CN102370671A - 灵芝子实体中的有效部位、提取方法及其用途和制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了灵芝子实体中的有效部位、提取方法及其用途和制剂。该有效部位对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下,具有显著降血糖功效。
Description
技术领域
本发明属于药品或保健品领域,具体涉及灵芝子实体中的降糖有效部位,从灵芝子实体中提取该有效部位的方法及其用途。
背景技术
灵芝[Ganoderma lucidum (Fr.)Karst]为担子菌纲灵芝属真菌,自古就有“仙草”、“瑞草”之称,是中医扶正固本、滋补强壮的珍贵中药,在我国有悠久的药用历史,药用价值极高,被视为珍贵的中药材,是中医药宝库中的珍品。东汉《神农本草经》将灵芝列为上品,认为能“益心气”、“安精魂”、“补肝益气”、“坚筋骨”。《本草纲目》认为灵芝有“滋补强壮”、“延年益寿”、“利关节”、“治耳聋”等功效。现代医学证明:灵芝含有多种生理活性物质,能够调节和增强人体免疫力,降血压、降血糖、降血脂。
在灵芝提取物的研究领域,近年来,国内外学者已从灵芝中分离出150余种化合物,分为10大类:三萜类、多糖类、核苷类、呋喃类、甾醇类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、油脂类、有机锗、无机离子等。其中小分子三萜类和大分子多糖类为主要组份,并作为主要的药理学研究对象。其药理作用多涉及生物免疫调节、预防及治疗肿瘤疾病、提高机体耐缺氧能力,消除自由基能力等。
糖尿病(diabetes mellitus)是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症,因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低,引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床以高血糖为主要共同标志,久病可引起多个系统损害,病情严重和应激时可发生急性代谢紊乱如酮症酸中毒等。在糖尿病人中发生冠心病、脑血管疾病、失明、肢端坏疽等严重并发症均明显高于非糖尿病人群。因此,糖尿病及其并发症已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。
目前一般将糖尿病分为两类,I 型糖尿病(胰岛素依赖型糖尿病,IDDM)与II型糖尿病(非胰岛素依赖型糖尿病,NIDDM)。糖尿病中90%以上是II型糖尿病。WHO预计,由于人口老龄化、肥胖、不健康的饮食以及缺乏运动的生活方式,到2025年,糖尿病患者的数目将由1995年的1.35亿上升为3亿。
II型糖尿病也有很强的遗传性和环境因素,并呈显著的异质性,发病机制多样而复杂,各病人间存在较大差异。总的来说可概括为胰岛素分泌的相对不足和胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是指机体对胰岛素的敏感性和(或)反应性降低,是糖尿病等代谢综合症主要的病理生理基础。胰岛素抵抗与糖耐量降低、II型糖尿病、肥胖症、血脂紊乱、非酒精性脂肪肝、冠心病等临床异常密切相关。胰岛素通过与其受体胞外α亚单位结合激活受体胞内β亚单位内在的酪氨酸激酶活性,导致调节结构域中关键的酪氨酸残基自身磷酸化,从而完全激活胰岛素受体酪氨酸激酶活性,胰岛素受体酪氨酸激酶再通过磷酸化其底物将信号传递下去。随着对细胞内胰岛素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化认识的加深,蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPases)在平衡该通路中相关蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越来越受到重视。PTPases可能作用于该通路中多个环节,例如将自身磷酸化活化的胰岛素受体(IR)去磷酸化,从而降低受体激酶活性;或将诸如胰岛素受体底物1(IRS-1)、胰岛素受体底物2(IRS-2)、Shc等胰岛素受体的底物中蛋白酪氨酸残基去磷酸化,从而负调控胰岛素作用受体后通路。
蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)是最早被纯化和确定生物学特性的PTPase,全长大约50KD。早期研究证明其能在体外有效地将胰岛素受体去磷酸化。将源于人胎盘的PTP1B显微注射入非洲蟾蜍卵母细胞中发现,其减少了胰岛素诱导的卵母细胞成熟及S6肽磷酸化水平。PTP1B与糖尿病的发生有重要关系,运用同源重组方法产生的PTP1B基因敲除小鼠生长正常,有生殖力,对胰岛素敏感性显著增强,而且这一增强作用与肝脏和骨骼肌中胰岛素受体及胰岛素受体底物磷酸化水平的增强相关。因此,通过寻找选择性作用于该通路中PTP1B的抑制剂抑制其活性,加强和延长胰岛素信号,成为越来越受重视的治疗II型糖尿病的新途径。
此外流行病学的研究还表明,空腹血糖水平与餐后血糖水平这两大血糖指标中,餐后血糖水平尤为重要,它是葡萄糖耐受受损(IGT)的病人发展为II型糖尿病的重要因素。而且,餐后血糖水平是引起糖尿病病人大血管并发症和微血管并发症的重要因素,而这些并发症是引起糖尿病死亡率增大的一个主要原因。所以,严格控制餐后血糖对糖尿病的防治具有非常重要的意义,而能够显著降低餐后血糖水平的抗糖尿病药物具有很大的应用价值。
食物中的绝大多数碳水化合物为淀粉和蔗糖等,淀粉先后经唾液及胰液中α-淀粉酶分解为寡糖,寡糖在小肠上皮细胞刷状缘处被α-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖而被吸收后,导致餐后血糖高峰,因此,抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性成为降低餐后血糖的一个有效途径。
与膳食一起进食后,α-淀粉酶抑制剂可与淀粉竞争而与唾液和胰液中的α-淀粉酶结合,占据酶上淀粉结合位点,使淀粉的消化受阻。未被消化的碳水化合物被运送至小肠中下段及结肠,从而使碳水化合物的消化吸收发生在整段小肠中,延缓和延长了餐后单糖(葡萄糖)的吸收,餐后血糖水平被显著减小。α-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发出的一类新型口服降血糖药物,已三次被亚太地区糖尿病治疗药物指南推荐为降餐后血糖的一线药物。α-葡萄糖苷酶抑制剂可竞争性地抑制α-葡萄糖苷酶,延缓和阻碍碳水化合物的消化,延迟来自双糖、低聚糖及多糖的葡萄糖吸收,有效推迟并减轻餐后血糖升高的时间及程度,长期服用可以降低空腹血糖水平,此类药物对I、II型糖尿病均适用。
目前,临床上治疗糖尿病常用的口服药物以磺酰脲类(D860、优降糖、达美康、美必达、糖适平、糖肾平等)、双胍类(苯乙双胍、二甲双胍等)、α-葡糖苷酶抑制剂(拜糖平)和胰岛素增敏剂(噻唑烷二酮类)等西药为主。这些药物长期使用或效果不佳,或有较严重的副作用,对肝肾都会造成一定损害,还会引起低血糖反应的发生,甚至危及生命。胰岛素是治疗糖尿病的特效药物,但胰岛素久用会产生抗体,导致生物活性降低,只能不断增大胰岛素用量。而中医药从辨病辨证论治的角度出发,根据II型糖尿病的病症特点,从整体水平上加以综合调理,可以使II型糖尿病症状减轻并延缓糖尿病并发症的出现。因此,从天然药物中筛选和研究降糖药具有重要的社会意义及应用价值。
灵芝甘平,入五脏补益全身五脏之气,可扶正固本。脾乃生痰之器,灵芝入脾补中健土,利于祛痰化湿,符合胰岛素抵抗的中医治疗原则。但有关灵芝提取物及其药效特别是降血糖效果的研究尚不充分,至今未见文献报道从灵芝子实体中提取的具有显著的降血糖作用的有效部位。
发明内容
在发明内容部分引入了一系列简化形式的概念,这将在具体实施方式部分中进一步详细说明。本发明的发明内容部分并不意味着要试图限定所要求保护的技术方案的关键特征和必要技术特征,更不意味着试图确定所要求保护的技术方案的保护范围。
本发明的一个目的在于提供一种从灵芝子实体中提取有效部位(此有效部位未见报道,由发明人首次命名为FYGL)的方法。该方法有选择地从灵芝子实体中提取了特定的有效部位FYGL。经研究证实,该有效部位对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性有显著抑制作用,因此既可用于治疗糖尿病或与糖尿病有关的疾病,亦可用于以降血糖为目的的日常保健服用。
本发明的第二个目的在于提供从灵芝子实体中提取的有效部位FYGL。
本发明的第三个目的在于提供该有效部位FYGL作为唯一的活性成分在制备药物中的应用。
本发明的第四个目的在于提供包含该有效部位FYGL的药物制剂或保健品制剂。
以下对本发明所涉及的若干技术方案进行描述。
本发明的第一方案涉及灵芝子实体中的有效部位FYGL,所述有效部位FYGL是对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物.
