CN104945452A - 一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种新颖的通式(Ⅰ)所示的连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物。其中：R₁＝H，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝C_nH_2n+1或R₁＝C_nH_2n+1，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝H或R₁-R₂＝-CH₂-，R₃＝C_nH_2n+1；n＝1～30。本发明还涉及该化合物的制备方法及以该化合物为活性成分的药物组合物，以及本发明化合物在抗病毒病症中的应用。

Description

一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于药物技术领域，尤其涉及连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物制备方法及在抗病毒方面的作用。

背景技术

连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物，是从木犀科(Oleaceae)连翘属植物连翘(Forsythiasuspensa(Thunb.)vahl)的干燥叶中提取的有效成分。连翘作为中药应用，已有两千年历史，始见于《神农本草经》。《神农本草经》上载：“主寒热，痈肿恶疮，结热，鼠瘘瘰疬。”

Murakami首次从连翘果实中得到齐墩果酸以来，连翘及其同属植物中已有六十余种成分见诸报道、其主要含萜类、苯乙醇及其甙类、木脂素类、黄酮类和一些醇、酯、醚和酮等类化合物。

连翘属中的木脂素成分主要为木脂内酷和双环氧木脂素。1978年，Nishibe等从连翘中分得了arctigenin，mataresinol，arctiin和matairesinoside。1985年，Tsukamoto等从连翘果实中分得了phillygenin，(+)-pinoresinol，phillyrin，(+)-pinoresnol-β-D-glucoside和(+)-epinoresinol-4-O-glucoside。1997年，刘冬雷等又从连翘果实中分得了(+)松脂素单甲基醚-β-D-葡萄糖营(pinoresinolmonomethylether-β-D-gluco-side)。近来生合成研究表明，连翘属中木脂素前体是松伯醇，已知连翘属中木脂素及其苷的3，3’位全是甲氧基取代，4，4’位可以是羟基，甲氧基取代或与糖成苷。

三种连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物系首次从连翘叶中发现，葡萄糖醛酸衍生物具有良好的活性。例如青蒿素葡萄糖醛酸衍生物(Efficient Preparations of theβ-Glucuronides of Dihydroartemisinin and Structural Confirmation of the Human Glucuronide Metabolite.Paul M.O'Neill，Feodor Scheinmann，Andrew V. Stachulski，James L.Maggs，and B.Kevin Park.J.Med.Chem.，2001，44(9)，pp 1467–1470)、依达拉奉葡萄糖醛酸衍生物(Synthesis of the metabolites of a free radical scavenger edaravone(MCI-186，Radicut^TM).Kazutoshi Watanabe，Masao Taniguchi，Masaki Shinoda.Redox Report，Vol.8，No.3，2003，157-161)、风车子素A-1葡萄糖醛酸衍生物(Regio-and Stereospecific Synthesis of Mono-β-d-Glucuronic Acid Derivatives of Combretastatin A-1.Rajendra P.Tanpure，Tracy E.Strecker，David J.Chaplin，Bronwyn G.Siim，Mary Lynn Trawick and Kevin G.Pinney.J.Nat.Prod.，2010，73(6)，pp 1093–1101)、白藜芦醇葡萄糖醛酸衍生物(WANG LAIXI；Heredia，A.；Song，HJ；ZHANG ZHAOJUN；YU BIAO；Davis，C.；Redfield，R.Resveratrol glucuronides as the metabolites of resveratrol in humans：Characterization，synthesis，and anti-HIV activity.J.Pharm.Sci.2004，93(10)，2448-2457)和姜黄素葡萄糖醛酸衍生物(K.S.Psrvathy，M.Sc.University of Mysore.2009)等等。因此我们研究了三种连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物的制备方法，并进行了药理研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的抗病毒药物来源，连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物、其制备方法和其抗病毒的应用，本发明提供的连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物具有抗病毒的作用，可用于制备用于治疗和预防流感病毒的药物或保健品；连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法工艺简单，操作方便，适合工业化放大生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种结构通式如式(Ⅰ)所示的连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物：

其中：R₁＝H，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝C_nH_2n+1或R₁＝C_nH_2n+1，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝H或R₁-R₂＝-CH₂-，R₃＝C_nH_2n+1；n＝1～30。

其中，所述取代基的n＝1。

本发明另一方面提供一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶与提取溶剂水混合后加热，进行煎煮提取2-3次，收集、合并提取液，获得连翘水提液；

