KR20170140260A - 필리게닌 글루쿠론산 유도체, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

필리게닌 글루쿠론산 유도체, 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하기 일반 화학식 (I)로 표현되는 필리게닌 글루쿠론산 유도체에 관한 것이다. 일반 화학식 (I)에서, R1은 H이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 CnH2n +1이거나; R1은 CnH2n +1이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 H이거나; R1-R2는 -CH2-이고, R3는 CnH2n+1이고; n은 1 내지 30이다. 본 발명은 또한 상기 화합물에 대한 제조 방법, 활성 성분으로서 상기 화합물을 갖는 약학적 조성물, 및 항바이러스 증상에서의 상기 화합물의 용도에 관한 것이다:

Description

필리게닌 글루쿠론산 유도체, 이의 제조 방법 및 용도
본 발명은 약물 기술 분야에 속하며, 특히 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법 및 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 항바이러스 효과에 관한 것이다.
필리게닌 글루쿠로니드 유도체는 물푸레나무과(Oleaceae) 포르시티아서스펜사(툰베리) 바흘(Forsythiasuspensa(Thunb.) vahl)의 건조된 잎으로부터 추출된 활성 성분이다. 중국 전통 약물로서 제공되는 포르시티아(forsythia)는 2천년의 역사 동안 적용되어 왔으며, 신농본초경(Shennong's Herbal Classic)에서 제시되기 시작하였다. 신농본초경에는 "포르시티아는 오한 및 발열, 큰종기, 악성 궤양, 병원성 열의 정체, 및 림프절결핵을 치료하는데 주로 사용된다"라고 기재되어 있다. 무라카미(Murakami)가 포르시티아 과일로부터 최초로 올레아놀산을 추출한 이래로, 포르시티아 및 이의 같은 속의 식물에서 60개 이상의 성분이 보고되었다. 상기 성분은 주로 테르펜, 펜에틸 알콜 및 이의 글리코시드, 리그난, 플라보노이드 및 일부 알콜, 에스테르, 에테르, 케톤 및 기타 화합물을 함유한다.
포르시티아 내의 리그난 성분은 주로 리그나놀리드 및 비스에폭시리그난이 언급된다. 니시베 등(Nishibe et al.)은 1978년에 포르시티아로부터 아르크티게닌(arctigenin), 마타레시놀(mataresinol), 아르크티인(arctiin) 및 마타이레시노시드(matairesinoside)를 추출하였다. 츠카모토 등(Tsukamoto et al.)은 1985년에 포르시티아 과일로부터 필리게닌, (+)-피노레시놀, 필리린, (+)-피노레시놀-β-D-글루코시드 및 (+)-에피노레시놀-4-O-글루코시드를 추출하였다. 류 동레이 등(Liu Donglei et al.)은 1997년에 포르시티아 과일로부터 (+)피노레시놀모노메틸에테르-β-D-글루코시드를 추출하였다. 최근의 생합성 연구는 포르시티아 내의 리그난 전구체가 코니페릴 알콜인 것을 제시한다. 공지된 포르시티아 내의 리그난 및 이의 글리코시드에 대해, 3,3'은 메톡시에 의해 전체적으로 치환되고, 4,4'은 하이드록실일 수 있거나, 메톡시에 의해 치환될 수 있거나, 당류와 함께 글리코시드를 형성할 수 있다.
3개의 필리게닌 글루쿠로니드 유도체가 포르시티아 잎으로부터 먼저 발견되었다. 글루쿠론산 유도체, 예를 들어, 아르테미시닌 글루쿠론산 유도체(Efficient Preparations of the β-Glucuronides of Dihydroartemisinin and Structural Confirmation of the Human Glucuronide Metabolite. Paul M. O'Neill, Feodor Scheinmann, Andrew V. Stachulski, James L. Maggs, and B. Kevin Park. J. Med. Chem., 2001, 44 (9), pp 1467-1470); 에다라본 글루쿠론산 유도체(Synthesis of the metabolites of a free radical scavenger edaravone (MCI-186, Radicut™). Kazutoshi Watanabe, Masao Taniguchi, Masaki Shinoda. Redox Report, Vol. 8, No. 3, 2003, 157-161), 콤브레타스타틴 A-1 글루쿠론산 유도체(Regio- and Stereospecific Synthesis of Mono-β-d-Glucuronic Acid Derivatives of Combretastatin A-1.Rajendra P. Tanpure, Tracy E. Strecker, David J. Chaplin, Bronwyn G. Siim, Mary Lynn Trawick and Kevin G. Pinney.J. Nat. Prod., 2010, 73 (6), pp 1093-1101); 레스베라트롤 글루쿠론산 유도체(WANG LAIXI; Heredia, A.; Song, HJ; ZHANG ZHAOJUN; YU BIAO; Davis, C.; Redfield, R. Resveratrol glucuronides as the metabolites of resveratrol in humans: Characterization, synthesis, and anti-HIV activity. J. Pharm. Sci. 2004, 93(10), 2448-2457); 커큐민 글루쿠론산 유도체(K .S.Psrvathy, M.Sc. University of Mysore. 2009) 등이 우수한 활성을 갖는다. 따라서, 3개의 필리게닌 글루쿠로니드 유도체의 제조 방법이 연구되고, 약리학적 연구가 수행된다.
본 발명은 신규한 항바이러스 약물 공급원인 필리게닌 글루쿠론산 유도체, 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법 및 항바이러스제에서의 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명에 의해 제공되는 필리게닌 글루쿠론산 유도체는 항바이러스 효과를 가지며, 인플루엔자 바이러스를 치료하고 예방하기 위한 약물 또는 건강 관리 제품의 제조에서 사용될 수 있다. 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법은 공정이 간단하고, 작업하기 편리하고, 대규모 산업 생산에 적합하다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 한편으로, 본 발명은 하기 화학식 (I)로 제시된 일반 분자식을 갖는 필리게닌 글루쿠론산 유도체를 제공한다:
Figure pct00001
상기 식에서, R1은 H이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 CnH2n +1이거나, R1은 CnH2n +1이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 H이거나, R1-R2는 -CH2-이고, R3는 CnH2n +1이고; n은 1-30이다.
상기 식에서, 치환기의 n은 1이다.
다른 한편으로, 본 발명은 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법을 제공한다. 제조 방법은 하기 단계를 순차적으로 포함한다:
1) 포르시티아 잎 및 추출 용매수를 혼합하고, 가열하고, 2-3회 달여서(decocting) 추출하고, 추출 용액을 수거하여 통합시켜, 포르시티아 물 추출물을 획득하는 단계;
2) 거대다공성 수지 컬럼을 채택하여 포르시티아 물 추출물을 분리시키고, 용리액을 수거하여 통합시켜, 포르시티아 수지 컬럼 용리액을 획득하는 단계;
3) 포르시티아 수지 컬럼 용리액을 건조시키고, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 용리액을 단계별로 수거하고, 용리액을 각각 건조시킴으로써, 생성물을 획득하는 단계.
단계 1)에서의 가열 및 추출 빈도는 바람직하게는 2회이다.
특히, 각각의 달임 및 추출 공정에서, 포르시티아 잎 대 추출 용매수의 중량비는 1:(6-10), 바람직하게는 1:(8-10)이다.