本发明的第二方案提供了第一方案所述的有效部位FYGL作为唯一的活性成分用于制备药物的用途,所述药物用于治疗或预防糖尿病以及代谢综合症中的至少一种疾病;或用于治疗或预防与糖尿病及代谢综合症相关的至少一种下述疾病:动脉粥样硬化、动脉硬化、肥胖症、高血压、高脂血症、脂肪性肝病、肾病、神经性病变、视网膜病变、足溃疡或白内障;或用于治疗选自高脂血症、肥胖症或恶病质的至少一种疾病。
本发明的第三方案提供了第一方案所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为唯一的活性成分用于制备药物的用途,所述药物用于治疗与选自蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中的至少一种酶有关的疾病。
本发明的第四方案提供了一种药物制剂,该制剂包含第一方案所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为活性成分以及药学上可接受的载体,且不包含其他灵芝子实体提取物。
本发明的第五方案提供了一种保健品制剂,所述保健品制剂包含第一方案所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为活性成分以及可食用的载体,且不包含其他灵芝子实体提取物。
本发明的第六方案提供了一种从灵芝子实体中提取有效部位FYGL的方法,所述有效部位FYGL是对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物,所述方法包括:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提或对所述脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL,或对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行所述干燥以获得所述有效部位FYGL。
本发明的第七方案提供了一种从灵芝子实体中提取有效部位FYGL的方法,所述方法包括:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提或对所述脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL,或对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行所述干燥以获得所述有效部位FYGL。
本发明的第八方案提供了由上述提取方法制得的灵芝子实体中的有效部位FYGL。
上述有效部位FYGL的体外分析和动物试验结果均显示,其对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性均有显著抑制作用,因此可推知在人体内将具有明显的降血糖效果,从而可用于治疗或预防糖尿病和代谢综合症或与糖尿病和代谢综合症有关的疾病或症状。此外,上述提取方法简单易行且生产成本较低,可方便地在产业上推广实施,从而带来良好的经济效益。
发明人对从灵芝子实体中提取的上述有效部位FYGL进行了苯酚-硫酸法和劳里(Lowry)法的检测,基于结果可推断,该有效部位包含了多糖和蛋白成分。当用离子色谱分析多糖成分中的单糖单元时,发现其主要为葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖单元,当用氨基酸组成分析仪分析其蛋白成分时,发现蛋白中的氨基酸组成包含自然界中存在的19种天然氨基酸残基。
附图说明
图1显示了实施例1所得产物的1H NMR图谱。
具体实施方式
在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而,对于本领域技术人员来说显而易见的是,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中,为了避免与本发明发生混淆,对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
为了彻底了解本发明,将在下列的描述中提出详细的步骤,以便说明本发明如何从灵芝子实体中提取有效部位FYGL。显然,本发明的施行并不限定于本领域的技术人员所熟习的特殊细节。本发明的较佳实施例详细描述如下,然而除了这些详细描述外,本发明还可以具有其他实施方式。
有效部位FYGL的提取方法
首先,根据本发明的一个实施方案,提供了一种从灵芝子实体中提取有效部位FYGL的方法,所述方法包括:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提或对所述脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL,或对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行所述干燥以获得所述有效部位FYGL。
上述技术方案可解释为以下四个实施方案:
方案一,该方法包括以下步骤:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL。
方案二,该方法包括以下步骤:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行干燥以获得所述有效部位FYGL。
方案三,该方法包括以下步骤:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行干燥以获得所述有效部位FYGL。
方案四,该方法包括以下步骤:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL。
在本发明的一个优选实施方案中,所述有效部位FYGL基本由重均分子量为1kDa至100kDa的物质组成。在这样优选的提取物中,有效部位的活性成分浓度得到了进一步提高。
在本发明的一个优选实施方案中,在进行所述分离之后,所述干燥是选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种。尽管干燥方式的选择并不影响实际产率,但从减少对产物有可能破坏的角度来说,优选采用较为温和的干燥方式,例如减压干燥和/或常压干燥;而从提高生产效率的角度来看,优选采用喷雾干燥和/或冷冻干燥。
在本发明的一个优选实施方案中,所述的脱脂产物通过使用醇类或醇类水溶液对灵芝子实体进行脱脂而获得,优选该脱脂过程包括干燥步骤,以便于提高后续步骤的效率。
对于所用的原料,发明人的实验结果表明,该有效部位FYGL广泛地存在于各地的灵芝子实体中,且本发明的提取方法对该有效部位具有良好的选择性,因此本发明的提取方法所用的灵芝子实体不局限于某一产地的灵芝,换言之,可以使用采集自全国各地的灵芝,既可以是道地药材,也可以是普通药材;既可以是野生灵芝,也可以是人工栽培的灵芝。例如,可以使用采自吉林、浙江等地的灵芝子实体,还可以使用由供应商销售的灵芝子实体(例如上海雷允上销售的产品)。为了提高脱脂效率,可以先用粉碎机等设备对购得的灵芝子实体进行粉碎,再进行脱脂。
对于脱脂时使用的脱脂剂,可以使用醇类溶剂或醇类的水溶液,从易得性的角度考虑,优选使用乙醇或乙醇水溶液;从生产效率的角度考虑,所用乙醇水溶液的体积浓度优选是50体积%以上,更优选是70体积%以上,最优选为95体积%以上。脱脂次数可以是1-5次,该次数可以根据所用醇溶液的浓度等因素进行适当选择,只要能够基本脱除子实体中的脂类化合物即可。例如,可使用95体积%的乙醇水溶液对灵芝子实体进行1-3次脱脂。就脱脂温度而言,可以是常温,但优选在比常温稍高的温度下进行,例如40℃以上。例如,对于约95体积%的乙醇溶液,可以在其沸点温度(约78℃)下进行回流脱脂。每次脱脂时间可以根据例如原料量、脱脂温度、脱脂剂浓度以及原料与脱脂剂比例等各种因素综合考虑,例如可以是20分钟到10小时。需要指出的是,脱脂的目的仅仅是为了脱除灵芝子实体中的脂类化合物,脱脂的一般方法是本领域技术人员公知的,因此,除了以上提到的手段之外,本领域技术人员也可以采用常规的实验手段来达到这一目的。
对于可适用于脱脂所得物(滤渣)的干燥步骤,可以采用选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种,如果选用了挥发性较好的高浓度醇溶液作为脱脂剂,则优选采用风干法,因为这样可以进一步降低成本。由此即可获得脱脂产物。总而言之,脱脂过程既可以包括干燥步骤,也可以直接将脱脂后的产物用于后续步骤。
