CN105331653B

CN105331653B - 一种制备抗病毒药物连翘脂素的方法

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Publication number: CN105331653B
Application number: CN201410387568.3A
Authority: CN
Inventors: 樊宏宇; 富力
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2020-03-31
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: CN105331653A

Abstract

本发明涉及一种制备抗病毒天然产物连翘脂素的方法，包括对连翘苷进行酶水解处理。本发明方法制备的具有抗病毒功能的连翘脂素的得率相比于从连翘等植物中分离得到的天然存在的连翘脂素的含量提高25倍以上，显著降低了连翘脂素的生产成本，克服了现有提取分离技术对连翘苷破坏性大，污染严重，杂质较多等缺点，本发明的制备方法的转化率高，适用于工业化大规模生产。

Description

一种制备抗病毒药物连翘脂素的方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及连一种抗病毒化合物连翘脂素的制备新方法。

背景技术

连翘脂素，为连翘苷的糖配基部分，又称作连翘苷元，为木犀科连翘属植物连翘的主要活性成分，其结构如下式所示，现代药理研究表明，连翘脂素有抗病毒、抗氧化、降低血脂、清除自由基、抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用。

连翘脂素结构式

连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl)的干燥果实，主要分布于我国河南、山西、陕西、山东等地，此外，湖北、河北、四川、甘肃亦有分布。常用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症[1]。连翘的主要成分为连翘苷(phill-yrin)，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等药理作用[2-5]，同时含有少量连翘脂素((+)-phillygeninin)。从天然连翘中提取连翘苷的研究已有大量研究报道，但由于连翘脂素在连翘中含量较低，因此用提取分离的方法收率较低。

在用人肝癌细胞(SMMC-7721)进行体外活性研究中，连翘苷没有活性，连翘脂素具有活性；在用小鼠黑色素肉瘤细胞B16对连翘脂素和连翘苷抗癌活性研究中，连翘苷没有效果，而连翘脂素对小鼠黑色素肉瘤细胞B16有较强的抑制活性，甚至强于阳性对照的长春新碱。可见，连翘苷和连翘脂素在抗病毒、抗肿瘤等方面的药理作用，具有明显差异。研究表明，连翘苷在体内迅速代谢成连翘脂素后发挥药理作用。因此，连翘脂素有可能是连翘苷的前体物质。所以研究如何将连翘苷转化为连翘脂素，对连翘资源深度开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是针对连翘脂素提取分离的现有技术中存在的连翘脂素得率低，生产成本包等技术问题，提供一种连翘脂素的制备方法，本发明方法克服现有技术不足，利用商品化酶对连翘苷进行酶解反应制备具有抗病毒功能的天然产物连翘脂素，本发明方法操作工艺过程简单，生产周期短。制备得到的连翘脂素含量高，产率高，显著降低了连翘脂素的生产成本，适宜批量制备和工业化生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种制备连翘脂素的方法，包括对连翘苷进行酶水解处理。