더욱 특히, 첫번째 달임 공정에서, 포르시티아 잎 대 추출 용매수의 중량비는 1:(9-10)이고; 두번째 달임 공정에서, 포르시티아 잎 대 추출 용매수의 중량비는 1:8이다.
특히, 상기 제조 방법은 단계 1)에서 획득된 포르시티아 물 추출물을 농축시키는 단계, 포르시티아 농축 용액을 제조하는 단계, 및 거대다공성 수지 컬럼 분리 처리를 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
더욱 특히, 농축에 의해 획득된 포르시티아 농축 용액의 부피 대 포르시티아 잎의 중량의 비는 (1-5):1, 바람직하게는 (2-2.5):1이고,
여기서, 단계 2)에서의 거대다공성 수지 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 작업은 포르시티아 물 추출물을 거대다공성 수지 컬럼에 주입하는 단계, 및 용리액으로서 물을 이용하여 용리시키는 단계; 용리액으로서 3-50%의 질량 농도를 갖는 에탄올 용액을 이용하여 용리시키는 단계; 및 최종적으로 용리액으로서 무수 에틸 알콜을 이용하여 용리시키는 단계, 무수 에틸 알콜 용리액을 수거하여 포르시티아-거대다공성 수지 용리액을 획득하는 단계의 하위 단계를 순차적으로 포함한다.
특히, 거대다공성 수지 컬럼 크로마토그래피 공정에서, 포르시티아 물 추출물 내의 포르시티아 잎의 중량 대 거대다공성 수지의 부피의 비는 1:(0.8-2.5), 바람직하게는 1:1이다.
더욱 특히, 거대다공성 수지 컬럼 분리 공정에서, 거대다공성 수지 컬럼의 컬럼 직경 대 수지의 컬럼 높이의 비는 1:5-10, 바람직하게는 1:(5-7), 더욱 바람직하게는 1:(5.5-5.9)이고,
여기서, 단계 2)에서, 거대다공성 수지는 X-5, AB-8, NK-2, NKA-2, NK-9, D3520, D101 및 WLD, 바람직하게는 X-5 또는 AB-8 중 하나로부터 선택된다.
특히, 용리액으로서 물을 이용하는 용리 공정에서, 물의 사용량 대 거대다공성 수지 컬럼의 컬럼 부피의 비는 (2-4):1, 바람직하게는 4:1이고; 용리액으로서 3-50%의 질량 농도를 갖는 에탄올 용액을 이용하는 용리 공정에서, 3-50%의 질량 농도의 에탄올 용액의 사용량 대 거대다공성 수지 컬럼의 컬럼 부피의 비는 (2-8):1, 바람직하게는 (4-8):1, 더욱 바람직하게는 8:1이고; 용리액으로서 무수 에틸 알콜 용액을 이용한 용리 공정에서, 무수 에틸 알콜 용액의 사용량 대 거대다공성 수지 컬럼의 컬럼 부피의 비는 (2-8):1, 바람직하게는 (4-8):1, 더욱 바람직하게는 8:1이고,
여기서, 단계 3)의 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하는 작업은 하기 하위 단계를 순차적으로 포함한다:
A) 포르시티아 수지 컬럼 용리액을 농축시키고, 건조시켜, 미정제 포르시티아 생성물을 획득하는 단계;
B) 미정제 포르시티아 생성물을 물에 용해시키고, 미정제 포르시티아 생성물을 실리카-겔 컬럼으로 주입하고, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 용리액을 단계별로 수거하고, 용리액을 각각 건조시킴으로써, 생성물을 획득하는 단계.
특히, 단계 B)에서, 실리카-겔 컬럼은 역상 실리카-겔 컬럼으로부터 선택되고,
여기서, 역상 실리카-겔 컬럼에서, 패킹은 C18 역상 실리카-겔로부터 선택되고; 실리카-겔 컬럼의 입자 크기는 5-10μm이다.
특히, 역상 실리카-겔 컬럼은 10-100mm의 컬럼 내부 직경 및 100-300mm의 길이, 바람직하게는 22.2mm의 컬럼 내부 직경 및 250mm의 길이를 갖고,
여기서, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피 컬럼이 선택된다.
특히, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 공정의 이동상은 메탄올(A) 및 물(B)의 혼합 용액으로부터 선택되고,
여기서, 메탄올(A) 대 물(B)의 부피비는 8:2-10:1이다.
특히, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 공정에서, 컬럼 온도는 20-35℃이고, 유속은 4-30ml/min이다.
특히, 샘플은 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 공정에서 등용매 용리 방식 또는 구배 용리 방식으로 이동상에 의해 용리되고,
여기서, 구배 용리는 0min(30% A)→25min(50% A)→50min(50% A)를 나타내고; 유속은 4.0mL/min이고; 컬럼 온도는 20℃이고, 검출 파장은 273nm이다.
특히, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피의 크로마토그래피 조건은 다음과 같다: C18 역상 실리카-겔은 충전제로 제공되고(Φ22.2×250mm, 10μm); 메탄올(A)-물(B)은 이동상으로 제공되고; 구배 용리는 0-25min이고, 메탄올 농도는 30%-50%이고; 구배 용리는 25-50min이고, 메탄올 농도는 50%-50%이고; 유속은 4.0ml/min이고; 컬럼 온도는 20℃이고; UV 검출 파장은 273nm이다.
상기 방법에 의해 제조된 필리게닌 글루쿠론산 유도체는 화합물 I, II 및 III일 수 있다.
구조는 하기와 같이 확인되고 분석된다:
화합물 I: 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드
ESI-MS: m/z 533.1658 [M-H]-, 분자량: 534; 분자식: C26H30O12.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119- 7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):172.75(C-17), 149.51(C-9), 148.95(C-34), 148.09(C-33), 145.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 118.55(C-12), 118.05(C-31), 115.72(C-13), 112.03(C-32), 111.07(C-10), 109.92(C-35), 100.21(C-2), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-5), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 55.99(C-38), 54.47(C-29), 49.79(C-25).
Figure pct00002
화합물 II: 9-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드
ESI-MS m/z 533.1641 [M-H]-, 분자량: 534; 분자식: C26H30O12.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119-7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):173.72(C-17), 149.51(C-33), 148.95(C-34), 148.09(C-9), 144.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 121.45(C-12), 119.72(C-31), 118.05(C-13), 115.07(C-10), 113.03(C-32), 109.92(C-35), 100.21(C-2), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-5), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 55.99(C-38), 54.47(C-29), 50.16(C-25).
Figure pct00003
화합물 III: 33,34-메틸렌디옥시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드
ESI-MS m/z 531.4933 [M-H]-, 분자량: 532; 분자식: C26H28O12.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119-7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 6.12(2H, s), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):169.75(C-17), 149.51(C-9), 148.95(C-34), 148.09(C-33), 145.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 118.55(C-12), 118.05(C-13), 115.72(C-31), 112.03(C-32), 111.07(C-10), 109.92(C-35), 101.21(C-2), 100.29(C-38), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-16), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 54.47(C-29), 49.79(C-25).