然后可对所述脱脂产物进行碱提。对于碱提时的溶液温度(即碱提温度),可以是0℃(冰水浴)-20℃。发明人意外地发现,在上述范围内选择较低的碱提温度可以显著提高所得有效部位的活性,因此,从这个角度考虑,优选碱提温度越低越好。如果选择高于20℃的碱提温度,使用普通的提取时间(例如1小时),则会破坏碱提物中的有效部位,使蛋白及多糖间的共价链接断键,形成小分子化合物,小分子化合物将在随后的透析步骤中被去除,从而导致最终提取物产量减少,活性降低,有效成分损失,也即,所得提取物对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50大于80μg/mL。另一方面,温度越低,碱提速度越慢,需要的碱提次数也越多,且碱提耗费的能量过多,导致不经济。因此,上述碱提温度更优选是4℃-15℃。举例来说,在一个优选实施方案中,使用碱溶液在10°C的碱提温度下提取1-5次。其提取时间是10小时以上,更优选是12-24小时;如果选择0℃冰水浴进行碱提,则可能需超过24小时才能达到与10℃相同的碱提效果。
所用的碱溶液可以是包含选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氨水中的至少一种物质的水溶液,优选是浓度为0.5M以上的碳酸钠或碳酸氢钠溶液;或0.1~2M的氢氧化钾、氢氧化钠或氨水溶液。为了获得较高的产率,可以适当延长提取时间(例如延长至15小时以上),和/或提高碱性物质的浓度(例如将氢氧化钠的浓度提高至1.5M以上,或将碳酸钠的浓度提高到2M以上)。从提高生产效率的角度考虑,更优选是浓度为1.0M以上的碳酸钠或0.5-2M的氢氧化钠或氢氧化钾或0.5-2M氨水。浓度越高,效率越高,但过高的浓度也有可能导致目标提取物受损,并且会导致后续程序变得繁琐,因此不优选。然后,可对碱提之后获得的提取液进行过滤。优选的情况下,过滤后的滤液可用盐酸或醋酸等酸性试剂中和至中性,再进行浓缩,以用于后续的步骤。当然,本领域技术人员知晓,根据实际情况,所谓的过滤、中和以及浓缩步骤也可以省略。
虽然本发明的目标提取物存在于碱提物中,但也可以先对脱脂产物进行水提,然后再对水提后残余的滤渣和/或残渣进行碱提,由此获得碱提物。当然,也可以先对一部分脱脂产物进行水提,然后将由其获得的残渣和滤渣与另一部分脱脂产物一起进行碱提,由此获得碱提物。总之,不管采用何种手段,也不管采用何种次序,只需要从脱脂产物中获得碱提物即可。因此,本领域技术人员可根据实际情况选择各种路径。例如,在一个优选实施方案中,先对脱脂产物进行水提,以便获取水提物(其中可能包含可用于其它用途的有效成分),然后从水提后获得的滤渣或残渣中提取可用于制造本发明的有效部位FYGL的碱提物。换言之,用于碱提的原料可以是水提之后的滤渣和/或残渣。由于这种原料是本领域常用的水提方法中需要丢弃的废料,上述实施方案可显著降低此碱提方法的成本。
在进行所述水提的情况下,可采用例如去离子水对其进行提取。其提取温度可以是常规的中药水提温度,例如50-80℃,但为了提高生产效率,优选采用沸水回流提取。水提的次数可以是1-5次,提取时间可以是1-5小时,具体视情况而定。
在按照以上方式获得灵芝子实体的碱提物之后,为了提高所得有效成分的浓度,需对这些碱提物进行透析,以去除小分子。所述的小分子包括但不限于:无机小分子、有机水溶性小分子、蛋白小分子或糖类小分子等。其中,无机小分子可包括掺杂在碱提物中的碱、碱被中和之后形成的盐以及可能存在的盐酸。就灵芝子实体的中间提取物这样的混合物而言,本领域技术人员知晓此处所要去除的小分子的含义。发明人在此要明确的是,本发明所得的有效部位FYGL中应基本不含此类小分子。其原因在于,这些小分子并非活性成分,且有可能对后续的分离步骤产生干扰,从而降低最终产物中活性成分的浓度,所以优选在进入分离步骤之前将其除去。透析是本领域技术人员常用的可去除小分子的技术手段。当将其用于本发明的提取方法时,其优点在于,可在过分不损失活性成分的情况下,以低成本的方式除去生物大分子中的小分子。优选的是,本发明的提取方法中,将上述碱提物或其浓缩物装入规格为1kDa-3kDa的透析袋(即,可使用规格介于1kDa-3kDa之间的任何透析袋,例如1kDa和3kDa),将透析袋置于去离子水中对所得碱提物或其浓缩物进行1-3天透析。不过,除了透析之外,本领域技术人员也可以采用其他合适的手段(例如柱层析、1kDa-3kDa截留分子量的超滤膜分离等)来去除碱提物中的小分子,只要达到去除小分子的效果即可。若透析袋或超滤膜截留分子量大于3kDa,则有可能使有效成分损失,但小于1kDa也会使活性无效的小分子,如被碱解的蛋白及多糖小分子留存于提取物中,显著降低有效成分的浓度,并且影响有效组份蛋白和多糖含量的定量测定。
然后,可对去除了小分子的这些粗产物进行直接干燥以获得有效部位FYGL,或者先进行分离,以从中进一步提取活性成分,并提高最终产物中活性成分的含量,然后在进行所述干燥。所述干燥是选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种。
在本发明的一个优选实施方案中,所述分离包括(1)进行醇沉,以获得上清液;或(2)通过用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤分级,以去除重均分子量大于该截留值的物质。即,主要通过醇沉或超滤的方式来选择位于一定分子量区间的特定提取物。在本发明中,所述分子量区间可以是分子量1kDa至100kDa,更优选是分子量1kDa至50kDa,甚至优选是分子量1kDa至30kDa。
发明人发现,当采用醇沉方式时,大分子量的成分将以沉淀的方式被除去,由此可获得分子量中等的活性成分;当采用超滤方式时,可通过对超滤膜分子量截留值的选择来获得分子量中等的活性成分。实验证明,分子量在100kDa以上的大分子量成分,其抑制PTP1B活性的能力明显减弱,因此优选采用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤,更优选采用分子量截留值为70kDa以下的超滤膜进行超滤,进一步优选采用分子量截留值为50kDa以下的超滤膜进行超滤,特别优选采用分子量截留值为30kDa以下的超滤膜进行超滤,以进一步提高滤液中活性成分的浓度。
超滤是同时进行浓缩和分离大分子或胶体物质的技术,其中,以压力差为驱动力,液体在超滤膜表面流过时,大分子或胶体物质被截留,小分子透过膜。超滤膜可以是平面膜、卷式膜、管式膜或中空纤维膜等形式。一般说来,超滤膜的孔径范围大体在50~10000?,可以截留的粒径半径范围为1~20nm,相当于分子量为300~300000的各种蛋白质和高分子化合物。截留分子量是指能被膜截留住的溶质中最小溶质的分子量。本发明所用超滤膜的膜材料可以是纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物等等。由于膜材料的选择并不影响所截留的最终产物的组成,因此本发明的方法在超滤膜材料上并无限制,只要分子量截留值在上述范围内即可。
醇沉分级是本领域技术人员的常规技术手段,即,利用作为极性溶剂的醇与水对有效部位和其他成分的不同溶解度而进行的分级。发明人发现,利用醇沉分级可将有效部位FYGL与上述粗提物中无明显活性的其他组份(可称为杂质)分离。在本发明中,优选使用乙醇水溶液来沉淀上述粗提物中的杂质,再收集上清液。在一个优选实施方案中,所述透析的持续时间是2-4天,然后,将透析袋内的溶液浓缩至原体积的1/3~1/5,再加入体积是浓缩液体积的2~5倍的95体积%乙醇,在室温下放置12~24小时,离心收集上清液。本领域技术人员可根据实际情况对以上条件进行适当调整,以获得更好的提取效率。
对于超滤,本领域技术人员可以在上述范围内根据超滤膜的易得性自由选择所述分子量截留值,例如40kDa、30kDa、20kDa和10kDa等等,但优选该分子量截留值不小于20kDa。在本发明的一个实例中,以分子量截留值为50kDa的超滤膜取得了分子量为50kDa以下的有效部位FYGL;如之前使用1kDa透析袋进行透析分离,则此处所得的有效部位FYGL基本上由分子量为1-50kDa的物质组成。
此外,为了提高最终产物中活性成分的含量而进行超滤分级时,除了采用上述分子量截留值为100kDa以下的超滤膜之外,也可以同时采用分子量截留值较小的超滤膜对该碱提物进行超滤,以去除分子量在该较小的分子量截留值以下的成分。例如可采用分子量截留值为10kDa以下(1kDa、2kDa、3kDa……10kDa)的超滤膜先对碱提物进行超滤,以去除分子量在该分子量截留值以下的物质,然后再对所得的产物采用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤;或者,先采用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤,以去除分子量在该分子量截留值以上的物质,然后再采用分子量截留值为10kDa以下(1kDa、2kDa、3kDa……10kDa)的超滤膜对所得的滤液进行超滤。总之,为了获得分子量分布在1-100kDa之间的任意区间的活性成分,本领域技术人员可采用任意分子量截留值不同(但分别处于上述范围内)的两种超滤膜进行上述超滤。而且,在该步骤中不一定需要用超滤膜来获取具有上述分子量分布的活性成分,本领域技术人员完全可以采用其他手段(例如醇沉,柱层析等)来达到相同目的。优选的是,该分子量截留值的下限不大于10kDa,更优选的是,该下限不大于5kDa。
