CN116196321A

CN116196321A - 双环氧木脂素化合物及组合物抗病毒的应用和制备

Info

Publication number: CN116196321A
Application number: CN202111447121.7A
Authority: CN
Inventors: 王硕; 杨子峰; 鲁明明; 马钦海; 柳洋; 杨威; 林荣鑫; 李凡; 盖鑫
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2021-12-01
Filing date: 2021-12-01
Publication date: 2023-06-02
Also published as: WO2023098650A1

Abstract

本发明提供了双环氧木脂素类化合物、双环氧木脂素组合物的对流感病毒、副流感病毒、COVID‑19病毒与COVID‑19病毒变异株预防和治疗的应用，对COVID‑19病毒与COVID‑19病毒变异株(如，Delta)所致肺出血的预防和治疗的应用，以及对由流感病毒、副流感病毒、COVID‑19病毒与COVID‑19病毒变异株引起的肺炎的抗炎作用的应用。另外，本发明还提供了双环氧木脂素类化合物连翘新苷的化学合成方法。

Description

双环氧木脂素化合物及组合物抗病毒的应用和制备

技术领域

本发明属于医药技术领域和药物化学领域，具体而言，本发明涉及双环氧木脂素类化合物和双环氧木脂素组合物对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及的COVID-19病毒诸多变异株的预防作用，对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及COVID-19病毒诸多变异株所致疾病的治疗作用，对COVID-19病毒及COVID-19病毒诸多变异株所致的肺出血的治疗作用，以及由流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及的COVID-19病毒诸多变异株所致肺炎的治疗作用等，以及还涉及连翘新苷的合成方法等。

技术背景

流行性感冒病毒简称流感病毒，分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来才发现的流感病毒将归为丁(D)型。其典型的临床症状是急性高热、全身疼痛、显著乏力和呼吸道症状。流感病毒主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。一般秋冬季节是其高发期。人类副流感病毒(HPIVs)常常引起儿童下呼吸道感染、反复发作的上呼吸道感染(如感冒和喉咙痛)及反复感染的下呼吸道疾病(如肺炎，支气管炎和细支气管炎)，老年人及有免疫缺陷的人群，常常受到感染。COVID-19，即2019冠状病毒病(又称新型冠状病毒，SARS-CoV-2)，属于冠状病毒。COVID-19病毒不断演变出变异株，其中有代表性的变异株包括Alpha(B.1.1.7)、Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)和Delta(B.1.617.2)等，它们的变异使得临床的防治进一步复杂化(参见Paulo R S Sanches，等.Recentadvances in SARS-CoV-2Spike protein and RBD mutations comparison between newvariants Alpha(B.1.1.7,United Kingdom),Beta(B.1.351,South Africa),Gamma(P.1,Brazil)and Delta(B.1.617.2,India).J Virus Erad，7(3)：100054；Kaiming Tao，等.Thebiological and clinical significance of emerging SARS-CoV-2variants.Nat RevGenet，17：1-17)。近年来，流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异病毒的流行，对人类健康的影响越来越严重。与此同时，炎症的发生也一直困扰人类。

连翘为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)植物连翘(Forsythia suspense(Thunb.)Vahl)的干燥果实，主要分布于我国河南、山西、陕西、山东等地，此外，湖北、河北、四川、甘肃亦有分布。常用于治疗急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结结核、尿路感染等症。连翘的主要成分为双环氧木脂素类成分，例如连翘苷(phillyrin)、连翘新苷(分子式C₂₆H₃₂O₁₁，化学名为(7,8,7`,8`)-7,7`-双环氧-5`-羟基-3,3`羟基–二甲氧基木脂素4-O-β-D-葡萄糖苷)、连翘脂素(又称连翘苷元((+)-phillygeninin))等，存在于连翘的花、叶、果实、茎皮及根皮中，也可以用化学合成、生物转化及提取纯化工艺获得。它们的结构式如下：

连翘苷(phillyrin) 连翘脂素((+)-phillygenin)

连翘新苷

近年来，本发明人以化学合成的方式研究出连翘脂素硫酸酯(参见中国专利CN201310580801.5)、连翘脂素葡萄糖醛酸酯(参见中国专利CN201510320579.4)及连翘脂素布洛芬酯(参见中国专利CN201410387045.9)。

