CN101618075A - 中药连翘降血糖有效部位及其提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从连翘叶脂溶性部位提取制备抑制α－葡萄糖苷酶的有效部位，同时还涉及该有效部分的提取方法及应用。其提取方法包括以下步骤：将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中重复冷浸2－4次，每次6－8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得乙酸乙酯部位；第二步用正丁醇萃取三次，浓缩得正丁醇部位。经体外抑制α－葡萄糖苷酶筛选发现，乙酸乙酯部位及正丁醇部位具有好的抑制α－葡萄糖苷酶活性。本发明的正丁醇部位是在乙酸乙酯部位萃取过后的溶液，再用正丁醇萃取得到的。

Description

中药连翘降血糖有效部位及其提取方法和应用

技术领域

本发明涉及一种从连翘叶脂溶性部位提取制备抑制α-葡萄糖苷酶的有效部位，同时还涉及该有效部分的提取方法及应用。

背景技术

糖尿病是一种以高血糖为特征，代谢紊乱为表现，与胰岛素分泌密切相关的全身性疾病，是由于遗传和环境因素相互作用而引起的临床综合症，是最普通的内分泌疾病之一。因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织对胰岛素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱。临床上出现三多(多食、多饮、多尿)、一少(体重下降)、高血糖症状。根据病因的不同，糖尿病可分为胰岛素依赖型糖尿病(1DDM，1型)和非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM，2型)。目前我国糖尿病患约1200万，全球约1.5亿，已成为威胁人类的第3位“健康杀手”，所以预防和治疗糖尿病已成为全球性的保健问题。多年来糖尿病的治疗主要以控制空腹血糖为目标，治疗药物长期以来主要集中于磺脲类与双胍类药物。近年来研究发现，餐后血糖也是糖尿病并发症发生的主要危险因子，餐后血糖是一天中血糖水平最高的阶段，其持续时间可达8小时之久或更长，长时间高水平的餐后血糖可加重糖尿病本身，使血糖进一步升高，如果在进餐时就能很好的控制高血糖，则可以避免其餐后血循环中的糖分堆积，因此，控制餐后血糖可以说是控制高血糖、防治糖尿病的重要举措。现有的糖尿病治疗药物中，磺脲类药物通过刺激胰岛素的分泌而降低血糖；双胍类药物则通过增加外周组织对葡萄糖的利用而降低血糖，两者对降低II型糖尿病病人空腹血糖均有较好疗效，但对降低餐后血糖的作用却非常有限。

食物中的绝大多数碳水化合物为淀粉与蔗糖等，淀粉先后经唾液及胰液中α-淀粉酶分解为寡糖，寡糖在小肠上皮细胞刷状缘处被Q-葡萄糖苷酶分解为葡萄糖而被吸收后，导致餐后血糖高峰，因此，抑制α-葡萄糖苷酶的活性成为降低餐后血糖的一个有效途径。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是七十年代后期研究开发出的一类新型口服降血糖药物，其作用机理在于：竞争性的抑制α-葡萄糖苷酶，延缓和阻碍碳水化合物的消化，延迟来自双糖、低聚糖及多糖的葡萄糖的吸收，有效推迟并减轻餐后血糖升高的时间及程度，长期服用还可以降低空腹血糖水平，此类药物对I、II型糖尿病均适用。α-葡萄糖苷酶抑制剂不仅对糖尿病有确切的疗效，而且对于肥胖症、慢性乙肝、艾滋病及肿瘤都有一定的治疗作用。目前用于临床的此类药物有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇。现有的此类药物成本较高，生产厂家很少，并具有肠道副作用。传统中药及天然植物药具有相对安全和价格低廉的特点，开发中药及天然植物药作为α-葡萄糖酶抑制剂可以提供更广泛的糖尿病治疗药物来源。

连翘(Forsythia suspense(thumb.)Vahl)为木犀科连翘属植物，性微寒，味苦，归肺、心、小肠经。具有清热解毒，消肿散结之功效，主治痈疽、瘰疬、温热、丹毒、小便淋闭等症。连翘的茎、叶、果实、根均可入药，传统以果实入药，随着一些学者的研究，连翘叶化学工作与药理研究发现，连翘叶中的化学成分与果实中有极大的相似度，且连翘叶也具有良好的药理活性，如连翘叶茶具有清除自由基和抗氧化作用，作为一种纯天然的预防和治疗有活性氧引起的各种疾病(如衰老、心脑血管、高血压、老年性痴呆症甚至癌症等)的药物及新型的天然食品抗氧化剂具有广泛的应用前景。但目前，对连翘叶的应用开发主要集中在抗氧化和降血脂等方面，未见其在降血糖方面即α-糖苷酶抑制剂的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种中药连翘降血糖有效部位，即从连翘叶脂溶性部位提取制备乙酸乙酯有效部位和正丁醇有效部位。