此外,为了防止粗提取液中的某些颗粒杂质堵住超滤膜的滤孔,优选先用滤膜孔径为2~15微米(例如3微米、5微米、7微米、10微米等)的过滤器对粗提取液进行预先过滤,进一步去除不溶于水的颗粒较大的杂质,然后将澄清的预滤液用于所述超滤。与醇沉相比,超滤所用的时间较短,因此从生产效率的角度来看更优选。而且超滤膜可多次重复使用,比乙醇更环保;相对于醇沉而言,超滤方法还可以进一步提高最终产物中活性成分的含量,因此是更优选的方法。
对于分子量分级获得的所述上清液,将其干燥即可获得本发明的有效部位FYGL。所述干燥是选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种。
尽管如此,但从进一步提高有效部位活性的角度考虑,优选在所述干燥之前对该有效部位进行柱层析以选择对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B活性半数抑制率更佳的组份。所述柱层析可使用选自DEAE-纤维素柱、DEAE-Sephadex柱、DEAE-Sepharose柱或大孔吸附树脂中的至少一种柱层析装置来进行。在一个优选的实施方案中,其使用的洗脱剂相继是0.1~2M NaCl及0.1~2M NaOH的水溶液,其树脂柱径和柱高比为15~30,流速为0.5~2.5柱体积/小时。本领域技术人员可根据上述教导并结合实际情况对上述条件进行适当调整。
在洗脱之后,可进一步实施精制步骤,即,用苯酚-硫酸法或劳里法检测所得的洗脱组份,并收集反应阳性部分,然后用1kDa透析袋对所收集的反应阳性部分进行透析,以除去无机盐小分子及有机水溶性小分子。然后对所得透析袋内的物质进行减压浓缩,干燥,从而获得灵芝子实体的有效部位FYGL。
在一个优选的实施方案中,有效部位FYGL的制备方法如下:
(1)脱脂步骤:取灵芝子实体药材,用粉碎机粉碎,用50~100%(体积百分比)乙醇脱脂1~5次,脱脂温度40~78℃,每次1~5小时,将脱脂后的滤渣风干,得脱脂产物。
(2)碱提步骤:将脱脂产物用沸水回流提取1~5次,每次1~5小时,提取液过滤,而获得滤渣。将滤渣用0.5M以上的碳酸钠溶液或0.1~2M的氢氧化钠溶液或0.5M~2M氨水,在0-20℃(更优选4-15°C)提取1~5次,提取时间为12~24小时,提取液过滤,滤液用0.1~1M盐酸中和至中性,减压浓缩得碱提浓缩液。
或者,将脱脂产物直接用1.0M以上的碳酸钠或0.5~2M的氢氧化钠溶液,或1.0M以上的氨水,在0-20℃(更优选4-15°C)提取1~5次,提取时间为12~24小时,将合并的提取液过滤,滤液用0.1~1M盐酸中和至中性,将中和后的提取液减压浓缩至小体积。
(3)透析步骤:将上述碱提液用1kDa-3kDa透析袋水透析1~4天,将透析袋内溶液浓缩至1/3~1/5体积。
(4)干燥步骤:将所述透析后获得的碱提液直接冷冻干燥。
(5)可选的分离步骤:在所述透析后获得的碱提液中,加入2~5倍于溶液体积的95%乙醇,室温放置12~24小时,离心收集上清液,干燥得灵芝子实体的有效部位FYGL。
或者,用分子量截留值为100kDa的超滤膜对所述透析后获得的碱提液进行分级,以获得分子量在1-100kDa之间的组份,干燥得到灵芝子实体的有效部位FYGL。可选地,先用滤膜孔径为2~15微米的过滤器对所述透析后获得的碱提液进行预先过滤,进一步去除不溶于水的粒径较大的杂质,得到澄清的预滤碱提液,然后进行所述超滤。
(6)可选的柱层析步骤:将上述有效部位FYGL加去离子水溶解,经大孔吸附树脂柱吸附,树脂柱径和柱高比为15~30,相继用0.1~2M NaCl及0.1~2M NaOH梯度洗脱,流速为0.5~2.5柱体积/小时。进一步可选的是,采用苯酚-硫酸法检测洗脱组份,收集反应阳性部分,1kDa透析袋透析除去无机盐小分子及有机水溶性小分子后,减压浓缩,干燥,得灵芝子实体的有效部位FYGL。
有效部位FYGL
本文中所述的有效部位FYGL是指对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)活性有显著抑制的灵芝子实体提取物。具体地说,该有效部位对PTP1B活性的半数抑制率IC50在80μg/mL以下。在本发明提出之前,现有技术中从未有人从灵芝子实体中获得过对PTP1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的提取物。据发明人发现,只要采用本发明的上述方法,即可获得对PTP1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物,即有效部位FYGL。尽管随提取步骤中各工艺条件(例如温度、加热时间、用于碱提的碱溶液种类和浓度、透析袋的分子量截留值、透析时间、超滤膜的选择、柱层析的各种条件)的不同,所获得最终产物的所述抑制率IC50可能略有波动(下文会详细列举从上述各种途径获得的有效部位FYGL的所述IC50具体值)。
很显然,在本发明说明书的教导下,本领域技术人员完全可以在本发明上述方法的基础上得到各种明显的变型或替代方式,以获得对PTP1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物,即有效部位FYGL。因此,本发明的一个实施方案提供了灵芝子实体提取物的有效部位FYGL,所述有效部位FYGL是对PTP1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物,所述活性半数抑制率IC50更优选是70μg/mL以下,再优选是50μg/mL以下,进一步优选是40μg/mL以下,更进一步优选是30μg/mL以下,特别优选是20μg/mL以下。所述活性半数抑制率IC50的下限为大于10μg/mL,优选为大于0。
对于该抑制率而言,数值越小,表示该提取物活性越高,因此也更优选。在本发明的一个优选实施方案中,所述优选的有效部位FYGL可以是对分子量分级后的产物进行柱层析而获得的最终产物,实验表明,其对PTP1B的活性半数抑制率IC50可达到20μg/mL以下。
核磁共振技术是利用物质中各个原子核的磁性不同而揭示分子结构和运动的方法。当原子核处在特定的外磁场下吸收一定能量的电磁波,记录这种吸收现象所获得的波谱,就是核磁共振谱。由于这种吸收与核,如1H核,所处的环境密切相关,所以吸收谱特征能反映分子结构的信息。核所处的环境指化合物的官能团及其链接方式、空间结构,其吸收特征用峰的化学位移(chemical shift, 单位:ppm,是一个与参考样品信号相比较的值)、峰的相对面积、峰的裂分数目来描述,它是化合物组成及结构的指纹图谱,与化合物结构一一对应。1952年,瑞士科学家Felix Bloch 和美国科学家 Edwar Wills Purcell 因发现核磁精密测量的方法而获得诺贝尔物理学奖,1953年第一台30兆赫核磁共振谱仪问世,从此开始了利用核磁共振方法解决有机分子结构的时代。1991年及2002年,两位瑞士科学家Richard R. Ernst 及Kurt Wuthrich 分别因发展多维核磁共振技术理论及用于解决生物大分子结构而获得诺贝尔化学奖。由于核磁共振谱是分子结构的指纹谱,其峰的化学位移值及峰的相对面积不随所使用的磁场强度而改变,但高磁场谱仪,可提高测量信号灵敏度和分辨率,增加信号强度。优化的实验测量参数,同样可使信号强度增加,基线噪声更平滑,但均不影响化学位移和相对峰面积。测量液体核磁共振谱时,待测样品需溶于氘代溶剂,选择不同的氘代溶剂,会影响图谱的化学位移。因此,在进行核磁共振谱对比时,需注意测量时使用相同的氘代溶剂,并选用相同的参考样品,如四甲基硅烷(tetramethylsilane,TMS),它是常用的核磁共振参考样品,1H核其唯一的共振吸收峰的化学位移值一般设为0ppm。核磁共振技术是除单晶X射线衍射技术外,研究分子结构最有力的工具。但前者要求样品为难以制备的单晶晶体,后者则为溶液状态即可,因此核磁共振技术解决有机分子结构更为常用。核磁共振波谱虽经常用作单一化合物的指纹图谱,但多个单一化合物以一定比例组成的组合物图谱也具有该组合物的指纹图谱特征。当在中药的提取方法中获得经生物活性实验确认的有效成分时,可使用该有效成分的核磁共振波谱来筛选由各种提取方式获得的提取物,这种筛选方法与生物活性实验相比,可以更快速地确定所得提取物是否包含足够的有效成分。
基于上述理论,本发明中使用了1H NMR来确认有效部位FYGL的具体结构和组成。结果发现,在1H NMR谱中,化学位移d=3.6~3.4ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为0.5~1.5,化学位移d=3.0~1.0ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为0.5~4.0。所述1H NMR测定以氘代水作溶剂,设四甲基硅烷的化学位移为0.0ppm以作为外标。为了提高所述有效部位FYGL对PTP1B的活性半数抑制率IC50,更优选化学位移d=3.6~3.4ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为1.2~1.5,化学位移d=3.0~1.0ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为2.0~4.0。最优选的是,化学位移d=3.6~3.4ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为1.0~1.5,化学位移d=3.0~1.0ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为2.5~4.0。