Figure pct00004
본 발명의 방법에 따르면, 불순물 대부분은 거대다공성 수지 컬럼의 정제를 통해 제거될 수 있고, 거대다공성 수지는 재이용될 수 있어, 생산 비용이 감소되고, 다음 단계의 반-조제 크로마토그래피 컬럼의 사용 수명이 연장된다. 상기 공정은 편리하고, 작업이 용이하고, 추출 효율이 높고, 오염이 적으며, 제조된 생성물은 순도가 높고, 용이하게 산업화될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 항바이러스 용도를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스를 예방하고/하거나 치료하기 위한 약물의 제조에서의 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 용도를 제공한다.
본 발명은 필리게닌 글루쿠론산 유도체를 포함하는 항바이러스 효과를 갖는 약물 또는 건강 관리 제품 조성물을 제공한다.
특히, 약학적 조성물은 본 발명의 필리게닌 글루쿠론산 유도체 뿐만 아니라 약학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.
필리게닌 글루쿠로니드 유도체의 제조 방법 및 인플루엔자 바이러스를 예방하고 치료하기 위한 약물에서의 용도는 상기 화합물로 동시에 제한되는 것은 아니다. 필리게닌 글루쿠로니드 유도체는 모핵(parent nucleus)으로서 상기 화합물을 이용한 합성, 발효 및 다른 방법에 의해 제조된 유도체를 추가로 포함한다.
본 발명에서, 약학적으로 허용되는 부형제는 비독성 고체, 반-고체 또는 액체 충전제, 희석제, 담체, pH 조절제, 이온 강도 조절제, 지속-방출 또는 조절-방출 제제, 코팅 물질 또는 다른 제조 부형제를 나타낸다. 사용되는 담체는 상응하는 투여 형태와 매치될 수 있다. 당업자에게 공지된 부형제는 주사제, 동결-건조된 분말(주사용), 스프레이, 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 장용-코팅된 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제제 등으로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 첫번째 양태의 4-탈메틸화 필리게닌 글루쿠로니드는 주사 또는 소화관을 통해 투여된다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 주사제 또는 소화관을 통해 투여되는 제제이고, 즉, 바람직하게는 부형제는 주사 또는 소화관을 통해 투여되는 제제로 제조되기에 적합하고, 여기서 "소화관을 통한 투여"는 본 발명의 환자의 소화관을 통해 약물 제제를 투여하는 방식을 나타내고, 경구 투여, 위내 투여, 관장 투여 등을 포함하며, 바람직하게는 경구 투여를 포함한다. 예를 들어, 당업자에게 공지된 부형제는 경구 용액, 경구 현탁액, 정제, 캡슐, 장용-코팅된 정제, 환약, 분말, 과립, 지속-방출 또는 지연-방출 제제 등으로 제조될 수 있으며, 여기서 주사를 통해 투여되는 제제는 주로 주사제 및 분말-주사제를 나타낸다.
본 발명의 신규한 화합물, 즉, 필리게닌 글루쿠론산 유도체는 항바이러스 효과를 가지며, 항바이러스, 해열제, 진통제 및 항염증 약물 또는 건강 관리 제품으로 제조될 수 있다. 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법은 작업 공정 조건이 용이하게 조절 가능하고, 품질 관리성이 높고, 수율이 높고, 에너지 소모가 낮고, 환경 친화적이고, 대규모 산업 생산에 적합하다.
본 발명은 구현예를 통해 하기에 추가로 기재된다. 그러나, 구현예는 본 발명을 단지 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
구현예 1
1. 달임 처리
1-1) 포르시티아 잎을 분쇄시키고, 포르시티아 잎을 20-메쉬(mesh) 체로 통과시켜 포르시티아 잎 분말을 획득하고, 1kg의 포르시티아 잎에 10kg의 물을 첨가하고, 균일하게 혼합하고 가열하고, 제1 달임 처리를 수행하고(여기서, 첨가되는 물 대 포르시티아 잎의 중량비는 10:1임); 가열하고 비등시키고, 2시간 동안 달이고 추출하고, 여과시켜, 제1 추출 용액 및 제1 약물 잔여물을 획득하고;
1-2) 제1 약물 잔여물에 8kg의 물을 첨가하고, 가열하고 비등시키고, 제2 달임 처리를 수행하고(여기서, 첨가되는 물 대 포르시티아 잎의 중량비는 8:1임); 1시간 동안 달이고 추출하고, 여과시켜, 제2 추출 용액 및 약물 잔여물(폐기)을 획득하고;
1-3) 제1 추출 용액 및 제2 추출 용액을 통합시켜, 포르시티아 물 추출물을 제조하고;
1-4) 진공 회전 증발기에서 포르시티아 물 추출물에 대해 진공 농축 처리를 수행하고, 용매를 회수함으로써 이후 사용을 위한 포르시티아 농축 용액(2L)을 획득한다(여기서, 포르시티아 잎의 중량 대 포르시티아 농축 용액의 부피의 비는 1:2임).
2. 거대다공성 수지 컬럼 크로마토그래피
2-1) 포르시티아 농축 용액을 거대다공성 수지 컬럼에 로딩하고, 거대다공성 수지 컬럼 분리 처리를 수행하고(여기서, 거대다공성 수지는 AB-8 타입 거대다공성 수지로부터 선택되고; 거대다공성 수지 컬럼 내의 거대다공성 수지의 컬럼 부피는 1L이고(크로마토그래피 컬럼은 60mm의 직경 및 500mm의 높이를 갖고, 충전된 수지의 높이는 354mm임); 수지 컬럼 내의 수지의 부피 대 포르시티아 잎의 중량(건조 중량)의 비는 1:1임(예를 들어, 포르시티아 잎의 건조 중량이 1kg인 경우, 거대다공성 수지의 부피는 1L이고; 의약 물질의 건조 중량이 1g인 경우, 거대다공성 수지의 부피는 1ml임)); 컬럼 부피의 4배(즉, 4L)의 양의 물로 세척하고, 농축된 상층액이 수지 컬럼으로 완전히 유동한 후 용리액을 분리시키고; 컬럼 부피의 8배(즉, 8L)의 양의 3%의 질량 농도의 에탄올 용액으로 용리시키고, 용리액을 분리시키고; 컬럼 부피의 8배(즉, 8L)의 양의 무수 에틸 알콜로 용리시키고, 용리액을 수거함으로써, 포르시티아-거대다공성 수지 용리액을 획득하고;
2-2) 회전 증발기에서 포르시티아-거대다공성 수지 용리액에 대해 진공 농축 처리를 수행하고, 용매를 회수하고, 농축된 잔여물을 건조시킴으로써, 62g의 미정제 포르시티아 생성물을 획득한다.