2)将连翘水提液采用大孔树脂柱进行分离处理，收集、合并洗脱液，得到连翘树脂柱洗脱液；

3)对连翘树脂柱洗脱液进行干燥处理，然后进行硅胶柱层析处理，分段收集洗脱液，洗脱液分别干燥，即得。

其中，步骤1)中所述加热提取次数优选为2次。

特别是，每次煎煮提取过程中，所述连翘叶与提取溶剂水的重量配比为1：6-10，优选为1：8-10。

尤其是，第一次煎煮过程中，所述连翘叶与提取溶剂水的重量配比为1：9-10；第二次煎煮过程中，所述连翘叶与提取溶剂水的重量配比为1：8。

特别是，还包括将步骤1)获得的连翘水提液进行浓缩处理，制成连翘浓缩液后再进行所述的大孔树脂柱分离处理。

尤其是，浓缩处理后获得的连翘浓缩液的体积与连翘叶的重量之比为1-5：1，优选为2-2.5：1。

其中，步骤2)中所述大孔树脂柱层析处理包括以下顺序进行的步骤：首先将连翘水提液注入大孔树脂柱，接着采用水为洗脱剂进行洗脱，然后采用质量百分比浓度为3-50％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱，最后采用无水乙醇为洗脱剂进行洗脱，收集无水乙醇洗脱液，获得连翘-大孔树脂洗脱液。

特别是，大孔树脂柱层析过程中，连翘叶水提液中连翘叶的重量与大孔树脂体积之比为1：0.8-2.5，优选为1：1。

尤其是，大孔树脂柱分离处理过程中，大孔树脂柱的柱直径与树脂的柱高之比为1：5-10，优选为1：5-7，进一步优选为1：5.5-5.9。

其中，步骤2)中所述的大孔吸附树脂选择X-5、AB-8、NK-2、NKA-2、NK-9、D3520、D101、WLD中的一种，优选为X-5、AB-8。

特别是，采用水为洗脱剂进行洗脱过程中，水的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-4：1，优选为4：1；采用质量百分比浓度为3-50％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱过程中，质量百分比浓度为3-50％的乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-8：1，优选为4-8：1，进一步优选为8：1；采用无水乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱过程中，无水乙醇溶液的用量与大孔树脂柱的柱体积之比为2-8：1，优选为4-8：1，进一步优选为8：1。

其中，步骤3)中所述硅胶柱层析处理包括如下顺序进行的步骤：

A)对连翘树脂柱洗脱液进行浓缩、干燥处理，制得连翘粗品；

B)将连翘粗品用水溶解后注入硅胶柱，进行硅胶柱层析处理，分段收集洗脱液，洗脱液分别干燥，即得。

特别是，步骤B)中所述硅胶柱选择反相硅胶柱。

其中，所述反相硅胶柱中填料选择C18反相硅胶；粒径5～10μm。

特别是，所述反相硅胶柱的柱内径10～100mm、长度100～300mm；优选为柱内径22.2mm、长度250mm。

其中，所述硅胶柱层析选择高效液相色谱柱。

特别是，所述硅胶柱层析过程中流动相选择甲醇(A)和水(B)的混合液。

其中，甲醇与水的体积之比为8：2-10：1。

特别是，硅胶柱层析过程中柱温20～35℃；流速4～30ml/min。

特别是，硅胶柱层析过程中流动相以等度或梯度洗脱的方式洗脱样品。

其中，梯度洗脱[0min(30％A)→25min(50％A)→50min(50％A)；流速为4.0mL/min；柱温20℃；检测波长为273nm。

特别是，所述硅胶柱层析的色谱条件如下：以C18反相硅胶为填充剂(Φ22.2×250mm，10μm)；甲醇(A)-水(B)为流动相；梯度洗脱[0min(30％A)→25min(50％A)→50min(50％A)；流速为4.0mL/min；柱温20℃；检测波长为273nm。

特别是，所述硅胶柱层析的色谱条件如下：以C18反相硅胶为填充剂(Φ22.2×250mm，10μm)；甲醇(A)-水(B)为流动相；梯度洗脱：0～25min，甲醇30％～50％；25～50min，甲醇50％～50％，流速4ml/min，柱温为20℃，紫外检测波长为273nm。

通过上述方法制备而成的连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物为化合物I、Ⅱ、Ⅲ，其结构确认分析如下：