结构式如下。

连翘脂素硫酸酯

/>

连翘脂素葡萄糖醛酸酯

连翘脂素布洛芬酯

连翘苷具有抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由基等药理作用。连翘脂素具有抗氧化、降低血脂、清除自由基、抑菌、抗肿瘤、抗病毒抗炎等作用。连翘新苷具有抗氧化、抗炎等作用。连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯及连翘脂素布洛芬酯具有抗病毒作用。

已发表的防治流感病毒与副流感病毒的研究文献中，尚未涉及到双环氧木脂素类化合物连翘新苷，以及双环氧木脂素类组合物包括连翘新苷分别与连翘苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯或连翘脂素布洛芬酯中一种成分组成的组合物，连翘苷分别与连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯中的一种成分组成的组合物，以及连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯四种成分中的两两组合而成的组合物。

已发表的防治新冠病毒的研究文献中，尚未涉及的双环氧木脂素类化合物包括连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯单一化合物以及两两组合的组合物，或连翘苷和连翘新苷组合物，或连翘苷和连翘脂素布洛芬酯组合物。

已发表的防治新冠变异病毒的研究文献中，尚未涉及的双环氧木脂素类化合物包括连翘苷、连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯，以及双环氧木脂素类组合物有连翘苷或连翘脂素分别与连翘新苷、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯中的一种成分组成的组合物，或连翘新苷、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯中两两组合而成的组合物。

本发明人发现的双环氧木脂素类化合物或组合物能够抑制流感病毒、副流感病毒、新冠病毒及新冠病毒变异株，其体外抑制病毒作用明显；对病毒所致疾病的治疗作用明显，病变程度较阳性对照药组(流感阳性对照药为磷酸奥司他韦，新冠及其变异株病毒炎性对照药为瑞德西韦)明显减轻；80mg/kg剂量给药对Delta病毒感染小鼠的治疗作用与瑞德西韦相当，在肺出血和间质性肺炎方面病理改善优于瑞德西韦；13.0mg/kg剂量组能够明显抑制流感、副流感病毒感染小鼠的肺指数，其抑制率明显高于磷酸奥司他韦组；高低剂量组皆能降低流感、副流感感染小鼠的血凝滴度，其低剂量3.25mg/kg的效果与磷酸奥司他韦相当。在肺出血和间质性肺炎方面病理改善优于磷酸奥司他韦；对病毒感染的预防作用显著，能阻止流感病毒和副流感病毒的吸附和进入细胞，阻止作用达75％以上；80mg/kg剂量给药产生的对新冠病毒及其变异株的预防作用与瑞德西韦相当；在流感病毒、新冠病毒导致的肺炎治疗方面，抗炎作用显著，26mg/kg剂量给药的抗炎效果优于磷酸奥司他韦，80mg/kg剂量给药的抗新冠肺炎效果优于瑞德西韦。综上所述，本发明人发现的双环氧木脂素类化合物或组合物具备成为预防和治疗流感病毒、副流感病毒、新冠病毒及其病毒变异株所致疾病的药物的前景。

另外，已发表的文献中，尚未涉及连翘新苷的合成方法。而本发明人设计了连翘新苷合成路线，其原料来源方便、廉价易得，制备成本低，而且可工业化生产，为药物来源提供了新的可能，拓宽了连翘新苷药物的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供新的连翘新苷的化学合成方法，同时，本发明要解决的技术问题还包括提供双环氧木质素类化合物、双环氧木质素组合物对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株的预防应用，对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株所致疾病的治疗作用，对COVID-19病毒及其诸多变异株所致的肺出血的治疗应用，以及双环氧木质素类化合物、双环氧木质素组合物对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株所致肺炎的治疗应用。

具体而言，在第一方面，本发明提供了连翘新苷的合成方法，包括如下步骤：

步骤1)，以香草醛(式1化合物)和3-羟基-5甲氧基苯甲酮(式6化合物)为原料，分别经酚羟基保护，氧化，Claisen缩合反应得到相应的β-酮酸酯(式4化合物)和(式9化合物)，然后分别将两个β-酮酸酯转化为相应的钠盐(式5化合物)和溴化物(式10化合物)，然后将这两个片段通过偶联反应得到中间体(式11化合物)；