3. 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 수행
3-1) 0.5g의 미정제 포르시티아 생성물을 칭량하고, 적절한 양(2.5ml)의 물을 첨가하고, 교반하고, 이후 사용을 위해 용해시키고;
3-2) 고성능 액체 크로마토그래프(Shimadzu SCL-10AVP 반-조제 고성능 액체 크로마토그래프, LC-8A 펌프 및 SPD-20A 모니터)를 채택하여 미정제 포르시티아 생성물에 대해 크로마토그래피 처리를 수행하고, 미정제 포르시티아 생성물을 분리시키고, 정제하고, 용해된 미정제 포르시티아 생성물을 반-조제 고성능 액체 크로마토그래프에 주입(로딩)하고, 용리액으로서 메탄올-물 용액을 이용하여 구배 용리를 수행하고, 여기서, 고성능 액체 크로마토그래프 내의 크로마토그래피 컬럼의 크기는 Φ22.2×250mm이고, C18 역상 실리카-겔은 패킹으로 제공되고, 입자 크기는 10um이고, 로딩 양은 500mg이고, 메탄올-물 용액은 이동상으로 제공되고, 구배 용리의 조건은 다음과 같고; 구배 용리: 0-25min, 메탄올 농도는 30%-50%이고; 구배 용리: 25-50min, 메탄올 농도는 50%-50%이고; 유속은 4ml/min이고; 컬럼 온도는 20℃이고; UV 검출 파장은 273nm이고; 25.5-27.5min, 30.5-32.5min 및 35.5-37.5min의 체류 시간에서 분획을 각각 수거하고;
3-3) 3개의 수거된 분획에 대해 진공 농축을 각각 수행하고, 진공 건조를 수행함으로써, 화합물 I(70.5 mg), 화합물 II(53.2 mg) 및 화합물 III(46.6 mg)를 각각 획득한다.
화합물 I, II 및 III의 함량은 각각 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 채택하여 검출되고, HPLC의 검출 조건은 다음을 포함한다: 기계: Water 515 펌프; 2487 검출기; 크로마토그래피 컬럼: Kromasil RP-C18; 이동상: 아세토니트릴:0.1% 인산 용액(13:87); 검출 파장: 230nm; 및 유속: 1.0ml/min.
HPLC 검출에 따르면, 화합물 I의 순도는 99.6%이고, 화합물 II의 순도는 98.1%이고, 화합물 III의 순도는 98.3%이다.
화합물 I은 111℃의 융점을 갖는 백색 고체이며, 물 및 에탄올에서 가용성이다. TLC 보드(클로로포름/메탄올 3:1의 크로마토그래피 용액, 0.25의 Rf) 상에서 확장시키고, 10%H2SO4-에탄올 시약과 함께 분무되는 경우, 화합물 I은 자주색을 띤 적색이다.
ESI-MS: m/z 533.1658 [M-H]-, 분자량: 534.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119- 7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):172.75(C-17), 149.51(C-9), 148.95(C-34), 148.09(C-33), 145.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 118.55(C-12), 118.05(C-31), 115.72(C-13), 112.03(C-32), 111.07(C-10), 109.92(C-35), 100.21(C-2), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-5), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 55.99(C-38), 54.47(C-29), 49.79(C-25).
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 I은 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 영문명을 갖는 것으로 결정된다. 화합물 I의 구조식은 하기와 같다:
Figure pct00005
화합물 II는 113℃의 융점을 갖는 백색 고체이며, 물 및 에탄올에서 가용성이다. TLC 보드(클로로포름/메탄올 3:1의 크로마토그래피 용액, 0.32의 Rf) 상에서 확장시키고, 10%H2SO4-에탄올 시약과 함께 분무되는 경우, 화합물 II는 자주색을 띤 적색이다.
ESI-MS m/z 533.1641 [M-H]-, 분자량: 534.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119-7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):173.72(C-17), 149.51(C-33), 148.95(C-34), 148.09(C-9), 144.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 121.45(C-12), 119.72(C-31), 118.05(C-13), 115.07(C-10), 113.03(C-32), 109.92(C-35), 100.21(C-2), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-5), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 55.99(C-38), 54.47(C-29), 50.16(C-25).
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 II는 9-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 영문명을 갖는 것으로 결정된다.
화학식 II의 구조식은 하기와 같다:
Figure pct00006
화합물 III는 119℃의 융점을 갖는 백색 고체이며, 물 및 에탄올에서 가용성이다. TLC 보드(클로로포름/메탄올 3:1의 크로마토그래피 용액, 0.36의 Rf) 상에서 확장시키고, 10%H2SO4-에탄올 시약과 함께 분무되는 경우, 화합물 II는 자주색을 띤 적색이다.
ESI-MS m/z 531.4933 [M-H]-, 분자량: 532.
수소 핵 자기 공명 (400 MHz, d6-DMSO): δ(ppm):12.0(1H, s, COOH), 7.119-7.099(1H, d, J=8.0Hz, Ar-H), 6.530-6.943(2H, d, J=4.0Hz, Ar-H), 6.872(3H, s, Ar-H), 6.12(2H, s), 5.39(2H, s, J=4.8Hz), 5.23(1H, d, J=4.8Hz), 5.1(1H, d, J=4.8Hz), 4.800(1H, d, J=4.8Hz), 4.374-4.388(1H, d, J=9.6Hz), 4.105-4.085(1H, d, J=8.0Hz), 4.005-3.982(1H, d, J=9.2Hz), 3.75(8H, d, J=8.4Hz), 3.422(1H, t, J=8.7Hz), 3.08(1H, t, J=8.1Hz), 2.85(1H, d, J=7.2Hz);
탄소 핵 자기 공명 (100MHz, d6-DMSO): δ(ppm):169.75(C-17), 149.51(C-9), 148.95(C-34), 148.09(C-33), 145.74(C-8), 136.26(C-11), 131.67(C-30), 118.55(C-12), 118.05(C-13), 115.72(C-31), 112.03(C-32), 111.07(C-10), 109.92(C-35), 101.21(C-2), 100.29(C-38), 87.11(C-26), 81.74(C-22), 76.26(C-6), 75.70(C-3), 73.41(C-16), 71.91(C-4), 70.81(C-28), 69.46(C-24), 56.15(C-21), 54.47(C-29), 49.79(C-25).
ESI-MS, 1H-NMR 및 13C-NMR의 시험 데이터에 따르면, 화합물 III는 33,34-메틸렌디옥시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 영문명을 갖는 것으로 결정된다.
화학식 III의 구조식은 하기와 같다:
Figure pct00007
구현예 2
1. 달임 처리
1-1) 포르시티아 잎을 분쇄시키고, 포르시티아 잎을 20-메쉬 체로 통과시켜 포르시티아 잎 분말을 획득하고, 1kg의 포르시티아 잎에 9kg의 물을 첨가하고, 균일하게 혼합하고 가열하고, 제1 달임 처리를 수행하고(여기서, 첨가되는 물 대 포르시티아 잎의 중량비는 9:1임); 가열하고 비등시키고, 2.5시간 동안 달이고 추출하고, 여과시켜, 제1 추출 용액 및 제1 약물 잔여물을 획득하고;
1-2) 제1 약물 잔여물에 8kg의 물을 첨가하고, 가열하고 비등시키고, 제2 달임 처리를 수행하고(여기서, 첨가되는 물 대 포르시티아 잎의 중량비는 8:1임); 1시간 동안 달이고 추출하고, 여과시켜, 제2 추출 용액 및 약물 잔여물(폐기)을 획득하고;
1-3) 제1 추출 용액 및 제2 추출 용액을 통합시켜, 포르시티아 물 추출물을 제조하고;
1-4) 진공 회전 증발기에서 포르시티아 물 추출물에 대해 진공 농축 처리를 수행하고, 용매를 회수함으로써 이후 사용을 위한 포르시티아 농축 용액(2.5L)을 획득한다(여기서, 포르시티아 잎의 중량 대 포르시티아 농축 용액의 부피의 비는 1:2.5임).