化合物I：33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

ESI-MS：m/z 533.1658[M-H]^-，分子量为：534；分子式为：C₂₆H₃₀O₁₂。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):172.75(C-17)，149.51(C-9)，148.95(C-34)，148.09(C-33)，145.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，118.55(C-12)，118.05(C-31)，115.72(C-13)，112.03(C-32)，111.07(C-10)，109.92(C-35)，100.21(C-2)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-5)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，55.99(C-38)，54.47(C-29)，49.79(C-25)。

化合物Ⅱ：9-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

ESI-MS m/z 533.1641[M-H]^-，分子量为：534；分子式为：C₂₆H₃₀O₁₂。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):173.72(C-17)，149.51(C-33)，148.95(C-34)，148.09(C-9)，144.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，121.45(C-12)，119.72(C-31)，118.05(C-13)，115.07(C-10)，113.03(C-32)，109.92(C-35)，100.21(C-2)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-5)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，55.99(C-38)，54.47(C-29)，50.16(C-25)。

化合物Ⅲ：33，34-亚甲基二氧-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷

ESI-MS m/z 531.4933[M-H]^-，分子量为：532；分子式为：C₂₆H₂₈O₁₂。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，6.12(2H，s)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):169.75(C-17)，149.51(C-9)，148.95(C-34)，148.09(C-33)，145.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，118.55(C-12)，118.05(C-13)，115.72(C-31)，112.03(C-32)，111.07(C-10)，109.92(C-35)，101.21(C-2)，100.29(C-38)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-16)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，54.47(C-29)，49.79(C-25)。

本发明方法通过大孔吸附树脂柱纯化，去除绝大多数杂质，大孔吸附树脂可以回收再利用，从而降低了生产成本，增加下一步半制备色谱柱使用寿命。该工艺简便易操作、提取效率高、污染小、所得产品纯度高、易于实现工业化生产。

本发明又一方面提供上述连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的抗病毒应用。

本发明再一方面提供上述连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物在制备预防或/和治疗流感病毒药物中的用途。

其中，本发明提供含连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的具有抗病毒功效的药物或保健品组合物。

特别是，所述药物组合物，其包括本发明连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物，以及药学上可接受的辅料。

连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物的制备方法及在预防和治疗流感病毒药物中的用途，同时并不限于该类化合物，还包括以此类化合物为母核，通过合成，发酵等方法所制备的衍生物。

在本文中，药学上可接受的辅料指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、载体、pH调节剂、离子强度调节剂、缓释或控释剂、包裹材料或其他制剂辅料。所用载体可与相应的给药形式相适应，可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成注射剂、(注射用)冻干粉、喷雾剂、口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂。优选本发明第一方面的4-去 甲基连翘脂素葡萄糖醛酸苷通过注射或经消化道方式给药，因此，本发明的药物组合物优选为注射剂或经消化道给药的制剂，即适于配制成注射和经消化道方式给药的辅料特别优选的。其中，“经消化道给药”在本文中指药物制剂通过患者消化道的给药方式，包括口服、灌胃给药和灌肠给药等，优选是口服，如可使用本领域技术人员所知晓的辅料配成口服溶液、口服混悬液、片剂、胶囊、肠溶片、丸剂、粉剂、颗粒剂、持续释放或延迟释释放等制剂；其中，注射给药的制剂主要是针剂和粉针剂。

本发明的新的化合物连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物具有抗病毒的功效，可用于制备抗病毒、解热、镇痛、抗炎药物或保健品，连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法操作工艺条件容易控制，质量可控性强，得率高，耗能低，环保，适宜工业化大规模生产。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。

实施例1

1、煎煮处理 

1-1)连翘叶粉碎并过20目筛，得连翘叶粉，接着向连翘叶(1kg)中加入水(10kg)，混合均匀后加热，进行第一次煎煮处理，加入的水与连翘叶的重量之比为10：1，加热沸腾，煎煮提取2h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入水(8kg)，加热沸腾，进行第二次煎煮处理，加入的水与连翘叶的重量之比为8：1，煎煮提取时间1h后进行过滤，获得第二提取液，药渣(弃去)；