步骤2)中间体(式11化合物)经过还原，关环，还原反应得到相应的苷元(式14化合物)。

步骤3)苷元(式14化合物)经过糖苷化，脱酰基，脱硅烷基反应，全合成得到目标产物

化学反应式如下：

a.氯苄；b.高锰酸钾；c.二氯亚砜、乙酰乙酸乙酯/乙醇钠；d.乙醇钠；e.叔丁基二甲基氯硅烷；f.溴水；g.二氯甲烷；h.四氢铝锂；i.甲基磺酰氯/吡啶；j.钯碳/氢气；k.四乙酰葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯；l.甲醇钠；m.四丁基氟化铵.

优选其中：

步骤1)中，式2化合物的合成条件为：香草醛溶于乙腈中，加入碳酸钾、碘化钾和氯苄，回流反应0.5-24小时，即可得到式2化合物；优选5小时。

步骤1)中，酚羟基保护基可以为硅醚保护基、烷基醚保护基、烷氧基甲基醚保护基、酯基保护基，优选为烷基醚保护基、氯苄，进一步优选为氯苄。

步骤1)中，香草醛的溶解溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，优选为乙腈。

步骤1)中，式3化合物的合成条件为：式2化合物溶于热水中，加入氧化剂高锰酸钾，70-80℃反应1小时，即可得到式3化合物。

其中，氧化剂为高锰酸钾、双氧水或三氧化铬，优选为高锰酸钾；反应温度为40-100℃，优选为60-90℃，进一步优选为70-80℃；反应时间为0.2-5h，优选为0.5-2h，进一步优选为1h。

步骤1)中，式4化合物的合成条件为：式3化合物溶于酰氯，95℃反应8小时，去除酰氯，加入无水四氢呋喃，加入乙酰乙酸乙酯的钠盐，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵和含有1％氨水的95％乙醇溶液，回流4小时即可得到式4化合物。

其中，酰氯为草酰氯或二氯亚砜，优选为二氯亚砜；回流温度为50-110℃，优选为90-100℃，进一步优选为95℃；反应时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h；溶剂为四氢呋喃时反应时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h；溶剂为95％乙醇溶液时反应时间为2-6h，优选为3-5h，进一步优选为4h。

步骤1)中，式7化合物的合成条件为：3-羟基-5甲氧基苯甲醛溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷，35℃反应10小时，即可得到式7化合物。

其中，酚羟基保护基有硅醚保护基、烷基醚保护基、烷氧基甲基醚保护基、酯基保护基，优选为硅醚保护基，进一步优选为叔丁基二甲基氯硅烷；溶剂选择N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷，优选为N,N-二甲基甲酰胺；反应温度为10-50℃，优选为20-40℃，进一步优选为35℃；反应时间为8-12h，优选为10h。

步骤1)中，式8化合物的合成条件为：式7化合物溶于热水中，加入高锰酸钾，70-80℃反应1小时，即可得到式8化合物。

其中，氧化剂有高锰酸钾、双氧水、三氧化铬等，优选为高锰酸钾；反应温度为50-100℃，优选为60-90℃，进一步优选为70-80℃；反应时间为0.2-3h，优选为0.5-2h，进一步优选为1h。

步骤1)中，式9化合物的合成条件为：式8化合物加入二氯亚砜，95℃反应8小时，蒸去二氯亚砜，加入无水四氢呋喃，加入乙酰乙酸乙酯的钠盐，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵和含有1％氨水的95％乙醇溶液，回流4小时即可得到式9化合物。

其中，酰氯为草酰氯，二氯亚砜，优选为二氯亚砜；溶剂为二氯亚砜时反应温度为80-110℃，优选为90-100℃，进一步优选为95℃；反应时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h；溶剂为四氢呋喃时反应时间为4-12h，优选为6-10h，进一步优选为8h；溶剂为95％乙醇溶液时反应时间为2-6h，优选为3-5h，进一步优选为4h。

步骤1)中，式11化合物的合成条件为：式4化合物加入溶有等量金属钠的无水乙醇溶液，室温搅拌反应3小时，即可得到式5化合物；式9化合物溶于无水四氢呋喃溶液，加入溴水，室温搅拌反应3小时，即可得到式10化合物；式5化合物、式10化合物溶于二氯甲烷溶液，室温搅拌反应10小时，即可得到式11化合物。