同时，本发明的目的还在于提供该有效部位的提取方法。

另外，本发明的目的还在于提供一种降血糖有效部位在制备抑制α-葡萄糖苷酶活性药物方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种中药连翘降血糖有效部位，该有效部位为连翘叶或连翘果实经丙酮与水提取后经浓缩萃取而得到正丁醇部位和乙酸乙酯部位。

本发明的技术方案还在于采用了一种中药连翘降血糖有效部位的提取方法，包括以下步骤：将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中重复冷浸2-4次，每次6-8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得乙酸乙酯部位；第二步用正丁醇萃取三次，浓缩得正丁醇部位。

所述的丙酮与水的体积比丙酮∶水＝(6-8)∶(2-4)。

本发明的技术方案还在于采用了中药连翘降血糖有效部位在制备降血糖药物方面的应用。

进一步地讲，中药连翘降血糖有效部位在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

同时，本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物(+)-松脂素在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。其中，单体化合物(+)-松脂素也可以用其它方法分离获得。

本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物(-)-松脂素在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。其中，单体化合物(-)-松脂素也可以用其它方法分离获得。

进一步，本发明的技术方案还采用了一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到单体化合物对羟基苯甲酸异丁酯在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。其中，单体化合物对羟基苯甲酸异丁酯也可以用其它方法分离获得。

经体外抑制α-葡萄糖苷酶筛选发现，乙酸乙酯部位及正丁醇部位具有好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。本发明的正丁醇部位是在乙酸乙酯部位萃取过后的溶液，再用正丁醇萃取得到的。

更进一步地讲，将乙酸乙酯部位进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-乙酸乙酯按体积不同比例洗脱，洗脱物经过凝胶柱层析，减压柱等反复纯化得到单体化合物(+)-松脂素、(-)松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯。

乙酸乙酯部位进一步制备而得的单体化合物经鉴定为(+)-松脂素、(-)松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯，其结构式为：

(+)-松脂素    (-)-松脂素    对羟基苯甲酸异丁酯

化合物(+)-松脂素、(-)-松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯，经体外抑制α-葡萄糖苷酶活性实验表明，具有良好的抑制α-葡萄糖苷酶活性。

具体实施方式

实施例1

本实施例的有效部位——乙酸乙酯部位的制备方法如下：取干燥连翘叶，在丙酮与水形成的溶液中冷浸3次，其中，丙酮与水的体积比为7∶3，每次7天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物。将浓缩的提取物分散在水中，用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得乙酸乙酯部位。

实施例2

本实施例的有效部位——正丁醇部位的制备方法如下：将实施例1的萃取剩余溶液用正丁醇萃取三次，浓缩得正丁醇部位。

实施例3

取实施例1制得的乙酸乙酯部位，进行硅胶常压柱(200-300目)层析，石油醚-乙酸乙酯不同比例洗脱，洗脱物经过凝胶柱层析和减压柱等分离手得到了化合物单体化合物(+)-松脂素、(-)松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯。

结构鉴定：

【化合物名称】(+)-松脂素

【性状】白色无定形粉末

【鉴定】分子式：C₂₀H₂₂O₆，分子量：358

仪器材料：熔点用四川科学仪器厂生产的XRC-1型显微熔点仪测定，温度计未校正；¹H，¹³C NMR图谱由Bruker Am-400MHz核磁共振仪测定。

¹H-NMR(400MHz，CD₃Cl)δ：6.90(2H，d，J＝8.04Hz，H-2′，2″)，6.83(2H，d，J＝1.48Hz，H-5′，5″)，6.82(2H，dd，J＝1.8，8.2Hz，H-6′，6″)，5.66(2H，s，4′，4″-OH)，4.74(2H，d，J＝3.98Hz，H-2，6)，4.24(2H，dd，J＝9.1，6.9Hz，H-4，8)，3.87(2H，dd，J＝9.1，3.7Hz，H-4，8)，3.10(2H，m，H-1，5)，3.90(6H，s，3′，3″-OCH₃)。¹³C-NMR(400MHz，CD₃Cl)δ：146.7(C-3′，3″)，145.2(C-4′，4″)，132.9(C-1′，1″)，118.9(C-6′，6″)，114.3(C-5′，5″)，108.6(C-2′，2″)，85.9(C-2，6)，71.6(C-4，8)，54.1(C-1，5)，55.9(3′，3″-OCH₃)。