基于多糖及蛋白质结构与其核磁共振波谱的化学位移关系,以及对灵芝子实体有效部位FYGL中单糖及氨基酸的组成分析,发明人推测,化学位移在3.6~3.4ppm区域的峰主要与该有效部位中的多糖成分中含有的葡萄糖、木糖、鼠李糖等单糖单元构成的多糖有关;化学位移在3.4~3.2ppm区域的峰主要与多糖成分中含有葡萄糖及木糖等单糖单元构成的多糖有关;化学位移在3.0~1.0ppm区域的峰与含有蛋白或多肽有关。另外,核磁共振波谱中化学位移从3.6至6.0ppm的峰除主要源于葡萄糖的贡献外,还部分源于阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖和果糖等的贡献以及部分蛋白的贡献。发明人发现,通过上述各种途径提取的有效部位FYGL,其1H NMR谱中特定区域峰的面积比值不但都处于上述特定范围内,而且还与该有效部位对PTP1B的活性半数抑制率IC50的大小存在一定关联(实施例部分将提供相应的数据及依赖关系)。一般而言,1H核磁共振谱中特征峰的积分面积之比值可以直接反映分子中特定官能团及其对应组份的含量之间的比例关系,即,该比值与所对应组份的含量比呈正相关,换言之,比值越大,表明前一组份相对于后一组份的含量比越大。因此,上述结果表明,该有效部位FYGL具有特定的多肽或蛋白质以及多糖成份,特别是具有一定的比例关系。
而且,基于以上结果,本领域技术人员能够预见,对于任何灵芝子实体提取物,如果其1H NMR谱中具有上述特征峰,且其积分面积比值处于上述比例范围之内,则其将具有显著抑制PTP1B活性的能力。此外,如上所述,对于由本发明的提取方法所得的灵芝子实体提取物即有效部位FYGL,其对PTP1B的活性半数抑制率IC50均在80μg/mL以下,但发明人也发现,其具体数值会随路径的不同而有所差异(实施例将提供相关数据),但其1H NMR谱却均满足上述条件,因而表明其组成并不随路径(例如醇沉或超滤)选择的不同而存在明显差异。换言之,由各种路径获得的灵芝子实体提取物不但在PTP1B活性抑制上相似,而且在组成上也基本一致。
此外,发明人还发现,除了上述峰之外,优选的有效部位FYGL的1H NMR谱还存在一些特征峰,如0.9、1.2、1.4、1.6、2.0、2.3、2.7、3.4、3.5、3.6、3.8、3.9、4.0、4.2、4.3、4.5、4.7、4.8、5.0、5.3、5.9、6.0和6.6~7.6 ppm附近(即约±0.1ppm。该偏差源于参比样品四甲基硅烷作为外标还是内标所致)的峰。根据氨基酸组成分析,在总共发现的19种自然界存在的氨基酸中(由于进行氨基酸组成分析时需用酸处理样品,以致色氨酸被分解,因此无法直接测得),含量前5位(均大于总氨基酸含量的9%)的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸,因此认为它们是提取物中蛋白组份的主要氨基酸残基单元。另外氨基酸含量占总氨基酸含量大于2%的氨基酸为苏氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等。用离子色谱进行构成多糖的单糖组份分析,发现主要存在六种单糖,它们是葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖,其中主要单糖为葡萄糖,其含量大于总糖量的70%。根据氨基酸和单糖组成分析以及它们的1H核磁共振波谱,同时参考相关文献报道,我们将FYGL的1H NMR谱归属如表1。
表1:FYGL的1H NMR谱归属
有效部位FYGL的用途
如上所述,有效部位FYGL是指对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)活性有显著抑制能力的灵芝子实体提取物,具体地说,该有效部位对PTP1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下。除此之外,发明人还发现,上述所有的有效部位FYGL还对α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性有程度不一的抑制作用。因此该有效部位亦可用于制备药物,以用于治疗与这些酶有关的疾病。具体地说,该药物可用于治疗或预防糖尿病以及代谢综合症中的至少一种疾病。这些疾病可以是与糖尿病或代谢综合症相关的至少一种下述疾病:动脉粥样硬化、动脉硬化、肥胖症、高血压、高脂血症、脂肪性肝病、肾病、神经性病变、视网膜病变、足溃疡或白内障。本发明的药物制剂可包含上述任一种有效部位FYGL作为活性成分以及药学上可接受的载体。该药物制剂可以是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、口服液、混悬剂、滴丸剂、微丸剂、喷雾剂、气雾剂、巴布剂或帖剂。该有效部位FYGL在药物制剂中既可以是唯一的活性成分,也可以与其他有效部位合用。无论是单独使用还是组合使用,其剂量均可根据实际情况适当确定。该药物制剂可按照本领域常规的方法制备。由于含中药有效部位的药物的制备方法是本领域技术人员熟知的常规技术,在此不再赘述。
除了制药用途之外,由于该有效部位FYGL完全取自灵芝子实体,不含有害化学成分,因此也可以用于保健品,以作为日常保健之用。本发明的保健品可包含上述任一种有效部位FYGL作为活性成分,以及可食用的载体。同样,该有效部位FYGL可以作为唯一的活性成分用于保健品,也可以与其他有效部位合用。无论是单独使用还是组合使用,其剂量均可根据实际情况适当地确定。该保健品制剂可按照本领域常规的方法制备。由于含中药有效部位的保健品的制备方法是本领域技术人员熟知的常规技术,在此不再赘述。
实施例
举以下实施例的目的是为了更好地理解本发明,本发明不受以下实施例的限制。
实施例1
将10g灵芝子实体原料(购自雷允上,产地吉林)用95体积%的药用乙醇脱脂3次,脱脂温度70℃,每次5小时,将脱脂后的滤渣风干,脱脂后的干品(脱脂产物)用1M的碳酸钠水溶液在20℃提取2次,提取时间为12小时,提取液过滤,1M盐酸中和至中性,减压浓缩得碱提浓缩液,1kDa透析袋水透析2天,将透析袋内溶液浓缩至1/5体积,直接冷冻干燥后获得提取物0.50g(产率5.0%)。
实施例2
采用与实施例1相同的方式获得经过透析的碱提浓缩液,加入5倍于溶液体积的95体积%乙醇,室温放置12小时,离心收集上清液,冷冻干燥得灵芝提取物0.42g(产率4.2%)。
实施例3
将10g灵芝子实体原料(购自雷允上,产地吉林)用95体积%的药用乙醇回流脱脂3次,脱脂温度78℃,每次5小时,将脱脂后的滤渣风干,脱脂后的干品(脱脂产物)用1M的氢氧化钠溶液在20℃提取2次,提取时间为24小时,提取液过滤,1M盐酸中和至中性,减压浓缩得碱提浓缩液,1kDa透析袋水透析2天,将透析袋内溶液浓缩至1/5体积,加入5倍于溶液体积的95体积%乙醇,室温放置12小时,离心收集上清液,冷冻干燥得灵芝提取物0.40g(产率4.0%)。
实施例4
重复实施例2,并取由此获得的灵芝提取物0.42g,加去离子水溶解,经DE-32离子交换树脂柱吸附,树脂柱径和柱高比为25,相继用0.6M NaCl及0.2M NaOH梯度洗脱,流速为1柱体积/小时。用苯酚-硫酸法检测洗脱组份,其中0.2M NaOH洗脱组份要先用盐酸中和至中性。收集苯酚-硫酸法的反应阳性部分,1kDa透析袋透析除去小分子后,减压浓缩,冷冻干燥,得洗脱各组份总计0.28g(产率2.8%)。
实施例5
重复实施例2,并取由此获得的灵芝提取物0.42g,加去离子水溶解,经Sephadex G75凝胶层析,树脂柱径和柱高比为35,用0.2M NaCl洗脱,流速为1柱体积/小时。用苯酚-硫酸法检测洗脱组份,收集苯酚-硫酸法的反应阳性部分,1kDa透析袋透析除去小分子后,减压浓缩,冷冻干燥,得洗脱各组份总计0.06g(产率为0.6%)。
实施例6
将10g灵芝子实体原料(购自雷允上,产地吉林)用95体积%的药用乙醇回流脱脂3次(脱脂温度78℃),每次4小时,将脱脂后的滤渣风干,脱脂后的干品(脱脂产物)用沸水回流提取2次,每次3小时,提取液过滤,弃去滤液。水提后滤渣继续用1M的碳酸钠水溶液在20℃提取2次,提取时间为12小时,提取液过滤,1M盐酸中和至中性,减压浓缩得碱提浓缩液,1kDa透析袋水透析2天,将透析袋内溶液浓缩至1/5体积,加入5倍于溶液体积的95体积%乙醇,室温放置12小时,离心收集上清液,冷冻干燥得灵芝提取物0.31g(产率3.1%)。
实施例7
