CN104069481B - 重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在调节血脂中脂蛋白含量的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组灵芝免疫调节蛋白(rLZ-8)在调节组织中脂蛋白含量的应用，通过动物模型实验证明，rLZ-8具有调节动物的高密度脂蛋白胆固醇与低密度脂蛋白胆固醇含量的作用，可以清除蓄积于末梢组织的游离胆固醇，缓解动脉粥样进程及血管中斑块生成。

Description

重组灵芝免疫调节蛋白（rLZ-8）在调节血脂中脂蛋白含量的应用

技术领域

本发明涉及的重组灵芝免疫调节蛋白是由基因重组技术，以巴斯德毕赤酵母为表达载体，深度发酵表达的重组灵芝免疫调节蛋白在调节血脂中脂蛋白含量的应用，重点涉及重组灵芝免疫调节蛋白能够有效升高高密度脂蛋白胆固醇含量及有效降低低密度脂蛋白含量，属于生物医药工程领域。

背景技术

高密度脂蛋白胆固醇（Highdensitylipoprotein-cholesterol，HDL-C），主要是由肝脏和小肠合成。它是由载脂蛋白、磷脂、胆固醇和少量脂肪酸组成。HDL-C主要功能为，将蓄积于末梢组织的游离胆固醇与血液循环中脂蛋白或与某些大分子结合而运送到各组织细胞，近来，众多的科学研究证明，由于HDL-C颗粒较小，结构致密，能自由进出动脉壁，可以摄取血管壁内膜底层沉浸下来的低密度脂蛋白、胆固醇、甘油三酯等有害物质，且不向组织释放胆固醇，具有将组织中胆固醇转移出来的功能，所以它被认为是抗动脉粥样硬化的保护因子，因此，高密度脂蛋白具有“抗动脉粥样硬化性脂蛋白”的美称。具有明确的抗动脉粥样硬化的作用，可以将动脉粥样硬化血管壁内的胆固醇“吸出”，并运输到肝脏进行代谢清除。上述过程实际上是胆固醇逆转(RCT)，RCT促进组织细胞内胆固醇的清除，维持细胞内胆固醇量的相对衡定，HDL-C运载周围组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出，动脉造影证明高密度脂蛋白胆固醇含量与动脉管腔狭窄程度呈显著的负相关。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子，俗称“血管清道夫”。从而限制动脉粥样硬化的发生发展，起到抗动脉粥样硬化作用。

低密度脂蛋白胆固醇（Lowdensitylipoprotein-cholesterol，LDL-C）：一种密度较低(1.019～1.063g/cm3)的血浆脂蛋白，约含25%蛋白质与49%胆固醇及胆固醇酯。其胆固醇主要来自从CE转运的高密度脂蛋白中的胆固醇，低密度脂蛋白是富含胆固醇的脂蛋白，主要作用是将胆固醇运送到外周血液，是动脉粥样硬化的危险因素之一，被认为是动脉粥样硬化的诱因。如果血液中低密度脂蛋白胆固醇浓度升高，它将沉积于心脑等部位血管的动脉壁内，逐渐形成动脉粥样硬化性斑块，阻塞相应的血管，LDL-C水平如果超出正常范围时就会使心脏的危险性增加。因此LDL-C常被称为是“坏”胆固醇，降低LDL-C水平，则预示可以降低冠心病的危险。

动脉粥样硬化是冠心病，心绞痛，心肌梗死，脑中风，周围血管性疾病等心血管疾病的根源，严重威胁人类健康。动脉粥样硬化的病程较长，从早期到晚期可长达30年之久，是慢性经过疾病，动脉的主要病理改变是弹性减弱，硬度脆性增加，官腔变窄到晚期的闭塞停滞血供，进而形成最严重的动脉瘤。

动脉粥样硬化的四个主要病理过程为：（1）低密度脂蛋白在易损区域动脉内皮下间质沉积。（2）单核巨噬细胞粘附于内皮细胞表面。（3）巨噬细胞进入内膜层增殖，并吞噬氧化性LDL-C转化成泡沫细胞。（4）泡沫细胞死亡并释放出脂质，形成坏死中心。（5）平滑肌细胞迁移、增生聚集，并分泌纤维样物质，使形成的斑块增大。