其中，强碱为金属钠的无水乙醇溶液，金属钠的无水甲醇溶液，氢氧化钠溶液，优选为金属钠的无水乙醇溶液；卤素为溴水或碘，优选为溴水；式4化合物反应时间为1-6h，优选为2-5h，进一步优选为3h；式9化合物反应时间为5-15h，优选为8-12h，进一步优选为10h；

式5化合物和式10化合物反应时间为5-15h，优选为8-12h，进一步优选为10h。

步骤2)中，式12化合物的合成条件为：式11化合物溶于无水四氢呋喃中，加入含有四氢铝锂的无水四氢呋喃溶液，回流反应6小时，室温搅拌过夜，即可得到式12化合物。

其中，还原剂为四氢铝锂，二甲氧基乙氧基氢化铝，优选为四氢铝锂；回流反应时间为3-9h，优选为4-8h，进一步优选为6h。

步骤2)中，式13化合物的合成条件为：式12化合物溶于重蒸苯中，加入对甲苯磺酸吡啶盐粉末，回流反应3小时，即可得到式13化合物。

其中，脱水剂选择甲苯磺酸吡啶盐、浓硫酸，优选为甲苯磺酸吡啶盐；溶剂选择甲苯、苯，优选为苯；反应时间为1-6h，优选为2-4h，进一步优选为3h。

步骤2)中，式14化合物的合成条件为：在氢气条件下，式13化合物溶于甲醇中，加入10％钯碳，室温搅拌反应10小时，即可得到式14化合物。

其中，还原剂选择5％钯碳、10％钯碳、20％钯碳，优选为10％钯碳；溶剂选择甲醇、乙醇。正丁醇、异丙醇，优选为甲醇；温度为10-40℃，优选为20-30℃，进一步优选为25℃；反应时间为5-15h，优选为8-12h，进一步优选为10h。

步骤3)中，式15化合物的合成条件为：在氮气保护下，式14化合物溶于无水二氯甲烷中，加入2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯、三氟甲磺酸三甲基硅酯和

型硅铝酸盐分子筛，在0℃下搅拌反应10小时，即可得到式15化合物。

其中，惰性保护气体为氮气、氩气或氦气，优选为氮气；糖基给体2,3,4,6-四-O-酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯选择2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯或2,3,4,6-四-O-苯甲酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯；路易斯酸催化剂选择C₃-C₉的卤代酰胺、C₂-C₈的硅基氟代烃基磺酸酯、C₁-C₆的氟代烃基磺酸银、三氟化硼-乙醚络合物中的一种或多种，优选为N-碘代丁二酰亚胺、三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅酯或三氟化硼-乙醚络合物，进一步优选为三氟甲磺酸银、三氟甲磺酸三甲基硅酯、三氟化硼-乙醚络合物；分子筛选用

型的硅铝酸盐分子筛，优选为/>

型的硅铝酸盐分子筛；溶剂选择二氯甲烷、三氯甲烷，1，2-二氯乙烷或甲苯，优选为二氯甲烷；温度为0-20℃，优选为0-10℃，进一步优选为0℃；反应时间为4-15h，优选为8-10h，进一步优选为10h。

步骤3)中，式16化合物的合成条件为：式15化合物溶二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，加入甲醇钠、在25℃下搅拌反应4小时，即可得到式16化合物。

其中，溶剂二氯甲烷和甲醇的混合溶液中二氯甲烷与甲醇的体积之比为1：1-10，优选为1：2；反应时间为4-12h，优选为4h。

步骤3)中，式17化合物的合成条件为：式16化合物溶于无水四氢呋喃中，加入四丁基氟化铵，在35℃下搅拌反应3小时，即可得到式17化合物。

其中，溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃，优选为四氢呋喃；反应温度为温度为20-40℃，优选为35℃；反应时间为1-5h，优选为3h。

在本发明的一个具体实施方式中，本发明第一方面的应用是以合成方法制备得到连翘新苷，其得率为90％，含量为99.95％。

在第二方面，本发明提供了双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物在制备用于预防或治疗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒或COVID-19病毒变异株的保健食品或药物中的应用。