采用与实施例1相同的方式获得经过透析的碱提物,先经滤膜孔径为5微米的过滤器进行预先过滤,然后用分子量截留值为100kDa的超滤膜对所得预滤碱提液进行分级,得1kDa-100kDa组份0.65g(产率6.5%)。
实施例8
采用与实施例3相同的方式获得经过透析的碱提物,先经滤膜孔径为5微米的过滤器进行预先过滤,然后用分子量截留值为100kDa的超滤膜对所得预滤碱提液进行分级,得1kDa-100kDa组份0.61g(产率6.1%)。
实施例9
采用与实施例1相同的方式获得经过透析的碱提物,先经滤膜孔径为5微米的过滤器进行预先过滤,然后用分子量截留值为50kDa的超滤膜对所得预滤碱提液进行分级,得1-50kDa组份0.30g(产率3.0%)。
实施例10
采用与实施例1相同的方式获得经过透析的碱提物,先经滤膜孔径为5微米的过滤器进行预先过滤,然后用分子量截留值为30kDa的超滤膜对所得预滤碱提液进行分级,得1-30kDa组份0.25g(产率2.5%)。
实施例11
采用与实施例9相同的方式获得1-50kDa组份0.25g,然后用分子量截留值为3kDa的超滤膜去除3kDa以下的组份,从而获得3-50kDa组份0.20g(产率2.0%)。
实施例12
采用与实施例7相同的方式获得1kDa-100kDa组份0.65g,然后用分子量截留值为50kDa的超滤膜去除50kDa以下的组份,从而获得50-100kDa组份0.40g(产率4.0%)。
实施例13
采用与实施例7相同的方式获得1kDa-100kDa组份0.65g,然后以实施例4的方式进行柱层析,从而获得精制产物0.33g(产率3.3%)。
实施例14
重复实施例1,不同之处在于,在碱提步骤中,将碱提温度由20℃改为0℃(冰水浴),提取2次,碱提时间为24小时。结果获得提取物0.80g(产率8.0%)。
实施例15
重复实施例2,不同之处在于,在碱提步骤中,用1M的碳酸钠水溶液在10°C提取2次,提取时间为12小时。结果获得提取物1.10g(产率11.0%)。将此提取物1.10g,用与实施例5相同的方式进行精制,得洗脱各组份总计0.08g(产率为0.8%)。
实施例16
重复实施例1,不同之处在于,在碱提步骤中,将碱提温度由20℃改为15°C,并提取2次,提取时间为12小时,冷冻干燥后获得提取物0.62g(产率6.2%)。
对比例1
取实施例7中获得的100kDa以上的组份干燥而获得提取物0.9g。
对比例2
将10g灵芝子实体原料(购自雷允上,产地吉林)用95体积%的药用乙醇脱脂3次,脱脂温度70℃,每次5小时,将脱脂后的滤渣风干,脱脂后的干品(脱脂产物)用沸水回流提取2次,每次3小时,提取液过滤,弃去滤渣,将滤液冷冻干燥得灵芝提取物0.45g。
对比例3
重复实施例16,不同之处在于,在碱提步骤中,将碱提温度由15℃改为25°C,将碱提溶剂由1M的碳酸钠水溶液改为0.5M NaOH,并提取2次,提取时间为12小时,1kDa透析袋水透析,冷冻干燥后获得提取物0.25g(产率2.5%)。
对比例4
重复实施例16,不同之处在于,在碱提步骤中,将碱提温度由15℃改为65°C,将碱提溶剂由1M的碳酸钠水溶液改为0.5M NaOH,并提取2次,提取时间为12小时,3kDa透析袋水透析,冷冻干燥后获得提取物0.13g(产率1.3%)。
以下对各样品进行各种测试。
测试1
对上述实施例和对比例得到的样品进行红外光谱分析,结果发现各实施例样品的红外光谱基本相似。在实施例样品的红外光谱中,3420cm-1处强吸收峰为羟基O-H伸缩振动峰,2937cm-1处的吸收峰为C-H伸缩振动峰;1620cm-1 及 1400cm-1处的吸收峰分别为蛋白中酰胺I和酰胺II的振动峰;1200–1000cm-1之间的吸收峰为多糖中C-OH和C-O-C的特征吸收峰。对比例1至对比例4的样品中,1620cm-1 及 1400cm-1处的吸收峰明显变弱。
测试2
用苯酚-硫酸法检测由上述实施例和对比例得到的灵芝子实体提取物的多糖含量。
试剂:浓硫酸:分析纯,95.5重量%。80重量%苯酚:80g苯酚(分析纯重蒸馏试剂)加20g水使之溶解,可置冰箱中避光长期储存。6重量%苯酚:临用前以80重量%苯酚配制。葡萄糖:分析纯,98重量%。
首先制作糖含量标准曲线:准确称取葡萄糖20mg于500mL容量瓶中,加水至刻度,分别吸取0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL,1.2mL,1.4mL,1.6mL及1.8mL,各加水至2.0mL,然后加入6重量%苯酚1.0mL,静置10分钟,后加入浓硫酸5mL,摇匀,室温放置20分钟后于490nm测吸光强度,以2.0mL水按同样操作为空白,以横坐标为多糖微克数,纵坐标为吸光强度值,得糖含量标准曲线。
样品含量测定:吸取40mg/mL样品溶液1.0mL,加水1mL,然后加入6重量%苯酚1.0mL,静置10分钟,加入浓硫酸5mL,摇匀,室温放置20分钟后于490nm测吸光度,根据标准曲线计算多糖含量。
经苯酚-硫酸法检测各样品的多糖含量如表2。
表2:各样品的多糖含量
样品 | 多糖含量(重量%) |
实施例1 | 88 ± 2 |
实施例2 | 64 ± 5 |
实施例3 | 60 ± 3 |
实施例4 | 72 ± 2 |
实施例5 | 70 ± 2 |
实施例6 | 61 ± 4 |
实施例7 | 73 ± 3 |
实施例8 | 75 ± 2 |
实施例9 | 75 ± 3 |
实施例10 | 70 ± 3 |
实施例11 | 77 ± 4 |
实施例12 | 73 ± 3 |
实施例13 | 77 ± 3 |
实施例14 | 70 ± 4 |
实施例15 | 62 ± 3 |
实施例16 | 70 ± 2 |
对比例1 | 95 ± 4 |
对比例2 | 26 ± 1 |
对比例3 | 56 ± 2 |
对比例4 | 28 ± 3 |
测试3
采用劳里法检测由上述实施例和对比例得到的灵芝子实体提取物中的蛋白含量。
原理:蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合,形成蛋白质-铜复合物,此复合物使酚试剂的磷钼酸还原,产生蓝色化合物,在一定条件下,利用650nm处蓝色吸光强度与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线,从而用于测定样品中蛋白质的浓度。
用劳里法检测试剂盒检测到上述灵芝子实体提取物的蛋白含量如表3。
表3:各样品的蛋白含量
样品 | 蛋白含量(重量%) |
实施例1 | 6.5 ± 0.7 |
实施例2 | 7.8 ± 0.7 |
实施例3 | 10.5 ± 0.9 |
实施例4 | 14.3 ± 0.5 |
实施例5 | 12.8 ± 1.0 |
实施例6 | 7.9 ± 0.7 |
实施例7 | 8.7 ± 0.4 |
实施例8 | 8.0 ± 0.5 |
实施例9 | 10.9 ± 0.6 |
实施例10 | 11.7 ± 0.7 |
实施例11 | 11.0 ± 0.7 |
实施例12 | 7.9 ± 0.5 |
实施例13 | 16.8 ± 0.9 |
实施例14 | 7 .8 ± 0.7 |
实施例15 | 18.8 ± 0.9 |
实施例16 | 7.1 ± 0.8 |
对比例1 | 2.5 ± 0.4 |
对比例2 | 2.2 ± 0.4 |
对比例3 | 5.3 ± 0.4 |
对比例4 | 3.5 ± 0.4 |
测试4
测定由上述实施例和对比例得到的灵芝子实体提取物对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)活性抑制率。
对硝基苯基磷酸二钠(pNPP)是碱性磷酸酶的可溶性底物,在人源蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B,Sigma公司)的催化下,它脱去一个磷酸根,生成黄色可溶产物对硝基苯酚,该产物在405nm处有光吸收,以阳性药物钒酸钠为对照,加入系列浓度的FYGL。利用酶标仪检测405nm处光吸收的降低可以检测该药物对蛋白酪氨酸磷酸酶1B活性的抑制。所用缓冲液为50mM Tris,pH 8.0,150mM氯化钠。
各样品在终浓度为25mg/mL时对PTP1B的活性半数抑制率IC50如表4。
表4:各样品对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)的活性半数抑制率IC50
样品 | 半数抑制率IC50(mg/mL) |
实施例1 | 60 |
实施例2 | 51 |
实施例3 | 26 |
实施例4 | 18 |
实施例5 | 16 |
实施例6 | 45 |
实施例7 | 33 |
实施例8 | 35 |
实施例9 | 26 |
实施例10 | 24 |
实施例11 | 25 |
实施例12 | 43 |
实施例13 | 11 |
实施例14 | 42 |
实施例15 | 1.2 |
实施例16 | 50 |
对比例1 | 229 |
对比例2 | > 300 |
对比例3 | 101 |
对比例4 | > 300 |