本发明中所使用的重组灵芝免疫调节蛋白(recombinantGanodermalucidumimmunoregulatoryprotein，rLZ-8)，是应用基因工程方法得到的具有高纯度和稳定生物活性的rLZ-8样品。灵芝免疫调节蛋白的主要功能在于它可以促进末梢淋巴细胞和脾脏细胞的生物活性，诱导动物和人体的巨噬细胞分泌多种细胞因子进而防御及消除病原体的侵害，维护机体的健康。

发明内容

本发明重点提供重组灵芝免疫调节蛋白在调节血脂中脂蛋白含量的应用，本发明目的之一是提供重组灵芝免疫调节蛋白的一种新用途，即在调节组织中脂蛋白含量以及治疗动脉粥样硬化的应用。

本发明所述的重组灵芝免疫调节蛋白是使用巴斯德毕赤酵母表达的重组灵芝免疫调节蛋白，不论是从何种途径提取或得到的灵芝免疫调节蛋白，其主要成分相同，基本结构相同，都具有相同的药理功效，即都可以用于调节组织中脂蛋白含量以及治疗动脉粥样硬化。

具体发明内容如下：本发明采用雄性Wistar大鼠(体重230±20g)建立了高脂蛋白模型，共72只，随机分为6组，每组12只；实验分组：正常对照组，模型对照组，rLZ-8低剂量组、rLZ-8中剂量组、rLZ-8高剂量组，辛伐他汀组（SV，1.8mg/kg）。动物分笼饲养，自由饮水，正常组喂饲正常饲料，模型组、rLZ-8各给药组以及辛伐他汀组喂食高脂饲料，造模时间为6周。每日观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、及死亡情况。

给药程序：设计合理的给药程序，正常组和模型对照组腹腔注射等体积的生理盐水，药物rLZ-8治疗组采用腹腔注射给药，rLZ-8低、中、高剂量分别为5μg/kg/d、10μg/kg/d、50μg/kg/d；给药六周。同时，每日观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、及死亡情况。本发明通过对大鼠体重肝重、血脂含量、血清抗氧化指标、主动脉组织学观察等方面参数的检测，考察和评价rLZ-8对大鼠高脂模型的治疗作用和效果，结果表明，rLZ-8在治疗大鼠高脂模型及动脉粥样硬化中具有显著的效果。具体实验结果如下：（1）大鼠体重肝重方面：除高脂模型组以外，其他各组大鼠的体重及肝重都显著低于正常对照组（p＜0.05）；（2）血脂含量：rLZ-8低剂量组的LDL-C高于正常对照组，但同时显著低于高脂模型组（p<0.05）。rLZ-8中、高剂量组的HDL-C和LDL-C显著高于正常对照组（p<0.05），但与高脂模型组比较显著低于高脂模型组（p<0.05）；与阳性药组比较，在高密度脂蛋白方面rLZ-8明显优于阳性对照组，在低密度脂蛋白方面二者处于同一治疗水平，说明了rLZ-8能够有效降低血清中低密度脂蛋白的含量的同时升高高密度脂蛋白的含量；（3）血清抗氧化指标：与正常组相比，高脂模型组的MDA显著上升(p<0.05)、CAT和GSH-PX显著降低（p<0.05），提示高脂模型组大鼠抗氧化能力下降，脂质过氧化物生成增多。与高脂模型组相比，rLZ-8低剂量组和高剂量组的SOD、CAT和GSH-PX显著升高（p<0.05），MDA显著下降（p<0.05），且与正常对照组相当，提示低剂量组和高剂量的rLZ-8可以提高大鼠的抗氧化能力；而rLZ-8中剂量组则没有得到类似结果；（4）主动脉组织学：正常对照组：血管膜结构完整，层次清晰，内膜内皮细胞连续完整，排列整齐，中膜平滑肌细胞排列规整，无增生，内膜及中膜均未见泡沫细胞及脂质沉积；高脂对照组：主动脉平滑肌细胞排列紊乱，内膜明显增厚，内含大量泡沫细胞，内弹力膜断裂、模糊，内膜与中膜之间有长梭型斑块；rLZ-8各治疗组：组织病变程度有所减轻，平滑肌排列较为整齐，主动脉壁各层次较清晰，中层平滑肌细胞厚度基本正常，泡沫细胞较少。