1-3)合并第一、第二提取液，制得连翘水提液；

1-4)将连翘水提液置于减压旋转蒸发器中进行减压浓缩处理，回收溶剂，获得连翘浓缩液(2L)，连翘叶的重量与连翘浓缩液的体积之比为1：2，备用。

2、大孔树脂柱层析

2-1)将连翘浓缩液上样于大孔树脂柱上，进行大孔树脂柱分离处理，其中，大 孔吸附树脂选择AB-8型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂柱内大孔吸附树脂的柱体积为1L(层析柱的直径60mm，高500mm，内装树脂高度为354mm)，树脂柱内树脂的体积与连翘叶重量(干重)之比为1：1(即如果连翘叶干重1公斤，大孔树脂的体积是1L；如果药材干重1g，则大孔树脂的体积为1ml)，待浓缩后的上清液完全流入树脂柱后，先用4倍柱体积(即4L)的水洗涤，弃去洗脱液；接着用8倍柱体积(即8L)的质量百分比浓度为3％的乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液；然后再用8倍柱体积(即8L)的无水乙醇洗脱，收集洗脱液，得连翘-大孔树脂洗脱液；

2-2)将连翘-大孔树脂洗脱液置于旋转蒸发器中进行减压浓缩处理，回收溶剂，浓缩残留物进行干燥，得连翘粗品62g；

3、硅胶柱层析 

3-1)称取连翘粗品0.5g，加入适量(2.5ml)水，搅拌溶解，备用；

3-2)采用高效液相色谱仪(日本岛津SCL-10AVP半制备型高效液相色谱仪，LC-8A泵，SPD-20A监测器)对连翘粗品进行层析处理，分离纯化连翘粗品，将溶解后的连翘粗品注入(即上样于)半制备型高效液相色谱仪中，采用甲醇-水溶液为洗脱液进行梯度洗脱，其中：高效液相色谱仪中色谱柱尺寸为Φ22.2×250mm，C18反相硅胶填料为，粒径为10um，上样量500mg，流动相为甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0～25min，甲醇30％～50％；25～50min，甲醇50％～50％，流速4ml/min，柱温为20℃，紫外检测波长为273nm，分别收集保留时间在25.5～27.5min，30.5～32.5min，35.5～37.5min的流份；

3-3)将收集的3个流份分别进行减压浓缩，真空干燥，分别得化合物I(70.5mg)，化合物Ⅱ(53.2mg)，化合物Ⅲ(46.6mg)。

采用HPLC法检查制得的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，HPLC检测条件为：仪器：Water 515泵，2487检测器；色谱柱：Kromasil RP-C18；流动相：乙腈：0.1％磷酸水溶液(13：87)；检测波长：230nm；流速：1.0ml/min。

经HPLC检测化合物Ⅰ为99.6％、化合物Ⅱ的纯度为98.1％、化合物Ⅲ的纯度为98.3％。

化合物I为白色固体，熔点：111℃；溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇3：1，Rf为0.25)，喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。

ESI-MS：m/z 533.1658[M-H]^-，分子量为：534。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):172.75(C-17)，149.51(C-9)，148.95(C-34)，148.09(C-33)，145.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，118.55(C-12)，118.05(C-31)，115.72(C-13)，112.03(C-32)，111.07(C-10)，109.92(C-35)，100.21(C-2)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-5)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，55.99(C-38)，54.47(C-29)，49.79(C-25)。

根据ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测试数据，确定化合物I为33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，英文名：33-Hydroxy phillygenin-8-O-β-D-glucuronide，结构式为：

化合物Ⅱ为白色固体，熔点：113℃；溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇3：1，Rf为0.32)，喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。

ESI-MS m/z 533.1641[M-H]^-，分子量为：534。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H， s，Ar-H)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d，J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):173.72(C-17)，149.51(C-33)，148.95(C-34)，148.09(C-9)，144.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，121.45(C-12)，119.72(C-31)，118.05(C-13)，115.07(C-10)，113.03(C-32)，109.92(C-35)，100.21(C-2)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-5)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，55.99(C-38)，54.47(C-29)，50.16(C-25)。

根据ESI-MS、¹H-NMR和¹³C-NMR的测试数据，确定化合物Ⅱ为9-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，英文名：9-Hydroxy phillygenin-8-O-β-D-glucuronide，