2. 거대다공성 수지 컬럼 크로마토그래피
2-1) 포르시티아 농축 용액을 거대다공성 수지 컬럼에 로딩하고, 거대다공성 수지 컬럼 분리 처리를 수행하고(여기서, 거대다공성 수지는 X-5 타입 거대다공성 수지로부터 선택되고; 거대다공성 수지 컬럼 내의 거대다공성 수지의 컬럼 부피는 1L이고(크로마토그래피 컬럼은 60mm의 직경 및 500mm의 높이를 갖고, 충전된 수지의 높이는 354mm임); 수지 컬럼 내의 수지의 부피 대 포르시티아 잎의 중량(건조 중량)의 비는 1:1임(예를 들어, 포르시티아 잎의 건조 중량이 1kg인 경우, 거대다공성 수지의 부피는 1L이고; 의약 물질의 건조 중량이 1g인 경우, 거대다공성 수지의 부피는 1ml임)); 컬럼 부피의 8배(즉, 8L)의 양의 탈이온수로 세척하고, 농축된 상층액이 수지 컬럼으로 완전히 유동한 후 용리액을 분리시키고; 컬럼 부피의 4배(즉, 4L)의 양의 3%의 질량 농도의 에탄올 용액으로 용리시키고, 용리액을 분리시키고; 컬럼 부피의 8배(즉, 8L)의 양의 무수 에틸 알콜로 용리시키고, 용리액을 수거함으로써, 포르시티아-거대다공성 수지 용리액을 획득하고;
2-2) 회전 증발기에서 포르시티아-거대다공성 수지 용리액에 대해 진공 농축 처리를 수행하고, 용매를 회수하고, 농축된 잔여물을 건조시킴으로써, 58g의 미정제 포르시티아 생성물을 획득한다.
3. 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 수행
3-1) 0.8g의 미정제 포르시티아 생성물을 칭량하고, 적절한 양(1.6ml)의 물을 첨가하고, 교반하고, 이후 사용을 위해 용해시키고;
3-2) 고성능 액체 크로마토그래프(Shimadzu SCL-10AVP 반-조제 고성능 액체 크로마토그래프, LC-8A 펌프 및 SPD-20A 모니터)를 채택하여 미정제 포르시티아 생성물에 대해 크로마토그래피 처리를 수행하고, 미정제 포르시티아 생성물을 분리시키고, 정제하고, 용해된 미정제 포르시티아 생성물을 반-조제 고성능 액체 크로마토그래프에 주입(로딩)하고, 용리액으로서 메탄올-물 용액을 이용하여 구배 용리를 수행하고, 여기서, 고성능 액체 크로마토그래프 내의 크로마토그래피 컬럼의 크기는 Φ22.2×250mm이고, C18 역상 실리카-겔은 패킹으로 제공되고, 입자 크기는 10um이고, 로딩 양은 800mg이고, 메탄올-물 용액은 이동상으로 제공되고, 구배 용리의 조건은 다음과 같고; 구배 용리: 0-25min, 메탄올 농도는 30%-50%이고; 구배 용리: 25-50min, 메탄올 농도는 50%-50%이고; 유속은 4ml/min이고; 컬럼 온도는 20℃이고; UV 검출 파장은 273nm이고; 25.5-27.5min, 30.5-32.5min 및 35.5-37.5min의 체류 시간에서 분획을 각각 수거하고;
3-3) 3개의 수거된 분획에 대해 진공 농축을 각각 수행하고, 진공 건조를 수행함으로써, 화합물 A(104.2 mg), 화합물 B(74.3 mg) 및 화합물 C(58.1 mg)를 각각 획득한다.
화합물 A, B 및 C의 함량은 각각 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)를 채택하여 검출되고, HPLC의 검출 조건은 다음을 포함한다: 기계: Water 515 펌프; 2487 검출기; 크로마토그래피 컬럼: Kromasil RP-C18; 이동상: 아세토니트릴:0.1% 인산 용액(13:87); 검출 파장: 230nm; 및 유속: 1.0ml/min.
HPLC 검출에 따르면, 화합물 A의 순도는 99.3%이고, 화합물 B의 순도는 98.4%이고, 화합물 C의 순도는 98.5%이다.
구현예 2에서 제조된 화합물 A, B 및 C의 물리화학적 특성, 질량 스펙트럼 및 핵 자기 공명 데이터는 구현예 1에서 제조된 화합물 I, II 및 III의 물리화학적 특성, 질량 스펙트럼 및 핵 자기 공명 데이터와 각각 동일하다.
시험 케이스 1: 시험관 내 항바이러스 시험
1.1: 시험 물질
(1) 약물
① 시험된 약물
본 발명의 구현예 1에서 제조된 필리게닌 글루쿠로니드 유도체(즉, 화합물 I, II 및 III).
② 양성 대조군 약물
리바비린 주사: Henan Runhong Pharmaceutical Co., Ltd.에 의해 생산된 무색 투명 액체, 제품 배치 번호: 1206261, SFDA 승인 번호: H19993553, 100mg/ml, 시험의 양성 대조군 약물로 제공됨;
오셀타미버 포스페이트(oseltamivir phosphate): 중국 식품 약품 검정 연구소(National Institutes for Food and Drug Control)에 의해 제공됨, 제품 배치 번호: 101096-200901, 100mg/단편, 시험의 양성 대조군 약물로 제공됨;
필리게닌: 99.2%의 순도를 갖는, Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.에 의해 생산되고, 영역 표준화 방법에 의해 UV 검출기 및 증기화 광 산란 검출기와 같은 2개의 검출기에 의한 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 측정된 백색 분말.
약물은 모두 정제수에 용해되고, 여과되고, 4℃에서 이후 사용을 위해 분할 충전되도록 디점드(degermed)되고, 본 시험에서 검출되는 약물로 제공된다.
(2) 세포주
Vero 세포주(아프리카 녹색 원숭이 신장 세포): 지린 대학(Jilin University)의 기초 의학 대학에 의해 수거됨.
(3) 바이러스 계통
① 인플루엔자 바이러스 균주, 파라인플루엔자 바이러스 균주 및 호흡기세포 융합 바이러스(RSV) 균주: 중국 예방 의약품 아카데미(Chinese Academy of Preventive Medicine)의 바이러스학 연구소로부터 구입; ② 콕사키 바이러스 B3(CVB3) 균주: 중국과학원의 우한병독 연구소(Wuhan Institute of Virology of Chinese Academy of Sciences)로부터 구입; ③ 콕사키 바이러스 A16(CoxA16) 균주, 엔테로바이러스 EV71 균주: 센다이 국립 병원(Sendai State Hospital)으로부터 구입; ④ 아데노바이러스(AdV): 노먼 베쑨 의과 대학 제1 병원(First Hospital of Norman Bethune Medical University)의 소아과로부터 구입; 및 ⑤ 단순 헤르페스 바이러스 I(HSV-1): 중국 식품 약품 검정 연구소(National Institutes for Food and Drug Control)로부터 구입.
(4) 주요 장비 및 시약
생물안전 캐비넷: BHC-1300 II A/B3, AIRTECH; CO2 인큐베이터: MCO-18AIC, SANYO; 도립현미경: CKX41, OLYMPUS; 전자식 분석 저울: AR1140/C, DHAUS; 배양 배지: DMEM, HyClone; 소 태아 혈청: HyClone; 트립신: Gibco; MTT: Sigma; DMSO: Tianjin Beilian Fine Chemicals Development Co., Ltd.