其中，所述酶水解处理过程中的酶选择纤维素酶、蜗牛酶、β-葡萄糖苷酶、苦杏仁酶或果胶酶，优选为纤维素酶、蜗牛酶、β-葡萄糖苷酶。

特别是，所述酶与连翘苷的质量比为1-10∶1，优选为1-5∶1。

其中，所述酶水解处理是将连翘苷和酶与缓冲溶液混合均匀后，于37～50℃温度下，反应12～48小时。

特别是，所述酶水解处理的温度优选为40-50℃；反应时间优选为24-36h。

其中，所述缓冲液选择醋酸盐缓冲溶液；缓冲液的pH值为5-6.5，优选为5.2-6.0。

特别是，所述醋酸盐缓冲溶液为醋酸-醋酸钠缓冲溶液。

特别是，所述醋酸盐缓冲溶液的pH值为5-6.5，优选为5.2-6.0。

尤其是，所述醋酸盐缓冲溶液的用量为每1g连翘苷溶于20-30ml的醋酸盐缓冲溶液，优选为25ml所述醋酸盐缓冲溶液。

特别是，还包括终止酶水解处理步骤，向酶水解处理后的混合物中醇-水溶液。

其中，所述醇-水溶液选择甲醇水溶液或乙醇水溶液。

特别是，所述甲醇水溶液的质量百分比浓度为20-40％，优选为30％；所述乙醇水溶液的质量百分比浓度为20-40％，优选为30％。

尤其是，所述醇-水溶液的用量为每1g连翘苷添加10-100mL的所述醇-水溶液，优选为10-20mL。

特别是，还包括分离纯化处理步骤，首先对酶解终止处理后的混合液进行固液分离，接着对分离得到的固体依次进行洗涤、溶解、回收溶剂、重结晶处理。

其中，所述洗涤采用高纯水、醇-水溶液分别进行洗涤2-3次。

特别是，所述洗涤处理用醇-水溶液选择质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液。

其中，所述的溶解处理是将洗涤后的固体溶于石油醚。

特别是，采用甲醇溶剂进行所述的重结晶处理。

本发明公开了一种利用酶对连翘苷进行酶解反应制备具有抗病毒活性的天然药物连翘脂素的方法，然后以含醇水溶液终止酶解反应，再利用溶剂重结晶对酶解产物进行分离，得到连翘脂素纯品。

所述的制备抗病毒天然药物连翘脂素的方法，对酶解产物的分离纯化是指酶解终止后，将溶剂减压蒸干，残留物加石油醚溶解，过滤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到连翘脂素粗品，再用甲醇等有机溶剂重结晶。

通过上述制备方法所得连翘脂素在常温下为白色固体，HPLC纯度为99％。连翘脂素的结构鉴定：ESI-MS m/z 371[M-H]，分子量为372。

1H-NMR(600MHz，d6-DMSO)δ：8.873(m，2H，OH)，6.933-6.582(m，6H)，4.74-4.778(d，1H，J＝6.4Hz)，4.232-4.249(d，1H，J＝6.8Hz)，4.007-4.029(d，2H，J＝8.8Hz)，3.743(m，7H)，3.717(t，2H，J＝8.4Hz)，2.83(t，1H，J＝8.6Hz)，2.759-2.780(s，1H)；

13C-NMR(150MHz，d6-DMSO)δ：49.7(C-5)，54.2(C-1)，55.9(O-CH3)，69.2(C-4)，70.8(C-8)，81.6(C-6)，87.3(C-2)，109.7(C-2″)，111.9(C-5″)，113.8(C-2′)，115.6(C-5′)，117.5(C-6″)，117.9(C-6′)，131.6(C-1″)，132.8(C-1′)，145.1(C-4′)，145.5(C-3′)，147.9(C-3″)，148.8(C-4″)。

上述光谱数据与文献报道的连翘脂素一致，故鉴定此化合物为连翘脂素((+)-phillygeninin)。

本发明方法具有如下优点：

1、本发明方法是通过酶解转化的方法，从连翘苷制备具有抗病毒功能的连翘脂素，显著降低了连翘脂素的生产成本(连翘植物中连翘脂素含量低于1％)；

2、本发明克服了现有提取分离技术对连翘苷破坏性大、污染严重、杂质较多等缺点；

3、本发明的制备方法的转化率高，适用于工业化大规模生产；

4、本发明制备工艺方法简单，连翘脂素得率高，耗能低，环保，操作工艺条件容易控制，质量可控性强；

5、本发明方法采用酶水解处理连翘苷，反应条件温和、无化学试剂残留，不产生二次污染，减少了对环境的污染，可选择性地水解连翘苷，酶反应效率高，降低生产成本，提高生产效率。

具体实施方式

以下通过实施例进一步描述本发明，但这些实施例仅是说明本发明，而不应理解为对本发明范围的任何限制。另外，实施例中的试剂、原料都可以通过商业渠道获得，如有未尽之处，可以参考有机合成指南、药品监管机构的指引以及相应仪器、试剂的厂商说明书等。

实施例1

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、纤维素酶(2g)加入到装有50mL、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至37℃，在保持温度为37℃条件下，进行酶水解反应24h，其中连翘苷与纤维素酶的质量比为1∶1；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液，搅拌，使酶变性及终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的乙醇水溶液的用量为20mL，即每1g连翘苷添加10mL的乙醇水溶液；

3、分离纯化处理

对含有连翘脂素的混悬液进行离心处理(5000rpm，10min)，弃去上清液，离心沉淀用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.38g，产率99％，HPLC纯度为99％。