结构式为： 

化合物Ⅲ为白色固体，熔点：119℃；溶于水、乙醇。在TLC板上展开(层析液为氯仿/甲醇3：1，Rf为0.36)，喷雾10％H₂SO₄-乙醇试剂呈现紫红色。

ESI-MS m/z 531.4933[M-H]^-，分子量为：532。

核磁共振氢谱(400MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):12.0(1H，s，COOH)，7.119-7.099(1H，d，J＝8.0Hz，Ar-H)，6.530-6.943(2H，d，J＝4.0Hz，Ar-H)，6.872(3H，s，Ar-H)，6.12(2H，s)，5.39(2H，s，J＝4.8Hz)，5.23(1H，d，J＝4.8Hz)，5.1(1H，d， J＝4.8Hz)，4.800(1H，d，J＝4.8Hz)，4.374-4.388(1H，d，J＝9.6Hz)，4.105-4.085(1H，d，J＝8.0Hz)，4.005-3.982(1H，d，J＝9.2Hz)，3.75(8H，d，J＝8.4Hz)，3.422(1H，t，J＝8.7Hz)，3.08(1H，t，J＝8.1Hz)，2.85(1H，d，J＝7.2Hz)；

核磁共振碳谱(100MHz，d₆-DMSO)：δ(ppm):169.75(C-17)，149.51(C-9)，148.95(C-34)，148.09(C-33)，145.74(C-8)，136.26(C-11)，131.67(C-30)，118.55(C-12)，118.05(C-13)，115.72(C-31)，112.03(C-32)，111.07(C-10)，109.92(C-35)，101.21(C-2)，100.29(C-38)，87.11(C-26)，81.74(C-22)，76.26(C-6)，75.70(C-3)，73.41(C-16)，71.91(C-4)，70.81(C-28)，69.46(C-24)，56.15(C-21)，54.47(C-29)，49.79(C-25)。

根据ESI-MS、1H-NMR和13C-NMR的测试数据，确定化合物Ⅲ为33，34-亚甲基二氧-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，英文名：33,34-Methylenedioxy phillygenin-8-O-β-D-glucuronide，

结构式为： 

实施例2

1、煎煮处理 

1-1)连翘叶粉碎并过20目筛，得连翘叶粉，接着向连翘叶(1kg)中加入水(9kg)，混合均匀后加热，进行第一次煎煮处理，加入的水与连翘叶的重量之比为9：1，加热沸腾，煎煮提取2.5h后进行过滤，获得第一提取液，第一药渣；

1-2)向第一药渣中加入水(8kg)，加热沸腾，进行第二次煎煮处理，加入的水 与连翘叶的重量之比为8：1，煎煮提取时间1h后进行过滤，获得第二提取液，药渣(弃去)；

1-3)合并第一、第二提取液，制得连翘水提液；

1-4)将连翘水提液置于减压旋转蒸发器中进行减压浓缩处理，回收溶剂，获得连翘浓缩液(2.5L)，连翘叶的重量与连翘浓缩液的体积之比为1：2.5，备用。

2、大孔树脂柱层析

2-1)将连翘浓缩液上样于大孔树脂柱上，进行大孔树脂柱分离处理，其中，大孔吸附树脂选择X-5型大孔吸附树脂，大孔吸附树脂柱内大孔吸附树脂的柱体积为1L(层析柱的直径60mm，高500mm，内装树脂高度为354mm)，树脂柱内树脂的体积与连翘叶重量(干重)之比为1：1(即如果连翘叶干重1公斤，大孔树脂的体积是1L；如果药材干重1g，则大孔树脂的体积为1ml)，待浓缩后的上清液完全流入树脂柱后，先用8倍柱体积(即8L)的去离子水洗涤，弃去洗脱液；接着用4倍柱体积(即4L)的质量百分比浓度为3％的乙醇溶液洗脱，弃去洗脱液；然后再用8倍柱体积(即8L)的无水乙醇洗脱，收集洗脱液，得连翘-大孔树脂洗脱液；

2-2)将连翘-大孔树脂洗脱液置于旋转蒸发器中进行减压浓缩处理，回收溶剂，浓缩残留物进行干燥，得连翘粗品58g；

3、硅胶柱层析 

3-1)称取连翘粗品0.8g，加入适量(1.6ml)水，搅拌溶解，备用；

3-2)采用高效液相色谱仪(日本岛津SCL-10AVP半制备型高效液相色谱仪，LC-8A泵，SPD-20A监测器)对连翘粗品进行层析处理，分离纯化连翘粗品，将溶解后的连翘粗品注入(即上样于)半制备型高效液相色谱仪中，采用甲醇-水溶液为洗脱液进行梯度洗脱，其中：高效液相色谱仪中色谱柱尺寸为Φ22.2×250mm，C18反相硅胶填料为，粒径为10um，上样量800mg，流动相为甲醇-水溶液，梯度度洗脱条件为，0～25min，甲醇30％～50％；25～50min，甲醇50％～50％，流速4ml/min，柱温为20℃，紫外检测波长为273nm，分别收集保留时间在25.5～27.5min，30.5～32.5min，35.5～37.5min的流份；