1.2: 시험 방법
(1) 세포 제조
Vero 세포를 1-2일 동안 계대배양을 수행하여 명확한 경계선을 갖는 시트(sheet)를 생성시키고, 입체감 및 디옵터가 높은 경우 트립신 분해를 수행하고, 바늘 끝 형태의 구멍이 세포 표면에서 발생하는 경우 분해액을 완전히 흡수시키고, 세포를 수밀리리터의 배양액으로 분산시키고, 계수하고, 배양액(10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)으로 5×107 세포/L의 양으로 희석시키고, 96-웰 배양 플레이트에 접종시키고, 세포를 단층으로 성장시킨다.
(2) 약물 독성 결정
세포독성 시험: 약물은 표 1-1에 제시된 농도에 따라 유지 용액(2% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM)으로 희석되고, 세포독성 결정에 사용된다.
표 1-1: 약물의 세포독성 시험 농도 (단위: g/L)
Figure pct00008
단일-층 Vero 세포에 표 1-1의 다양한 농도의 약물을 적가하고(여기서, 0.2ml의 약물이 각각의 웰에 충전되고, 각각의 농도가 6개의 복합 웰을 점유함); 6-웰 정상 대조군(약물이 없는 정상 대조군) 및 6-웰 블랭크 대조군(배양 용액)을 추가로 설정하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 배양하고, 매일 도립현미경을 통해 CPE(세포병변 효과)를 관찰하고(시험관내 실험에서, 세포 바이러스는 세포 배양 및 접종에 의해 사멸되며, 세포가 둥글게 되고, 사멸되고, 병 벽으로부터 떨어지는 등의 현상이 특정 시간 내에서 현미경에 의해 관찰될 수 있으며, 이는 세포병변 효과로 언급된다. 세포병변 효과는 바이러스에 감염된 조직 배양 세포에 의해 야기되는 세포 변성을 나타낸다. 바이러스 정량은 세포병변 효과를 이용하여 수행될 수 있다); CPE를 기록하고; 20μL(5mg·mL-1)의 MTT(티아졸릴 블루의 상표명을 갖고, 황색 염료인 3-(4,5-디메틸-2-티아졸릴)-2,5-디페닐-2-H-테트라졸륨 브로마이드) 용액을 72시간 이내에 각각의 웰에 첨가하고, 4시간 동안 지속적으로 인큐베이션하고, 각각의 웰 내의 배양액을 흡인하고, 100μL의 DMSO를 각각의 웰에 첨가하고, 5분 동안 진동시키고, 492nm에서 OD 값을 측정하고, 세포 생존력을 계산하고; SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서 세포 생존력에 대해 Probit 회귀 분석을 수행하고, 최대 비-세포독성 농도(TC0) 및 반-세포독성 농도(TC50)를 계산한다.
(3) 다양한 바이러스의 TCID50의 결정
다양한 바이러스에 대해 10배 구배 감소 희석을 수행하여 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 및 10-6과 같은 다양한 정도의 희석에 도달시키고, 바이러스를 단일-층 Vero 세포 96-웰 배양 플레이트에 순차적으로 접종시키고(여기서, 각각의 웰 내의 바이러스의 양은 100μL이고, 각각의 희석도는 6개의 웰 내에 존재함); 정상 세포 대조군 그룹을 설정하고, 2시간 동안 37℃에서 5% CO2에서 인큐베이션하고, 바이러스 용액을 분리시키고, 100μL의 세포 유지 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 37℃에서 5% CO2에서 배양하고; 현미경 하에서 3일째로부터 세포변변 효과 결과를 관찰하기 시작하고, 7-8일째에 결과를 판단하고, 기록을 남기고, 세포 웰의 50%가 양성 병변을 생성시키는 것을 가능하게 할 수 있는 가장 높은 희석도를 종점으로 취하고, 카버(karber) 방법을 이용하여 바이러스 역가를 계산한다.
식은 다음과 같다:
Figure pct00009
TCID50: 50% 조직 세포 감염량
XM: 바이러스의 가장 높은 농도의 희석도의 대수
d: 희석도 계수(배수)의 대수
∑pi: 다양한 희석도의 병변 백분율의 합계
(4) 바이러스-유도 CPE에 대한 약물의 영향
단일-층 세포로 성장된 배양 플레이트를 얻고, 배양액을 흡인하고 분리시키고, 100TCID50에 해당하는 바이러스 공격량에 의해 세포를 접종하고, 2시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 흡착시키고, 특정 농도(거의 최대 비-세포독성 농도)의 각각의 약물 용액을 첨가하고, 200μL/웰의 부피에 따라 6개의 복합 웰에서 각각의 농도로 배양하고; 양성 약물 대조군 그룹으로서 리바비린 주사액 및 오셀타미버 포스페이트를 설정하고, 정상 대조군 그룹(임의의 바이러스 또는 약물이 없음) 및 바이러스 대조군 그룹(임의의 약물 없이 바이러스가 첨가된 대조군 그룹)을 동시에 설정하고, 바이러스-유도 CPE에 대한 약물의 영향을 관찰하고; MTT 비색 방법을 이용하여 492nm의 파장 하에서 OD 값을 측정하고, 약물의 항바이러스 유효율(ER%)을 계산하고; ANOVA 방법을 이용하여 SPSS 18.0 통계 소프트웨어에서 다양한 약물의 항바이러스 유효율 사이에서 명백한 차이를 비교한다.
ER% = (약물 처리 그룹의 평균 OD 값 - 바이러스 대조군 그룹의 평균 OD 값)/세포 대조군 그룹의 평균 OD 값 - 바이러스 대조군 그룹의 평균 OD 값) x 100%
1.3: 시험 결과
(1) 다양한 바이러스의 TCID50
파라인플루엔자 바이러스:
Figure pct00010
인플루엔자 바이러스:
Figure pct00011
CVB3:
Figure pct00012
HSV-1:
Figure pct00013
AdV:
Figure pct00014
RSV:
Figure pct00015
CoxA16:
Figure pct00016
EV71:
Figure pct00017
(2) 약물 독성 결정 결과
1) 세포독성에 대한 약물의 결정
Vero 세포에 대한 다양한 약물의 최대 비-세포독성 농도(TC0) 및 반(semi)-세포독성 농도(TC50)가 표 1-2에 제시된다.
표 1-2: 약물의 세포독성 시험 결과 (단위: g/L)
Figure pct00018
2) 바이러스-유도 CPE에 대한 약물의 보호 효과 결과
표 1-3에서 다양한 바이러스에 대한 약물의 유효율 및 일원 ANOVA(분산 분석) 결과를 상세히 참조한다.
표 1-3: 약물의 항바이러스 유효율(ER%)에 대한 통계 표
Figure pct00019
표 1-3의 결과는 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드(화합물 I), 9-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드(화합물 II) 및 33,34-메틸렌디옥시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드(화합물 III)가 인플루엔자 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 I(HSV-I) 및 엔테로바이러스 EV71에 대해 90%를 초과하는 억제율 및 유효율을 갖고, 바이러스 대조군 그룹과 명백한 차이를 갖고, 통계적 유의성을 갖는 것을 제시한다. 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드, 9-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드 및 33,34-메틸렌디옥시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드는 필리게닌, 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트의 장점에 비해 우수한 다수의 바이러스에 대한 항바이러스 치료 효과를 갖는다.
