上清用管式分离机(16000rpm)→超滤(留30000-5000Da)→阴离子交换纯化柱(Q Sepharose Fast Flow)→疏水作用纯化柱(PhenylSepharose 6 Fast Flow)→超滤除盐→高效液相(凝胶色谱)制备目的蛋白。

1.离子交换色谱

利用色谱柱Q sepharose HP(1ml)进行色谱条件的摸索，找出纯化用最佳pH值。流动相A相：A1液为0.07M Bis-Tris和0.05M Tris，A2液为0.1M HCl。缓冲液有效缓冲范围为pH＝6.0-9.0。流动相B相：B1为纯水，B2为2M NaCl溶液。仪器自动调节缓冲液pH值，在pH 6.0-9.0之间以0.5(pH)为单位逐一进行摸索，找出最佳纯化条件，按照最佳pH值相应的范围更换缓冲液。

经实验摸索目的蛋白与固相结合的最佳pH值为7.5，更换缓冲液，流动相A相为Bis-Tris-HCl(50mM)(pH7.5)，B相为Bis-Tris-HCl(50mM)(pH7.5)，NaCl(1M)。大量分离纯化需更换色谱柱为Q Sepharose HP 35/100，流动相A相平衡柱体5倍柱体积，取冻干所得的样品30mg，溶于Bis-Tris-HCl(50mM)(pH7.5)3ml中，经过滤(0.45μm微孔滤器)上样，并洗去2倍柱体积不结合的样品，B相线性洗脱(0-100％)10倍柱体积，流速15ml/min，峰收集，柱保护压1.0MPa。

2.疏水作用色谱

流动相A相：20mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)，1.5M(NH₄)₂SO₄(降低了杂质分子的疏水性，同时节省硫酸铵。)，流动相B相：20mM磷酸钠缓冲液，流动相A相平衡柱体5倍柱体积(53ml)以B相线性梯度(100％-0)洗脱10个柱体积，流速6ml/min，柱保护压0.8MPa。

利用目的蛋白和杂质之间与固相相互作用程度的差异，对目的蛋白进行分离纯化。收集2.1.1中rLZ-8峰，利用聚乙二醇20000反透析浓缩样品，上样2ml。分别于215nm，254nm，280nm三波长检测，215nm下吸收较强。

3.凝胶色谱

50mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)，150mM NaCl，固定体积收集(1ml)，平衡2倍柱体积(120ml)，上样并以单一浓度洗脱1.5倍柱体积，流速1ml/min，柱保护压0.5Mpa。

将收集到的样品透析并浓缩，上样1ml，峰收集，流速1ml/min。约在洗脱时间67min时，出现rLZ-8相应的吸收峰，重现性好，将收集到的样品透析并冻干。

4.rLZ-8纯度鉴定及分子量测定

4.1利用反相液相层析鉴定产物纯度

利用反相液相色谱对分离纯化的产物进行纯度分析，将2.1.3中得到的冻干样品3mg溶于1ml纯水，取10μl上样。流动相A相：0.055％TFA，ddH₂O。流动相B相：0.055％TFA，乙腈(色谱纯)。平衡10倍柱体积(1.662ml)，上样并以B相线性洗脱(0-100％)20倍柱体积，流速1ml/min，柱保护压18MPa。

rLZ-8纯度为＞99％

4.2利用激光飞行质谱鉴定重组表达的rLZ-8分子量

激光飞行质谱鉴定重组表达的rLZ-8分子量为12722，与软件理论计算结果基本一致。

4.3利用悬滴气相扩散法获得单晶并检测其氨基酸序列

悬滴气相扩散法获得的单晶在MarResearch 345dtd像板衍射数据收集系统收集了一套晶体衍射数据，检测其氨基酸序列为：

MSDTALIFRLAWDVKKLSFDYTPNWGRGNPNNFIDTVTFPKVLTDKAYTYRVAVSGRNLG

VKPSYAVESDGSQKVNFLEYNSGYGIADTNTIQVFVVDPDTNNDFIIAQWN

                           序列表

                           序列表

Claims (1)

1.一种重组灵芝免疫调节蛋白的制备方法，按以下步骤进行：

(1)构建工程菌：

设计编码LZ-8蛋白基因，将其与酿酒酵母α-因子前导肽编码序列相连成为融合基因，将此基因转入毕赤酵母表达系统GS115进行重组表达，获得高效表达rLZ-8蛋白菌株；

(2)100L发酵罐规模下的发酵：

制种：将冻存菌液涂布于含G418抗性2000μg·ml^-1的YPD平板，激活菌种，挑取一个单克隆放入装有10ml改良BMGY种子培养基的50毫升离心管中，置于恒温摇床250rpm·min^-1，28℃培养18小时；将10ml菌液平分入两个装有1L改良的BMGY培养基的10L三角烧瓶，置于恒温摇床250rpm·min^-1，28℃培养18hr。将菌液稀释十倍测吸光值OD_600nm＝1.012，可以用于接种；上罐：将配方为H₃PO₄85％21ml，CaSO₄·2H₂O 6g，K₂SO₄96g，MgSO₄·7H₂O 78g，KOH 26g，Glycerol 2L，Peptone 20g的发酵培养基，加入去离子水至40L，经在罐灭菌，冷却后，通过加入氨水，将培养基的pH值调至5.0，接入种液2L；发酵过程中补加生物素Biotin，PTM1微量元素盐；发酵温度28-30℃，转速500-800rpm，通气量0.1-1.0vvm；接种后恒化培养约20h左右，每隔6h取样测菌体湿重和发酵液OD₆₀₀值，待菌体湿重增至120g/L左右时，以120ml/h补入配制好的50％甘油，菌体湿重增至180g/L左右时停止，饥饿胁迫30min。设定初始补料速度为80ml/h，每2h增加50％，至8h结束，并以此流速恒定补料8h后，将流速提至400ml/L，保持此流速30h左右，在10h之内将流速降至80ml/L，保持此流速40h；补加甲醇，自发酵开始每隔一定时间调整甲醇加入量，0-2ml/h/L(0-2h)、2-5ml/h/L(3-8h)、5-10ml/h/L(9-16h)、10ml/h/L(17-47h)、10-2ml/h/L(48-58h)、2ml/h/L(59-103h)；发酵进入48-58h根据菌体湿重大于或小于350g/L减小或加大甲醇补入流量；在发酵后期即诱导开始70h后，以1ml/h/L速率补加0.5M的(NH₄)₂SO₄10h；

(3)纯化：

发酵液用缸式分离机离心3000rpm，将上清用管式分离机16000rpm，利用100000Da超滤膜组件去除菌体，保留透过液，以3000Da膜组件浓缩料液至500ml，上强阳离子交换色谱柱Sp Sepharose XL，流动相A相为HAc-NaAc 50mM pH3.1，B相为HAc-NaAc 50mM 50mMpH3.1，NaCl 1.5M，超滤除盐，冷冻干燥制成干粉。