3-3)将收集的3个流份分别进行减压浓缩，真空干燥，分别得化合物A(104.2mg)，化合物B(74.3mg)，化合物C(58.1mg)。

采用HPLC法检查制得的化合物A、B、C的含量，HPLC检测条件为：仪器： Water 515泵，2487检测器；色谱柱：Kromasil RP-C18；流动相：乙腈：0.1％磷酸水溶液(13：87)；检测波长：230nm；流速：1.0ml/min。

经HPLC检测化合物A为99.3％、化合物B的纯度为98.4％、化合物C的纯度为98.5％。

实施例2制备的化合物A、B、C的理化特性、质谱、核磁共振数据分别与实施例1制备的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ相同。

试验例1体外抗病毒试验

1.1试验材料

(1)药物

①受试药物 

本发明实施例1制备的连翘脂素葡萄糖醛酸苷类衍生物(即化合物I、Ⅱ、Ⅲ)；

②阳性对照药 

利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物；

磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所，产品批号：101096-200901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物；

连翘脂素，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.2％。

上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为本次试验待测药物。

(2)细胞株

Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。

(3)病毒株

①流感病毒株、副流感病毒株、呼吸道合胞病毒(RSV)株：购于中国预防医学科学院病毒研究所；②柯萨奇病毒B3(CVB3)株：购自中科院武汉病毒所；③柯萨奇病毒A16(CoxA16)株、肠道病毒EV71株：购自日本仙台国立医院；④腺病毒(AdV)：购于白求恩医科大学一院儿科研究室；⑤单纯疱疹病毒I型(HSV-1)：购于中国药品生物制品检定所。

(4)主要设备与试剂

生物安全柜：BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH；CO2培养箱：MCO-18AIC，SANYO；倒置显微镜：CKX41，OLYMPUS；电子分析天平：AR1140/C，DHAUS；培养基：DMEM，HyClone；胎牛血清：HyClone；胰蛋白酶：Gibco；MTT：Sigma；DMSO：天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2试验方法

(1)细胞准备

Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×10⁷个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。

(2)药物毒性测定 

细胞毒性试验：将药物按表1-1所示浓度进行用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀释，用于细胞毒性测定。

表1-1药物细胞毒性试验浓度(单位：g/L)

将表1-1中不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE(cytopathic effect，在体外实验中，通过细胞培养和接种杀细胞性病毒，经过一定时间后，可用显微镜观察到细胞变圆，坏死，从瓶壁脱落等现象，称之细胞病变作用。指病毒对组织培养细胞侵染后产生的细胞变性。利用此种病变效应可进行病毒定量。)并记录。72h后，每孔加入MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。 是一种黄颜色的染料。)溶液20μL(5mg·mL^－1)，继续孵育4h，吸出各孔培养液，每孔加入100μL DMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数毒性浓度(TC₅₀)。

(3)各种病毒TCID₅₀的测定

将各种病毒进行10倍梯度递减稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6不同稀释度，按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上，每孔100μL，每个稀释度6孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO₂中孵育2h，弃病毒液，随即每孔加细胞维持液100μL，置37℃，5％CO₂中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果，第7-8天判定结果并做好记录，以能使50％细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。

公式： ${\mathrm{LOgTCID}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\ΣPi}}{100}$

TCID₅₀：50％组织细胞感染量

XM：病毒最高浓度稀释度的对数

d：稀释度系数(倍数)的对数

Σpi：每个稀释度病变百分数的总和

(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响

取已长满单层细胞的培养板，吸出并弃去培养液，以100TCID₅₀对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO₂培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设利巴韦林注射液和磷酸奥司他韦为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS 18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。

ER％＝(药物处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值－病毒对照组平均OD值)×100％

1.3试验结果

(1)各种病毒的TCID₅₀

副流感病毒： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

流感病毒： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

CVB₃： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

HSV-1： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+30}{100}=4.8$

AdV： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+50}{100}=-4$

RSV： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

CoxA16： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

EV71： ${\mathrm{LogTCID}}_{50}=-2+0.5-\frac{100+100+100+50}{100}=-5$

(2)药物毒性测定结果

1)药物对细胞毒性的测定

各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)、半数毒性浓度(TC₅₀)见表1-2。

表1-2药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)