连翘脂素为白色固体、熔点134-136℃、溶于氯仿、甲醇。与连翘脂素标准品(购自中国药品生物制品检定所)的物理特性相同，与连翘脂素标准品混合后熔点一致。

ESI-MS谱中，m/z[M-H]371，分子量为372。

¹H-NMR(600MHz，d₆-DMSO)：δ：8.873(m，2H，OH)，6.933-6.582(m，6H)，4.74-4.778(d，1H，J＝6.4Hz)，4.232-4.249(d，1H，J＝6.8Hz)，4.007-4.029(d，2H，J＝8.8Hz)，3.743(m，7H)，3.717(t，2H，J＝8.4Hz)，2.83(t，1H，J＝8.6Hz)，2.759-2.780(s，1H)；

¹³C-NMR(150MHz，d₆-DMSO)：δ：49.7(C-5)，54.2(C-1)，55.9(O-CH3)，69.2(C-4)，70.8(C-8)，81.6(C-6)，87.3(C-2)，109.7(C-2″)，111.9(C-5″)，113.8(C-2′)，115.6(C-5′)，117.5(C-6″)，117.9(C-6′)，131.6(C-1″)，132.8，(C-1′)，145.1(C-4′)，145.5(C-3′)，147.9(C-3″)，148.8(C-4″)。

实施例2

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、纤维素酶(4g)加入到装有50mL、pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至50℃，在保持温度为50℃条件下，进行酶水解反应12h，其中连翘苷与纤维素酶的质量比为1∶2；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为30％的甲醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的甲醇水溶液的用量为20mL，即每1g连翘苷添加10mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

对含有连翘脂素的混悬液进行离心处理(5000rpm，10min)，弃去上清液，离心沉淀用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.36g，产率98％，HPLC纯度为99％。

重结晶获得的白色固体的理化特性、光谱数据、质谱数据与文献报道的连翘脂素一致，故鉴定此化合物为连翘脂素((+)-phillygeninin)。

实施例3

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、蜗牛酶(2g)加入到装有50mL、pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至43℃，在保持温度为43℃条件下，进行酶水解反应48h，其中连翘苷与蜗牛酶的质量比为1∶1；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为40％的甲醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的甲醇水溶液的用量为30mL，即每1g连翘苷添加15mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

实施例4

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、β-葡萄糖苷酶(20g)加入到装有50mL、pH5.6的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至50℃，在保持温度为50℃条件下，进行酶水解反应12h，其中连翘苷与β-葡萄糖苷酶的质量比为1∶10；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为20％的甲醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的甲醇水溶液的用量为40mL，即每1g连翘苷添加20mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

对含有连翘脂素的混悬液进行离心处理(5000rpm，10min)，弃去上清液，离心沉淀用依次10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.32g，产率95％，HPLC纯度为99％。

实施例5

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、纤维素酶(10g)加入到装有40mL、pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至40℃，在保持温度为40℃条件下，进行酶水解反应24h，其中连翘苷与纤维素酶的质量比为1∶5；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的乙醇水溶液的用量为30mL，即每1g连翘苷添加15mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

对含有连翘脂素的混悬液进行离心处理(5000rpm，10min)，弃去上清液，离心沉淀用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.29g，产率93％，HPLC纯度为99％。

实施例6

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、蜗牛酶酶(10g)加入到装有50mL、pH5.2的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至37℃，在保持温度为37℃条件下，进行酶水解反应36h，其中连翘苷与纤维素酶的质量比为1∶5；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为20％的乙醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的乙醇水溶液的用量为40mL，即每1g连翘苷添加20mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

对含有连翘脂素的混悬液进行离心处理(5000rpm，10min)，弃去上清液，离心沉淀用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.32g，产率95％，HPLC纯度为99％。

实施例7

1、酶水解处理

将连翘苷(2g)、β-葡萄糖苷酶(4g)加入到装有60mL、pH6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至50℃，在保持温度为50℃条件下，进行酶水解反应24h，其中连翘苷与纤维素酶的质量比为1∶2；

2、酶水解反应终止处理

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为40％的乙醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的乙醇水溶液的用量为20mL，即每1g连翘苷添加10mL的甲醇水溶液；

3、分离纯化处理

试验例1连翘脂素抗病毒试验

1体外抗病毒试验

1.1试验材料

(1)药物

1)实施例2制备的连翘脂素：白色固体，大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.1％；

2)利巴韦林注射液，无色透明液体，由河南润弘股份有限公司生产，产品批号：1206261，国药准字：H19993553，100mg/ml，作为本次试验阳性对照药物。

3)磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-200901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。