测试5
测定由上述实施例13得到的灵芝子实体提取物对α-淀粉酶活性抑制。
3,5-二硝基水杨酸法(Bernfeld法)是体外筛选淀粉酶抑制剂常用的方法,可溶性淀粉在α-淀粉酶作用下水解产生还原基团,将3,5-二硝基水杨酸还原生成硝基氨基水杨酸,在过量的NaOH碱性溶液中硝基氨基水杨酸呈桔红色,在540nm波长处有最大吸收。由于α-淀粉酶抑制剂对淀粉水解有抑制作用,可使A 540nm值下降,从而可以计算待测物对淀粉酶活性的抑制率,以阿卡波糖作为阳性对照药物。
实施例13所得样品在终浓度为15U/mL时对α-淀粉酶的半数抑制率IC50为83 ± 10mg/mL。
测试6
测定由上述实施例13得到的灵芝子实体提取物对α-葡萄糖苷酶的活性抑制。
对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)是α-葡萄糖苷酶的可溶性底物,在α-葡萄糖苷酶的催化下,它脱去一个磷酸根,生成黄色可溶产物对硝基苯酚,该产物在405nm处有光吸收,以阳性对照药物阿卡波糖为对照,利用酶标仪进行FYGL对α-葡萄糖苷酶活性抑制的检测,通过检测405nm处光吸收的降低可以检测药物对α-葡萄糖苷酶活性的抑制。
实施例13所得样品在终浓度为0.03U/mL时对α-葡萄糖苷酶活性的半数抑制率IC50为97 ± 10mg/mL。
测试7
在上海中医药大学药物安全评价研究中心对实施例13的提取物在STZ致2型糖尿病模型大鼠上进行药效学试验。结果如表5。
表5:实施例13的样品在STZ致2型糖尿病模型大鼠上的药效结果
给药方式为灌胃给药,服药剂量分别为:2型糖尿病组:生理盐水20mL/kg;FYGL低剂量组:50mg/kg;FYGL高剂量组:150mg/kg;二甲双胍组:200mg/kg;罗格列酮组:3mg/kg。各组老鼠数量:10只/组。
数周后,FYGL给药组空腹血糖较2型糖尿病对照组明显降低,并与阳性组二甲双胍及罗格列酮组降糖效果相当。与2型糖尿病对照组相比,差异性#指p < 0.05,即有显著性差异;差异性##指p < 0.01,即有非常显著性差异。
测试8
测定各实施例和对比例样品的1H NMR谱,具体实验条件如下:
仪器设备:德国Bruker DMX500核磁共振谱仪,1H共振频率500MHz,梯度场下watergate水峰抑制脉冲序列,1H 90°脉冲宽度9.4微秒,采样长度2.044秒,采样点32K,扫描次数128.
样品制备:20毫克样品溶于0.5毫升氘代水中,于直径5毫米核磁共振玻璃管中测试。
测定条件:室温,以四甲基硅烷的1H化学位移为0.000ppm作外标参比。
在各样品的1H NMR谱中,均包含化学位移d在0.9、1.2、1.4、1.6、2.0、2.3、2.7、3.4、3.5、3.6、3.8、3.9、4.0、4.2、4.3、4.5、4.7、4.8、5.0、5.3、5.9、6.0和6.6~7.6ppm附近的核磁共振峰。图1为实施例1的1H NMR谱。将各实施例和对比例化学位移d=3.6-3.4ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4-3.2ppm区域的积分面积的比值(简称为比值I),化学位移d=3.0-1.0ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4-3.2ppm区域的积分面积的比值(简称为比值II)列于表6。
表6:各实施例和对比例1H NMR谱峰面积比较
样品 | 比值I | 比值II |
实施例1 | 0.75 | 1.45 |
实施例2 | 0.82 | 1.12 |
实施例3 | 1.14 | 2.73 |
实施例4 | 1.27 | 3.32 |
实施例5 | 1.29 | 3.50 |
实施例6 | 0.90 | 1.50 |
实施例7 | 1.08 | 2.05 |
实施例8 | 1.04 | 2.07 |
实施例9 | 1.10 | 2.89 |
实施例10 | 1.18 | 3.05 |
实施例11 | 1.16 | 2.93 |
实施例12 | 0.93 | 1.64 |
实施例13 | 1.30 | 3.39 |
实施例14 | 0.95 | 1.64 |
实施例15 | 1.45 | 3.79 |
实施例16 | 0.78 | 1.23 |
对比例1 | 0.38 | 0.55 |
对比例2 | 0.27 | 0.50 |
对比例3 | 0.59 | 0.74 |
对比例4 | 0.30 | 0.47 |
测试9
测定由上述实施例13得到的灵芝子实体提取物的单糖组成。
单糖组成分析采用离子色谱法,多糖的水解方法和色谱条件如下:
(1)多糖的水解
称取多糖样品1.0mg于试管中,加入2M三氟乙酸溶液1.0mL,封口,在100℃下水解反应2-4小时;之后打开试管口,通氮气吹干,加水溶解并定容至2.0mL。用0.2mm的一次性滤头过滤,直接进样分析。
(2)色谱条件
CarboPACTM PA10糖分离柱(2mm i.d. *250mm),CarboPACTM PA10糖保护柱(2mm i.d. *50mm),AminoPAC Trap氨基酸捕集柱(2mm i.d. *50mm)。流动相为14.0mM NaOH,流量0.2mL/min;进样量25mL;柱温30℃。在分析样品前,先用0.2mM NaOH溶液再生色谱柱10.0小时,然后用14.0mM NaOH溶液平衡2.0小时。
实施例13所得样品的单糖组成及其相对含量如表7。
表7:实施例13所得样品的单糖组成及其相对含量
单糖类别 | 含量(%) |
葡萄糖 | 78.12 |
阿拉伯糖 | 9.72 |
木糖 | 7.50 |
鼠李糖 | 2.26 |
半乳糖 | 1.96 |
果糖 | 0.44 |
测试10
测定由上述实施例13得到的灵芝子实体提取物的氨基酸组成。
用氨基酸分析仪进行氨基酸组成分析,该仪器采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法,对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组份含量进行分析。
称取2mg样品于玻璃管中,加入2mL 6M HCl溶液,充氮气5分钟以上,封管。将玻璃管放在110℃恒温干燥箱内水解22-24小时。水解结束后冷却至室温,开管,定容至10mL,过滤,将5mL滤液置于真空干燥器中,于55℃左右至完全干燥。加入1.0mL超纯水溶解,摇匀,用1M HCl或NaOH调pH值至1.7~2.2之间(可用精密试纸测定),过滤,稀释至合适浓度进样分析。
氨基酸分析仪:Hitachi(日立)全自动氨基酸分析仪,型号:日立L-8900。
实施例13所得样品的氨基酸组成及其相对含量如表8。
表8:实施例13所得样品的氨基酸组成及其相对含量
本发明已经通过上述实施例进行了说明。但应当理解的是,上述实施例只是用于举例和说明的目的,而非意在将本发明限制于所描述的实施例范围内。本领域技术人员根据本发明的教导还可以做出更多种的变型和修改,这些变型和修改均落在本发明所要求保护的范围以内。本发明的保护范围由附属的权利要求书及其等效范围所界定。
Claims (41)
1.灵芝子实体中的有效部位FYGL,所述有效部位FYGL是对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物。
2.根据权利要求1所述的有效部位FYGL,其中,所述有效部位FYGL的1H NMR谱包含化学位移d在0.9、1.2、1.4、1.6、2.0、2.3、2.7、3.4、3.5、3.6、3.8、3.9、4.0、4.2、4.3、4.5、4.7、4.8、5.0、5.3、5.9、6.0和6.6~7.6ppm附近的核磁共振峰;所述1H NMR谱的测定以氘代水作溶剂,设四甲基硅烷的化学位移为0.0ppm以作为外标或内标。
3.根据权利要求2所述的有效部位FYGL,其特征在于,在所述1H NMR谱中,化学位移d=3.6~3.4ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为0.5~1.5,化学位移d=3.0~1.0ppm区域的积分面积相对于化学位移d=3.4~3.2ppm区域的积分面积比值为0.5~4.0。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的有效部位FYGL,其特征在于,在所述有效部位FYGL中蛋白含量为3重量%~20重量%。
5.根据权利要求4所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述有效部位FYGL还包含多糖成分,所述多糖成分包含葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、果糖单元作为单糖单元。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的有效部位FYGL,所述有效部位FYGL由以下方法制得,所述方法包括:在0~20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提或对所述脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL,或对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行所述干燥以获得所述有效部位FYGL。