2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果

药物抗各种病毒的有效率及ANOVA法单因素方差分析结果，详见表1-3。

表1-3药物抗病毒有效率(ER％)统计表

注：与病毒对照组相比，*P<0.05，**P<0.01；与连翘脂素比，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-3结果显示，33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷(化合物Ⅰ)，9-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷苷(化合物Ⅱ)和33，34-亚甲基二氧-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷糖醛酸苷醛酸苷(化合物Ⅲ)对流感病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-I)、肠道病毒EV71的抑制率及有效率均超过90％，与病毒对照组相比差异明显，具有统计学意义。33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，9-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷苷和33，34-亚甲基二氧-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷糖醛酸苷醛酸苷对多种病毒的抗病毒疗效表现均优于连翘脂素、利巴韦林和磷酸奥司他韦的优势。

试验例2体内抗病毒试验

2.1实验材料

(1)实验动物

昆明小鼠，体重18～22g，雌雄各半性，购自大连医科大学实验动物中心，质量合格证号：SCXK(13)2012-0003。

(2)药物

①本发明实施例1制备的化合物I，即33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷；

②利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物；

③磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所，产品批号：101096-200901，100mg/支，作为本次试验阳性对照药物；

④连翘脂素，白色粉末，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器(紫外检测器和蒸发光散射检测器)面积归一化法测定，其纯度为99.2％。

上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为本次试验待测药物。

(2)检测仪器、试剂

2.2实验方法

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定

将流感病毒和副流感病毒(细胞裂解液)10倍递比稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的病毒液。取昆明种小鼠120只，流感病毒和副流感病毒组各60只，分别随机分成6组，乙醚轻度麻醉小鼠，滴鼻感染不同稀释度病毒液0.03mL/只。同时设空白对照，用生理盐水代替病毒悬液。以死亡和生存为观察指标，每天观察，直至感染后的14天。感染24h内死亡的为非特异死亡，不予统计，Karber法计算病毒液LD50。计算公式：[其中：LD₅₀：半数致死量；XM：病毒最高浓度稀释度的对数；d：稀释度系数(倍数)的对数；Σpi：每个稀释度病变百分数的总和]。

(2)33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究

1)试验动物及分组

取四周龄的昆明小鼠960只，进行2项试验。取小鼠480只，随机分成48组，每组10只，用于33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验，3次重复试验，每次取小鼠80只。另取小鼠480只，随机分成48组，每组10只，用于33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷对肺悬液病毒血凝滴度的测定试验，3次重复试验，每次取小鼠80只。

2)感染方法

在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。

3)给药方法及给药剂量

33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷组、利巴韦林和磷酸奥司他韦对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷高、中、低给药剂量分别为10.0、5.0、2.5mg/kg，利巴韦林阳性药给药剂量为58.5mg/kg，磷酸奥司他韦阳性药给药剂量为19.5mg/kg，连翘脂素组给药剂量为13.0mg/kg，每天一次，连续给药5d，病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。

4)观察指标

①肺指数测定 

小鼠用药后第5天，先禁食水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：

肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％；肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％。

②肺悬液病毒血凝滴度测定

分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，低温下置匀浆器研磨成匀浆，生理盐水稀释为10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上，每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液，混匀，置室温30min，观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点，以悬液稀释倍数表示其滴度。

2.3实验结果及分析

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定结果

实验组昆明种小鼠分别被滴鼻感染不同浓度流感病毒、副流感病毒液30μL，感染第3天前3组(病毒浓度为10^-1组、10^-2组、10^-3组)小鼠均出现不同程度的发病症状：耸毛、发抖、饮食减少等；第5天小鼠出现走路摇摆不定；第6天最高病毒 浓度组小鼠开始出现死亡，其余各组于感染后第7天陆续出现死亡现象。观察14天结束后，统计各组小鼠死亡数目，结果见下表1-4、1-5。计算该流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.9，副流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.5。

表1-4流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD₅₀。流感病毒的LogLD₅₀如下：

${\mathrm{LogLD}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\&Sigma;Pi}}{100}=-1+0.5-(80\%+60\%+40\%+20\%+0\%+0\%)=-2.9$