시험 케이스 2: 생체 내 항바이러스 시험
2.1: 시험 물질
(1) 실험 동물:
쿤밍(Kunming) 마우스: 체중 18-22g, 수컷 절반 및 암컷 절반, 다롄 의대(Dalian Medical University)의 실험 동물 센터에서 구입, 품질 인증 번호: SCXK (13)2012-0003.
(2) 약물
① 본 발명의 구현예 1에서 제조된 화합물 I, 즉, 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드;
② 리바비린 주사: Henan Runhong Pharmaceutical Co., Ltd.에 의해 생산된 무색 투명 액체, 제품 배치 번호: 1206261, SFDA 승인 번호: H19993553, 100mg/ml, 시험의 양성 대조군 약물로 제공됨;
③ 오셀타미버 포스페이트: 중국 식품 약품 검정 연구소에 의해 제공됨, 제품 배치 번호: 101096-200901, 100mg/단편, 시험의 양성 대조군 약물로 제공됨;
④ 필리게닌: 99.2%의 순도를 갖는, Dalian Fusheng Natural Drug Development Co., Ltd.에 의해 생산되고, 영역 표준화 방법에 의해 2개의 검출기(예를 들어, UV 검출기 및 증기화 광 산란 검출기)에 의한 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 측정된 백색 분말.
약물은 모두 정제수에 용해되고, 여과되고, 4℃에서 이후 사용을 위해 분할 충전되도록 디점드(degermed)되고, 본 시험에서 검출되는 약물로 제공된다.
(2) 검출 기계 및 시약
Figure pct00020
2.2: 시험 방법
(1) 마우스의 반치사량에 대한 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스의 결정
인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 대해 10배 구배 희석(세포 용해 완충액)을 수행하여 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 및 10-5의 농도를 갖는 바이러스 용액을 획득하고; 60마리의 인플루엔자 바이러스 및 60마리의 파라인플루엔자 바이러스의 120마리의 쿤밍 마우스를 취하고, 각각 6개의 그룹으로 무작위로 나누고, 마우스를 에틸 에테르로 가볍게 마취시키고, 마우스 당 0.03mL의 용량으로 다양한 희석도의 바이러스 용액을 감염시키기 위해 비내 흡입을 수행하고; 블랭크 대조군을 동시에 설정하고, 바이러스 현탁액을 식염수로 대체하고, 사망 및 생존을 관찰 지표로 취하고, 감염 후 14일 이내에 매일 마우스를 관찰하고, 감염 후 24시간 이내에 비특이적 사망을 겪은 마우스를 계수하지 않고, 카버 방법에 의해 바이러스 용액의 LD50을 계산하고, 여기서 계산식은 다음과 같다:
Figure pct00021
[여기서, TCID50: 반치사량; XM: 바이러스의 가장 높은 농도의 희석도의 대수; d: 희석도 계수(배수)의 대수; ∑pi: 다양한 희석도의 병변 백분율의 합계].
(2) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 내성 폐렴에 대한 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 연구
1) 실험 동물 및 그룹
2개의 시험을 수행하기 위해 4주령의 960마리의 쿤밍 마우스를 취하고; 480마리의 마우스를 취하고, 인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 마우스의 폐 지수 및 폐 지수 억제율에 대한 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드를 결정하는 시험에 사용되는 한 그룹에서 10마리의 마우스의 수량으로 48개의 그룹으로 마우스를 무작위로 나누고, 3회 반복적으로 시험하고(여기서, 각 횟수에서 80마리의 마우스를 취함); 나머지 480마리의 마우스를 취하고, 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가에 대한 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드를 결정하는 시험에 사용되는 한 그룹에서 10마리의 마우스의 수량으로 48개의 그룹으로 마우스를 무작위로 나누고, 3회 반복적으로 시험한다(여기서, 각 횟수에서 80마리의 마우스를 취함).
2) 감염 방법
탈지면 뭉치를 200-300mL의 비커에 두고, 적절한 양의 에틸 에테르(탈지면을 적시는 것만 가능)를 붓고, 탈지면으로 충전된 비커에서 손을 떼고, 마취를 위해 마우스를 넣은 후, 마우스는 극도로 흥분하고, 마우스가 명백히 약해진 경우 마우스를 올리고, 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스를 감염시키기 위해 콧구멍 당 0.03ml의 용량으로 비내 흡입을 수행하고, 정상 대조군 그룹에서 바이러스 현탁액을 식염수로 대체한다.
3) 투여 방법 및 투여량
감염 전 하루 이내에 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드 그룹, 리바비린 대조군 그룹 및 오셀타미버 포스페이트 대조군 그룹에 대해 정기적인 위내 투여를 각각 수행하고(여기서, 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 높은, 중간 및 낮은 투여량은 각각 10.0mg/kg, 5.0mg/kg 및 2.5mg/kg이고, 양성 약물 리바비린의 투여량은 58.5mg/kg이고, 양성 약물 오셀타미버 포스페이트의 투여량은 19.5mg/kg이고, 필리게닌의 투여량은 13.0mg/kg임); 5일 동안 하루에 1회 지속적으로 투여하고, 바이러스 대조군 그룹에서 동일 부피의 식염수로 위내 투여를 수행한다.
4) 관찰 지표
① 폐 지수 결정
각각의 마우스의 투여 후 5일째에 8시간 동안 음식 및 물을 억제하고, 칭량하고, 안구를 적출하고, 방혈시키고, 동물을 희생시키고, 전체 폐를 적출하기 위해 흉부를 개방하고, 폐를 식염수로 2회 세척하고, 여과지를 이용하여 표면 수분을 흡인하여 건조시키고, 전자 저울을 이용하여 폐를 칭량하고, 다음 식에 따라 폐 지수 및 폐 지수 억제율을 계산한다:
폐 지수 = (마우스 폐 중량/마우스 체중) x 100%; 폐 지수 억제율 = (감염 모델 그룹의 평균 폐 지수 - 시험 그룹의 평균 폐 지수)/감염 모델 그룹의 평균 폐 지수 x 100%.
② 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가 결정
처리 후 5일째에 다양한 그룹의 마우스의 폐를 각각 취하고, 폐를 저온에서 균질화기에 의해 균질액으로 분쇄시키고, 균질액을 식염수를 이용하여 10%의 폐 조직 현탁액으로 희석시키고, 원심분리하여 상층액을 취하고, 2배 희석을 수행하고, 0.2ml/웰에 따라 적정 플레이트로 떨어뜨리고, 0.2ml의 1% 닭 적혈구 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 균일하게 혼합하고, 30분 동안 실온에 방치하고, 적혈구응집 역가를 관찰하고 기록하고, 여기서 적혈구 응집(++) 시간이 종점으로 취해지며, 현탁액 희석 비가 역가를 나타낸다.