上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为待测药物。

(2)细胞株

Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)由吉林大学基础医学院保存细胞株。

(3)病毒株

1)流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。

2)副流感病毒购于中国预防医学科学院病毒研究所。

3)呼吸道合胞病毒(RSV)购于中国预防医学科学院病毒研究所。

4)柯萨奇病毒B₃(CVB₃)株来源于美国，为本教研室保存。

5)柯萨奇病毒A16(CoxA16)株由日本仙台国立医院馈赠，于本教研室保存。

6)肠道病毒EV71株由日本仙台国立医院馈赠，于本教研室保存。

7)腺病毒(AdV)来源于白求恩医科大学一院儿科研究室。

8)单纯疱疹病毒I型(HSV-1)购于卫生部药品生物制品检定所。

(4)主要设备与试剂：

1.2试验方法

(1)细胞准备

Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×10⁷个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。

(2)药物毒性测定

细胞毒性试验：将药物按表1-1所示浓度进行稀释，用于细胞毒性测定。

表1-1 药物稀释参照表(单位：g/L)

将上述用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO₂培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL^-1)，继续孵育4h，吸弃各孔培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS 18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)和半数毒性浓度(TC₅₀)。

(3)各种病毒TCID₅₀的测定

将各种病毒进行10倍递减稀释为10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6不同稀释度，按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上，每孔100μL，每个稀释度6孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO₂中孵育2h，弃病毒液，随即每孔加细胞维持液100μL，置37℃，5％CO₂中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果，第7-8天判定结果并做好记录，以能使50％细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。

公式

TCID₅₀：50％组织细胞感染量

XM：病毒最高浓度稀释度的对数

d：稀释度系数(倍数)的对数

∑pi：每个稀释度病变百分数的总和

(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响

取已长满单层细胞的培养板，吸弃培养液，以100TCID₅₀对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO₂培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设利巴韦林注射液和磷酸奥司他韦为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS 18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。

ER％＝(药物处理组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100％

1.3试验结果

(1)各种病毒的TCID₅₀

副流感病毒：

流感病毒：

CVB₃：

HSV-1：

AdV：

RSV：

CoxA16：

EV71：

(2)药物毒性测定

1)药物对细胞毒性的测定

各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)、半数毒性浓度(TC₅₀)及药物抗病毒实验用浓度见表1-2。

表1-2 药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)

2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果

药物抗各种病毒的有效率及ANOVA法单因素方差分析结果，详见表1-3。

表1-3 药物抗病毒有效率(ER％)统计表

表1-3结果显示，连翘脂素对流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒I型(HSV-I)、肠道病毒EV71均有明显抑制作用；其中，连翘脂素对流感病毒、副流感病毒、单纯疱疹病毒I型(HSV-I)的疗效与阳性药利巴韦林、磷酸奥司他韦相当，对呼吸道合胞病毒(RSV)的疗效优于磷酸奥司他韦，对肠道病毒EV71的疗效显著优于利巴韦林和磷酸奥司他韦(达菲)。

2.体内抗病毒试验

2.1实验材料

(1)实验动物

昆明种小鼠由吉林大学基础医学院动物部提供，合格证号：医动字第10-5512号。

(2)实验仪器

定量PCR仪，7300，ABI；PCR仪，ES-60J，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；电子分析天平，FA1004，沈阳龙腾有限公司；CO₂孵育箱，HG303-5，南京实验仪器厂；超净工作台，SW-CJ-IF，苏州安泰技术有限公司；倒置显微镜，CKX41，Olympus Instrument；-80℃超低温冰箱，TECON-5082，澳大利亚；水浴振荡器，HZS-H，哈尔滨市东联有限公司；酶标仪，TECAN A-5082，澳大利亚；分光光度计，7550型；日本。

2.2实验方法

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定

将流感病毒和副流感病毒(细胞裂解液)10倍递比稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的病毒液。取昆明种小鼠120只，流感病毒和副流感病毒组各60只，分别随机分成6组，乙醚轻度麻醉小鼠，滴鼻感染不同稀释度病毒液0.03mL/只。同时设空白对照，用生理盐水代替病毒悬液。以死亡和生存为观察指标，每天观察，直至感染后的14天。感染24h内死亡的为非特异死亡，不予统计，Karber法计算病毒液LD50。计算公式：