表1-5副流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD ₅₀ 。副流感病毒的LogLD₅₀如下：

${\mathrm{LogLD}}_{50}=\mathrm{XM}+\frac{1}{2}d-d\frac{\mathrm{\&Sigma;Pi}}{100}=-1+0.5-(90\%+70\%+40\%+30\%+10\%+0\%)=-2.5$

(2)33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用结果

①肺指数测定 

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数测定结果显示：与感染模型组比较，33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷浓度在2.25～10.0mg/kg/d范围内有 一定保护作用，肺指数均明显降低；33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷高剂量组对流感病毒和副流感病毒的疗效优于连翘脂素组(P<0.05)。试验结果见表1-6、1-7。

表1-6化合物Ⅰ对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率(n＝3)

与病毒对照组比较，*P<0.05，**P0.01；与连翘脂素组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-7化合物Ⅰ对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的影(n＝3)

与病毒对照组比较，*P<0.05，**P0.01；与连翘脂素组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

②肺悬液病毒血凝滴度测定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，感染模型组肺组织病毒血凝滴度(InX)分别为31.64和32.06，不同浓度33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷治疗5天后，肺组织病毒血凝滴度均有所下降，与感染模型组比较，差异有显著性，(P<0.01)； 其中，33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷中、高剂量组对流感、副流感病毒血凝滴度均明显低于模型组，抑制率均高于连翘脂素组，差异显著(P<0.05，p<0.01)。试验结果见表1-8、1-9。

表1-8化合物Ⅰ对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响(n＝3)

与病毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与连翘脂素组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

表1-9化合物Ⅰ对副流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响(n＝3)

与病毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与连翘脂素组比较，^#P<0.05，^##P<0.01。

2.4结论

体内抗病毒试验结果显示，33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷在2.25～10mg/kg/d的剂量范围对流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有较明显的抑制作用，能明显降低其肺指数和血凝滴度，肺组织病理学也有明显改善， 与病毒模型对照组比较差异显著；且33-羟基-连翘脂素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷中、高剂量组疗效明显优于连翘脂素(*P<0.05或**P<0.01)，同时表现出优于利巴韦林和磷酸奥司他韦的趋势。

化合物Ⅱ、Ⅲ与化合物Ⅰ相同，均具有对流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有较明显的抑制作用，能明显降低其肺指数和血凝滴度，肺组织病理学也有明显改善，与病毒模型对照组比较差异显著。

Claims (10)

1.一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物，结构通式如式(Ⅰ)：

其中：R₁＝H，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝C_nH_2n+1或R₁＝C_nH_2n+1，R₂＝C_nH_2n+1，R₃＝H或R₁-R₂＝-CH₂-，R₃＝C_nH_2n+1；n＝1～30。

2.如权利要求1所述的衍生物，其特征是所述n＝1。

3.一种连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的制备方法，其特征是，包括如下顺序进行的步骤：

1)将连翘叶与提取溶剂水混合后加热，进行煎煮提取2-3次，收集、合并提取液，获得连翘水提液；

2)将连翘水提液采用大孔树脂柱进行分离处理，收集、合并洗脱液，得到连翘树脂柱洗脱液；

3)对连翘树脂柱洗脱液进行硅胶柱层析处理，分段收集洗脱液，洗脱液分别干燥，即得。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤1)中每次煎煮过程中，所述连翘叶与提取溶剂水的重量配比为1：6-10。

5.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是还包括将步骤1)获得的连翘水提液进行浓缩处理，制成连翘浓缩液后再进行所述的大孔树脂柱分离处理。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征是浓缩处理后所制成的连翘浓缩液的体积与连翘叶的重量之比为1-5：1。

7.如权利要求3或4所述的制备方法，其特征是步骤3)中所述硅胶柱层析过程中选择C18的反相硅胶填料；色谱柱规格：内径10～100mm、长度10～300mm；填料粒径为5～10μm；流动相以等度或梯度洗脱的方式洗脱。

8.如权利要求7所述的制备方法，其特征是所述硅胶柱层析过程中流动相为甲醇与水的混合液，其中，甲醇与水的体积比为8：2～10：1。

9.如权利要求1所述连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物的抗病毒应用。

10.如权利要求1所述连翘脂素葡萄糖醛酸衍生物在制备预防或/和治疗流感病毒药物中的用途。