2.3: 시험 결과 및 분석
(1) 마우스의 반치사량에 대한 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스의 결정 결과
시험 그룹의 쿤밍 마우스는 각각 30μL의 다양한 농도의 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스로 감염되는 비내 흡입에 적용되고, 감염 후 3일째에, 이전 3개 그룹(10-1, 10-2 및 10-3의 각각의 바이러스 농도를 갖는 그룹)의 마우스는 모피 털운동(pilomotor fur), 진전, 감소된 식욕 등과 같은 다양한 정도의 질병 증상을 갖고; 5일째에, 마우스는 비틀거리고; 6일째에, 가장 높은 바이러스 농도를 갖는 그룹의 마우스는 사망하기 시작하고, 감염 후 7일째부터 다른 다양한 그룹의 마우스가 연속적으로 사망하기 시작한다. 14일의 관찰이 완료된 후, 다양한 그룹의 사망한 마우스의 수를 계수하고, 결과가 하기 표 1-4 및 표 1-5에 제시된다. 인플루엔자 바이러스의 LD50이 10-2.9의 희석으로 계산되고, 파라인플루엔자 바이러스의 LD50이 10-2.5의 희석으로 계산된다.
표 1-4: 반치사량에 대한 인플루엔자 바이러스의 시험 결과의 통계
Figure pct00022
바이러스의 LD50은 카버 방법에 의해 계산된다. 인플루엔자 바이러스의 LogLD50은 하기와 같다:
Figure pct00023
표 1-5: 반치사량에 대한 파라인플루엔자 바이러스의 시험 결과의 통계
Figure pct00024
바이러스의 LD50은 카버 방법에 의해 계산된다. 파라인플루엔자 바이러스의 LogLD50은 하기와 같다:
Figure pct00025
(2) 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 감염에 의해 야기된 내성 폐렴에 대한 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 작용 결과
① 폐 지수 결정
마우스가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 후, 평균 폐 지수의 결정 결과는 감염 모델 그룹에 비해 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드의 농도가 2.25-10.0mg/kg/d의 범위 내에서 특정 보호 효과를 갖고, 폐 지수가 명백히 감소되고; 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 대한 높은 용량의 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드 그룹의 치료 효과가 필리게닌 그룹의 치료 효과보다 우수(P<0.05)한 것을 나타낸다. 시험 결과는 표 1-6 및 표 1-7에 제시된다.
표 1-6: 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 지수 및 폐 지수 억제율에 대한 화합물 I의 영향
Figure pct00026
표 1-7: 파라인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 지수 및 폐 지수 억제율에 대한 화합물 I의 영향
Figure pct00027
② 폐 현탁액 바이러스 적혈구응집 역가 결정
마우스가 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 의해 감염된 후, 감염 모델 그룹에서의 폐 조직 바이러스 적혈구응집 역가(InX)는 각각 31.64 및 32.06이고; 마우스가 5일까지 다양한 농도의 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드로 처리된 후, 폐 조직 바이러스 적혈구응집 역가는 약간 감소되고; 감염 모델 그룹에 비해 차이는 명백하며(P<0.01), 여기서 중간 용량 및 높은 용량의 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드 그룹의 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스에 대한 바이러스 적혈구응집 역가는 모델 그룹에서의 것보다 명백히 낮고, 억제율은 필리게닌 그룹에서의 억제율보다 모두 높고, 차이는 명백하다(P<0.05, p<0.01). 시험 결과는 표 1-8 및 표 1-9에 제시된다.
표 1-8: 인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 현탁액 적혈구응집 역가에 대한 화합물 I의 영향
Figure pct00028
표 1-9: 파라인플루엔자 바이러스 감염된 마우스(n=3)의 폐 현탁액 적혈구응집 역가에 대한 화합물 I의 영향
Figure pct00029
2.4: 결론
생체 내 항바이러스 시험 결과는 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드가 2.25-10mg/kg/d의 투여량 범위 내에서 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 바이러스에 의해 야기된 마우스 바이러스 폐렴에 대한 명백한 억제 효과를 갖고, 마우스의 폐 지수 및 적혈구응집 역가를 명백히 감소시키고 폐 병변을 명백히 개선시키는 효과를 달성할 수 있고, 바이러스 모델 대조군 그룹에 비해 차이는 명백하고; 또한, 중간 용량 및 높은 용량의 33-하이드록시 필리게닌-8-O-β-D-글루쿠로니드 그룹의 치료 효과는 필리게닌의 것보다 명백히 우수하고(*P<0.05 또는 **P<0.01), 중간 용량 및 높은 용량의 그룹은 리바비린 및 오셀타미버 포스페이트보다 우수한 경향을 갖는 것을 제시한다.
화합물 II 및 III는 화합물 I과 동일하고, 인플루엔자 바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스뿐만 아니라 바이러스에 의해 야기되는 마우스 바이러스 폐렴에 대한 명백한 억제 효과를 갖고, 마우스의 폐 지수 및 적혈구응집 역가를 명백히 감소시키고 폐 병변을 명백히 개선시키는 효과를 달성할 수 있으며, 바이러스 모델 대조군 그룹에 비해 차이는 명백하다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 (I)로 제시되는 일반 분자식을 포함함을 특징으로 하는 필리게닌 글루쿠론산 유도체:
    Figure pct00030

    상기 식에서, R1은 H이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 CnH2n +1이거나, R1은 CnH2n +1이고, R2는 CnH2n +1이고, R3는 H이거나, R1-R2는 -CH2-이고, R3는 CnH2n +1이고; n은 1-30이다.
  2. 제1항에 있어서, n이 1임을 특징으로 하는 유도체.
  3. 하기 단계를 순차적으로 포함함을 특징으로 하는 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 제조 방법:
    1) 포르시티아(forsythia) 잎 및 추출 용매수를 혼합하고, 가열하고, 2-3회 달여서(decocting) 추출하고, 추출 용액을 수거하여 통합시켜, 포르시티아 물 추출물을 획득하는 단계;
    2) 거대다공성 수지 컬럼을 채택하여 포르시티아 물 추출물을 분리시키고, 용리액을 수거하여 통합시켜, 포르시티아 수지 컬럼 용리액을 획득하는 단계;
    3) 포르시티아 수지 컬럼 용리액에 대해 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하고, 용리액을 단계별로 수거하고, 용리액을 각각 건조시킴으로써, 생성물을 획득하는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 단계 1)의 각각의 달임 공정에서, 포르시티아 잎 대 추출 용매수의 중량비가 1:6-10임을 특징으로 하는 제조 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 방법이 단계 1)에서의 포르시티아 물 추출물을 농축시키는 단계, 포르시티아 농축 용액을 제조하는 단계, 및 거대다공성 수지 컬럼 분리 처리를 수행하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 제조 방법.
  6. 제5항에 있어서, 농축 처리에 의해 제조된 포르시티아 농축 용액의 부피 대 포르시티아 잎의 중량의 비가 (1-5):1임을 특징으로 하는 제조 방법.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 단계 3)에서, C18 역상 실리카-겔이 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 공정에서 패킹으로서 제공되고; 크로마토그래피 컬럼의 명세가 10-100mm의 내부 직경 및 10-300mm의 길이를 포함하고; 패킹의 입자 크기가 5-10μm이고; 이동상이 등용매 용리 방식 또는 구배 용리 방식으로 용리됨을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 실리카-겔 컬럼 크로마토그래피 공정의 이동상이 메탄올 및 물의 혼합 용액이고, 메탄올 대 물의 부피비가 8:2-10:1임을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 제1항의 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 항바이러스 용도.
  10. 인플루엔자 바이러스를 예방하고/하거나 치료하기 위한 약물의 제조에서의 제1항의 필리게닌 글루쿠론산 유도체의 용도.
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