本发明有益效果在于：rLZ-8低剂量可以在一定程度上延缓动脉粥样硬化的发生发展，可以提高机体的抗氧化水平，舒张血管，降低血脂，为动脉粥样硬化的治疗提供了依据。

附图说明

图1正常对照组血管组织的HE染色（╳200）

图2高脂模型组血管组织的HE染色（╳200）

图3辛伐他汀组血管组织的HE染色（╳200）

图4rLZ-8低剂量组血管组织的HE染色（╳200）

图5rLZ-8中剂量组血管组织的HE染色（╳200）

图6rLZ-8高剂量组血管组织的HE染色（╳200）

具体实施方式

实施例1rLZ-8对大鼠血酯蛋白水平与生化指标的影响

1.实验材料与试剂

雄性Wistar大鼠，体重230±20g，由吉林大学白求恩医学部动物部提供。高脂饲料（基础饲料，3.5%胆固醇，10%猪油，0.2%丙基硫氧嘧啶，0.5%胆酸钠，5%白糖）辛伐他汀，乙醚，10%甲醛，生理盐水，3%戊巴比妥钠，全自动生化仪，高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。

2.实验方法

动脉粥样硬化模型建立:动物分笼饲养，自由饮水，正常组喂饲正常饲料，模型组、给药组及阳性组喂饲高脂饲料，造模时间为六周。每日观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、及死亡情况。

实验动物分组与给药方法:雄性Wistar大鼠(体重230±20g)，72只，随机分为6组，每组12只；实验分为包括正常对照组，模型组，药物rLZ-8低剂量组（5μg/kg/d）、rLZ-8中剂量组（10μg/kg/d）、rLZ-8高剂量组（50μg/kg/d），辛伐他汀组（SV，1.8mg/kg）在内的6个实验组。

给药方法与程序为：腹腔注射给药，每天给药2次，连续给药6周，各治疗组按照设计的给药剂量给予腹腔注射给药，其中正常组和模型对照组腹腔注射等体积的生理盐水。

检测项目：每日观察大鼠的食欲、体重、行为、状态、及死亡情况。甘油三脂(Triglyceride，TG)、总胆固醇(Totalcholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及生化指标。

检测方法：采用全自动生化分析仪测定血清中甘油三脂、总胆固醇；采用磷钨酸-镁沉淀法测定高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量。

3.实验结果

3.1rLZ-8对大鼠血脂水平的影响

高脂模型组血清中的TG、TC和LDL-C显著高于正常对照组（p<0.05）。rLZ-8低剂量组的TG、TC和HDL-C与正常对照组相比，无显著差异；rLZ-8低剂量组的LDL-C显著高于正常对照组，但同时也显著低于高脂模型组（p<0.05）。rLZ-8中、高剂量组的TG与正常对照组没有显著性差异，但是TC、HDL-C还是显著高于正常对照组（p<0.05），而LDL-C的含量显著低于模型组的同时也低于辛伐他汀组的LDL-C的含量，说明在调节血脂中HDL-C与LDL-C的含量rLZ-8具有明显的治疗优势（表1）。

表1rLZ-8对大鼠血脂水平的影响(单位：mmol/L)(x±s)