7.根据权利要求6所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述干燥是选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述脱脂产物是通过使用乙醇或乙醇水溶液对灵芝子实体进行脱脂而获得。
9.根据权利要求6所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述碱提温度为4~15℃。
10.根据权利要求6所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述碱提是使用包含选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氨水中的至少一种物质的水溶液进行提取。
11.根据权利要求10所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述水溶液是0.5M以上的碳酸钠或碳酸氢钠溶液;或0.1~2M的氢氧化钾、氢氧化钠或氨水溶液。
12.根据权利要求6或9所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述透析是使用1kDa-3kDa的透析袋进行透析,以去除1kDa-3kDa以下的小分子。
13.根据权利要求6至12中任一项所述的有效部位FYGL,其中,所述分离包括:
(1)进行醇沉,以获得上清液;或
(2)通过用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤分级,以去除分子量大于该截留值的物质。
14.根据权利要求13所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述醇沉是用乙醇水溶液对由所述透析获得的提取物进行沉淀,再收集所述上清液。
15.根据权利要求13所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述有效部位FYGL基本由分子量为1kDa至100kDa的物质组成。
16.根据权利要求13所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:在所述分离之后且在进行所述干燥之前,对该提取物进行柱层析。
17.根据权利要求16所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述柱层析使用选自DEAE-纤维素柱、DEAE-Sephadex柱、DEAE-Sepharose柱或大孔吸附树脂中的至少一种柱层析装置来进行。
18.根据权利要求17所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述柱层析相继使用0.1~2M NaCl及0.1~2M NaOH的水溶液作为洗脱剂。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的有效部位FYGL,其特征在于,所述方法还包括以下精制步骤:在所述柱层析之后且在所述干燥之前,用苯酚-硫酸法检测所得的洗脱组份,并收集反应阳性部分,然后用1kDa透析袋对所收集的反应阳性部分进行透析,以获得经过透析的精制物。
20.权利要求1至19中任一项所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为唯一的活性成分用于制备药物的用途,所述药物用于治疗或预防糖尿病以及代谢综合症中的至少一种疾病;或用于治疗或预防与糖尿病或代谢综合症相关的至少一种下述疾病:动脉粥样硬化、动脉硬化、肥胖症、高血压、高脂血症、脂肪性肝病、肾病、神经性病变、视网膜病变、足溃疡或白内障;或用于治疗选自高脂血症、肥胖症或恶病质的至少一种疾病。
21.权利要求1至19中任一项所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为唯一的活性成分用于制备药物的用途,所述药物用于治疗与选自蛋白酪氨酸磷酸酶-1B、α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶中的至少一种酶有关的疾病。
22.一种药物制剂,该制剂包含权利要求1至19中任一项所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为活性成分以及药学上可接受的载体,且不包含其他灵芝子实体提取物。
23.根据权利要求22所述的药物制剂,该药物制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、注射剂、口服液、混悬剂、滴丸剂、微丸剂、喷雾剂、气雾剂、巴布剂或帖剂。
24.根据权利要求22或23所述的药物制剂,所述有效部位FYGL在该药物制剂中是唯一的活性成分。
25.一种保健品制剂,所述保健品制剂包含权利要求1至19中任一项所述的灵芝子实体中的有效部位FYGL作为活性成分以及可食用的载体,且不包含其他灵芝子实体提取物。
26.根据权利要求25所述的保健品制剂,所述有效部位FYGL在该保健品制剂中是唯一的活性成分。
27.根据权利要求25或26所述的保健品制剂,该保健品制剂是片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、口服液、混悬剂、滴丸剂、微丸剂、喷雾剂、气雾剂、巴布剂或帖剂。
28.从灵芝子实体中提取有效部位FYGL的方法,所述有效部位FYGL是对蛋白酪氨酸磷酸酶-1B的活性半数抑制率IC50在80μg/mL以下的灵芝子实体提取物,所述方法包括:在0-20℃的碱提温度下,对灵芝子实体的脱脂产物进行碱提或对所述脱脂产物经过水提之后的滤渣和/或残渣进行碱提,以获得灵芝子实体的碱提物;对所述碱提物进行透析以去除小分子;然后对由所述透析获得的提取物直接进行干燥以获得所述有效部位FYGL,或对由所述透析获得的提取物进行分离后再进行所述干燥以获得所述有效部位FYGL。
29.根据权利要求28所述的方法,其特征在于,所述干燥是选自喷雾干燥、减压干燥、冷冻干燥或常压干燥中的至少一种。
30.根据权利要求28所述的方法, 其特征在于,所述碱提温度为4-15℃。
31.根据权利要求28所述的方法,其特征在于,所述脱脂产物是通过使用乙醇或乙醇水溶液对灵芝子实体进行脱脂而获得。
32.根据权利要求28所述的方法,其特征在于,所述碱提是使用包含选自碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠或氨水中的至少一种物质的水溶液进行提取。
33.根据权利要求32所述的方法,其特征在于,所述水溶液是0.5M以上的碳酸钠或碳酸氢钠溶液;或0.1~2M的氢氧化钾、氢氧化钠或氨水溶液。
34.根据权利要求28或30所述的方法,其特征在于,所述透析是使用1kDa-3kDa的透析袋进行透析,以去除1kDa-3kDa以下的小分子。
35.根据权利要求28-34中任一项所述的方法,其中,所述分离包括:
(1)进行醇沉,以获得上清液;或
(2)通过用分子量截留值为100kDa以下的超滤膜进行超滤分级,以去除重均分子量大于该截留值的物质。
36.根据权利要求35所述的方法,其特征在于,所述醇沉是用乙醇水溶液对由所述透析获得的提取物进行沉淀,再收集所述上清液。
37.根据权利要求35所述的方法,其特征在于,所述有效部位FYGL基本由分子量为1kDa至100kDa的物质组成。
38.根据权利要求35所述的方法,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:在所述分离之后且在进行所述干燥之前,对该提取物进行柱层析。
39.根据权利要求38所述的方法,其特征在于,所述柱层析使用选自DEAE-纤维素柱、DEAE-Sephadex柱、DEAE-Sepharose柱或大孔吸附树脂中的至少一种柱层析装置来进行。
40.根据权利要求38或39所述的方法,其特征在于,所述柱层析相继使用0.1~2M NaCl及0.1~2M NaOH的水溶液作为洗脱剂。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的方法,其特征在于,所述方法还包括以下精制步骤:在所述柱层析之后且在所述干燥之前,用苯酚-硫酸法检测所得的洗脱组份,并收集反应阳性部分,然后用1kDa透析袋对所收集的反应阳性部分进行透析。
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