[其中：LD₅₀：半数致死量；XM：病毒最高浓度稀释度的对数；d：稀释度系数(倍数)的对数；∑pi：每个稀释度病变百分数的总和]。

(2)连翘脂素抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究

1)试验动物及分组

取四周龄的昆明小鼠240只，进行2项试验。取小鼠120只，随机分成12组，每组10只，用于连翘脂素对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验。另取小鼠120只，随机分成12组，每组10只，用于连翘脂素对肺悬液病毒血凝滴度的测定试验。

2)感染方法

在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染15LD₅₀流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。

3)给药方法及给药剂量

连翘脂素、利巴韦林和磷酸奥司他韦对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，连翘脂素高、中、低给药剂量分别为16、8、4mg/kg，利巴韦林、磷酸奥司他韦阳性药给药剂量分别为19.5mg/kg、58.5mg/kg，每天一次，连续给药5d，病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。

4)观察指标

①肺指数测定

小鼠用药后第5天，先禁食水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：

肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％。

肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％。

②肺悬液病毒血凝滴度测定

分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，低温下置匀浆器研磨成匀浆，生理盐水稀释为10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上，每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液，混匀，置室温30min，观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为终点，以悬液稀释倍数表示其滴度。

2.3实验结果及分析

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定结果

实验组昆明种小鼠分别被滴鼻感染不同浓度流感病毒、副流感病毒液30μL，感染第3天前3组(病毒浓度为10^-1组、10^-2组、10^-3组)小鼠均出现不同程度的发病症状：耸毛、发抖、饮食减少等；第5天小鼠出现走路摇摆不定；第6天最高病毒浓度组小鼠开始出现死亡，其余各组于感染后第7天陆续出现死亡现象。观察14天结束后，统计各组小鼠死亡数目，结果见下表1-4、1-5。计算该流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.9，副流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.5。

表1-4 流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD₅₀。流感病毒的LogLD₅₀如下：

表1-5 副流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD₅₀。副流感病毒的LogLD₅₀如下：

(2)连翘脂素抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用结果

①肺指数测定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数结果显示：与病毒对照组(模型组)组比较，连翘脂素(高、中、低剂量)组、阳性对照药利巴韦林及磷酸奥司他韦(达菲)组肺指数明显降低(P＜0.01或P＜0.05)，连翘脂素浓度在4.0～16.0mg/kg/d范围内对流感和副流感病毒感染的小鼠肺组织有明显保护作用，肺指数均明显降低。结果见表1-6、1-7。

表1-6 连翘脂素对流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率

与病毒对照组比较，*P＜0.05，**P，0.01。

表1-7 连翘脂素对副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数的抑制率

*表示与病毒对照组比较#表示与利巴韦林组比较

2.4结论

体内抗病毒试验结果显示，连翘脂素在4.0～16.0mg/kg/d的剂量范围对流感病毒和副流感病毒及所引起的小鼠病毒性肺炎具有较明显的抑制作用，能明显降低其肺指数和血凝滴度，与病毒模型对照组比较差异显著(P＜0.01)，且与阳性对照药利巴韦林和磷酸奥司他韦(达菲)的疗效相近。

Claims

1.一种制备连翘脂素的方法，包括对连翘苷进行酶水解处理、终止酶水解处理和分离纯化处理步骤，其中，所述酶水解处理为：

将2g连翘苷、2g蜗牛酶加入到装有50mL、pH5.4的醋酸-醋酸钠缓冲液的三角瓶中，搅拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至43℃，在保持温度为 43℃条件下，进行酶水解反应48h，其中连翘苷与蜗牛酶的质量比为1∶1；

所述酶水解反应终止处理为：

向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度40％的甲醇水溶液，搅拌终止酶水解反应，制得含有连翘脂素的混悬液，其中，加入的甲醇水溶液的用量为30mL，即每1g连翘苷添加15mL的甲醇水溶液；

所述分离纯化处理为：

对含有连翘脂素的混悬液以5000rpm进行离心处理10min，弃去上清液，离心沉淀用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30％的乙醇水溶液各洗涤3次，其中每次洗过程中所述高纯水的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；乙醇水溶液的体积与离心处理后的沉淀的体积之比为10∶1；接着用石油醚将沉淀溶解，过滤，滤液回收溶剂石油醚后得到连翘脂素粗品固体；然后采用甲醇对连翘脂素粗品固体进行重结晶处理，得到连翘脂素纯品1.36g，产率98％，HPLC纯度为99％。