其中，a:与正常组相比，p<0.05；b:与高脂模型组相比，p<0.05。

实施例2rLZ-8对大鼠动脉粥样硬化模型的治疗作用

1.实验材料与试剂

雄性Wistar大鼠,体重230±20g，由吉林大学白求恩医学部动物部提供。超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase，SOD)、丙二醛(MalonaldehydeMDA)、一氧化氮合成酶（NOS）、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathioneperoxidase，GSH-PX)的ELISA试剂盒均自R&D公司提供。高脂饲料（基础饲料，3.5%胆固醇，10%猪油，0.2%丙基硫氧嘧啶，0.5%胆酸钠，5%白糖）辛伐他汀，乙醚，10%甲醛，生理盐水，3%戊巴比妥钠，天平，光学显微镜。

2.实验方法

动脉粥样硬化模型建立:同实施例1。

实验动物分组与给药方法:同实施例1。

给药方法与程序为：同实施例1。

检测方法：采用ELISA法检测血清SOD、MDA、CAT、GSH-PX含量；采用市售试剂盒检测NO合成酶限速酶含量；HE染色大鼠动脉粥样硬化模型主动脉组织细胞，对其进行形态学观察，考察rLZ-8对大鼠动脉粥样硬化模型主动脉组织细胞形态的影响。

3.实验结果

3.1rLZ-8对模型大鼠血清抗氧化指标（SOD、MDA、CAT、GSH-PX）的影响

与正常组相比，高脂模型组的MDA显著上升(p<0.05)、CAT和GSH-PX显著降低（p<0.05），提示高脂模型组大鼠抗氧化能力下降，脂质过氧化物生成增多。与高脂模型组相比，rLZ-8低剂量组和高剂量组的SOD、CAT和GSH-PX显著升高（p<0.05），MDA显著下降（p<0.05），且与正常对照组相当，提示低剂量组和高剂量的rLZ-8可以提高大鼠的抗氧化能力；而rLZ-8中剂量组则没有得到类似结果（表2）。

表2rLZ-8对大鼠血清SOD、MDA，CAT和GSH-PX的影响(x±s)

其中，a:与正常组相比，p<0.05；b:与高脂模型组相比，p<0.05。

3.2rLZ-8对模型大鼠血清和主动脉NOS分泌水平的影响

NOS是NO合成酶限速酶，NO具有扩血管的作用。与正常对照组相比，高脂模型组血清和主动脉组织中的NOS都显著下降（p<0.05）。rLZ-8低剂量组血清和主动脉组织中的NOS显著高于高脂模型组（p<0.05），与正常对照组无显著性差异。与高脂模型组相比，rLZ-8中、高剂量组的血清NOS显著上升（p<0.05），但主动脉组织中的NOS无显著差异。结果提示：低剂量的rLZ-8具有扩血管作用（表3）。

表3rLZ-8对大鼠NOS的影响(x±s)

其中，a:与正常组相比，p<0.05，b:与高脂模型组相比，p<0.05。

3.3主动脉形态学观察

正常对照组：血管膜结构完整，层次清晰，内膜内皮细胞连续完整，排列整齐，中膜平滑肌细胞排列规整，无增生，内膜及中膜均未见泡沫细胞及脂质沉积（见图1）；

高脂对照组：主动脉平滑肌细胞排列紊乱，内膜明显增厚，内含大量泡沫细胞，内弹力膜断裂、模糊，内膜与中膜之间有长梭型斑块（见图2）；

rLZ-8各剂量治疗组：组织病变程度有所减轻，平滑肌排列较为整齐，主动脉壁各层次较清晰，中层平滑肌细胞厚度基本正常，泡沫细胞较少（见图4-6）。

Claims (5)

1.重组灵芝免疫调节蛋白rLZ-8在制备调节血脂中脂蛋白含量的药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于该调节脂蛋白含量是用于预防和治疗由脂蛋白含量失调所引发的血管类疾病。

3.如权利要求2所述应用，其特征在于所述的血管类疾病为高血压、高血脂和动脉粥样硬化。

4.如权利要求1所述应用，其特征在于所述药物制剂为注射剂、冻干粉针剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液、散剂、颗粒剂、贴片或膏剂。

5.如权利要求1所述应用，其特征在于所述药物给药途径为口服或非肠道给药，口服给药包括口服液、片剂、丸剂和胶囊；非肠道给药包括外用药和注射剂。