【化合物名称】(-)松脂素

【性状】白色无定形粉末

【鉴定】分子式：C₂₀H₂₂O₆，分子量：358

¹H-NMR(CD₃Cl)δ：6.92～6.81(6H，m，H-2，5，6，2′，5′，6′)，4.87(1H，d，J＝5.14，H-7′)，4.44(1H，d，J＝7.03，H-7)，3.90(6H，s，2×OMe)，3.86，4.12(each 1H，m，H-9)，3.86，3.32(each 1H，m，H-10)，3.35(1H，m，H-8′)，2.9(1H，m，H-8)。¹³C-NMR(CD₃Cl)δ：133.1(C-1)，130.4(C-1′)，108.6(C-2)，108.4(C-2′)，146.5(C-3)，146.7(C-3′)，144.7(C-4)，145.4(C-4′)，114.3(C-5)，114.3(C-5′)，119.2(C-6)，118.4(C-6′)，87.8(C-7)，82.1(C-7′)，54.5(C-8)，50.2(C-8′)，69.7(C-9)，71.0(C-9′)。

【化合物名称】对羟基苯甲酸异丁酯

【性状】黄色油状物

【鉴定】分子式：C₂₁H₁₄O₂，分子量：182

¹H-NMR(CD₃Cl)δ：7.71(2H，dd，J＝3.3，5.6，H-2，H-6)，7.50(2H，dd，J＝3.2，5.5，H-3，H-5)，4.08(2H，d，J＝8.2，H-8)，δ2.01(1H，m，H-9)，0.94(6H，d，J＝8.2，H-10，H-11)。¹³C-NMR(CD₃Cl)δ：167.6(C-7)，132.4(C-1)，132.3(C-4)，130.8(C-3)，130.8(C-5)，128.8(C-2)，128.8(C-6)，71.7(C-8)，27.7(C-9)，19.1(C-10)，δ19.1(C-11)。

实施例4

本实施例为降血糖有效部位的应用例。

抑制α-糖苷酶活性实验

方法：微孔板法

原理：α-D-葡萄糖苷酶催化水解4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(pNP-G)，产生硝基苯酚(PNP，黄色物质，在400nm左右有最大吸收)，α-糖苷酶抑制剂可抑制α-葡萄糖苷酶与底物结合从而降低PNP的释放量。以一定时间内反应体系中PNP的含量变化来计算提取物的酶抑制活性。

仪器：Multiskan MK3酶标仪(热电上海仪器有限公司)，96微孔板，各种规格移液器，LRH-150生化培养箱(上海一恒科技有限公司)。

试剂：α-葡萄糖苷酶(Sigma公司，EC 3.2.1.20，from baker’s yeast，批号：105K1313)，对-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG，Sigma公司，批号：026K1516)，磷酸盐缓冲液(PH 6.8)，阿卡波糖(拜糖平，Sigma公司，批号：16869)，其他试剂均为分析纯。

检测方法：

112μL磷酸钾缓冲液(pH6.8)，加入20μL(浓度为0.2U/mL)α-葡萄糖苷酶，8μL样品溶液，37℃恒温15min，加入20μL 2.5mmol/L PNPG，37℃恒温反应15min。再加入80μL(浓度为0.2mol/L)的终止剂Na₂CO₃溶液，于405nm波长下测OD值。实验共设4个组，每组三孔，分别为：a.阴性对照组；b.空白组；c.样品测定组；d.样品对照组。按下面方法计算抑制率，并用Origin软件求出相应IC₅₀值。

抑制率计算：

分别利用上述测定方法测定了正丁醇部位、乙酸乙酯部位、化合物(+)-松脂素、(-)-松脂素、对羟基苯甲酸异丁酯和阳性对照阿卡波糖的IC₅₀。

实验结果如表1所示。

表1IC₅₀测定结果

由表1可知正丁醇部位、乙酸乙酯部位、化合物(+)-松脂素、(-)-松脂素和对羟基苯甲酸异丁酯IC₅₀均小于阳性对照阿卡波糖，活性明显。

最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1、中药连翘降血糖有效部位，其特征在于：该有效部位为连翘叶或连翘果实经丙酮与水提取后经浓缩萃取而得到正丁醇部位和乙酸乙酯部位。

2、一种如权利要求1所述的中药连翘降血糖有效部位的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：将连翘叶或连翘果实在丙酮与水形成的混合溶液中重复冷浸2-4次，每次6-8天，过滤，合并滤液减压回收溶剂得浓缩物，将浓缩的提取物分散在水中，第一步用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得乙酸乙酯部位；第二步用正丁醇萃取三次，浓缩得正丁醇部位。

3、根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于；所述的丙酮与水的体积比丙酮∶水＝(6-8)∶(2-4)。

4、中药连翘降血糖有效部位在制备降血糖药物方面的应用。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：中药连翘降血糖有效部位在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

6、一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物(+)-松脂素在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

7、一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物(-)-松脂素在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。

8、一种中药连翘降血糖有效部位即乙酸乙酯部位分离得到的单体化合物对羟基苯甲酸异丁酯在制备α-葡萄糖苷酶抑制剂类药物方面的应用。