本发明也提供了双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物在制备用于预防或治疗COVID-19病毒或COVID-19病毒变异株所致肺出血的保健食品或药物中的应用。

另外，本发明也提供了双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物在制备用于抗由流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒与COVID-19病毒变异株引起的肺炎的保健食品或药物中的应用。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明提供了双环氧木质素类化合物和组合物对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株所致疾病的治疗应用。

抗病毒及其治疗作用可以是体内体外抑制病毒作用、抗病毒性炎症作用、改善病毒性炎症导致的肺损伤及对肺组织的保护作用。

COVID-19病毒变异株在原始COVID-19病毒的基础上发生了变异。优选在本发明第二方面的应用中，COVID-19病毒变异株是COVID-19病毒变异株Beta或COVID-19病毒变异株Delta。

在本文中，如无相反指示，组合物中成分的先后顺序，可以互换使用，即组合物作为一个整体计量。优选在本发明中，组合物的各成分的重量比为0.1～99.9％；优选为组合物中的一种成分的重量比为80～99.9％，另外一种或多种成分的重量比为0.1～20％；更优选为组合物中的一种成分的重量比为90～99.9％，另外一种或多种成分的重量比为0.1～10％。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明第二方面的应用是制备用于治疗流感病毒、副流感病毒及COVID-19病毒变异株所致疾病的药物中的应用。即在发生或知晓流感病毒、副流感病毒及COVID-19病毒变异株感染之后再给药双环氧木脂素类化合物和组合物。

双环氧木脂素组合物可以与其他抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株病毒的药物，或治疗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株病毒所致疾病的药物联合使用，也可以单独使用。优选本发明第二方面的应用是双环氧木脂素类合物或组合物作为唯一药物活性成分的应用。例如，所述药物中的唯一活性成分是双环氧木脂素类化合物或组合物。也就是说，本发明第二方面优选提供了双环氧木脂素类化合物或组合物作为唯一药物活性成分在制备用于抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株病毒的药物中的应用，或双环氧木脂素类化合物或组合物作为唯一药物活性成分在制备用于预防或治疗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株病毒所致疾病的药物中的应用。

在本文中，药物可以包括药学上可接受的载体而配制成药物制剂。这对于本领域技术人员来说是熟知的。优选在本发明的应用中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂形式存在。在所述药物中，双环氧木脂素类化合物含量为0.1～99.9％。所述双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物的总重量与药学上可接受的载体的重量之比为1:1～1:100。

在本文中，保健食品可以包括食品科学可接受的载体而制成保健食品制品。这对于本领域技术人员来说是熟知的。优选在本发明的应用中，所述保健食品以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂、糖果蜜饯、茶、饮料、焙烤食品、酒制品等食品形式存在。在所述保健食品中，双环氧木脂素类含量为0.1～99.9％。所述双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物的总重量与食品科学上可接受的载体的重量之比为1:1～1:100。

双环氧木脂素类化合物是双环氧木脂素单体化合物。例如，双环氧木脂素类化合物可以是连翘苷、连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯。双环氧木脂素类化合物是通过化学合成、或生物转化或提取纯化工艺等制得。

在本文中，双环氧木脂素类组合物可以是连翘苷分别与连翘新苷、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯以及连翘脂素布洛芬酯中的一种或多种成分组成的组合物，或者，双环氧木脂素类组合物也可以是连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯以及连翘脂素布洛芬酯中的任意两种或多种成分组成的组合物。双环氧木脂素类组合物是化学合成、或生物转化或提取纯化工艺制成的混合物；也可以是通过化学合成、或生物转化或提取纯化工艺制得单体化合物，并经过配比而成的混合物。组合物中各成分所占比例为0.1～99.9％。

在本发明的另一个具体的实施方式中，本发明提供了双环氧木脂素类化合物和组合物对流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株的预防应用。即，在发生或未知流感病毒、副流感病毒、原始COVID-19病毒或其变异株感染之前，就给予双环氧木脂素类化合物或组合物。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明的应用是制备用于预防流感病毒、副流感病毒、原始COVID-19病毒及其变异株所致疾病的药物中的应用。优选地，双环氧木脂素类化合物或组合物是所述药物中的唯一药物活性成分。

在本发明的另一个具体的实施方式中，本发明提供了双环氧木脂素类化合物或组合物对COVID-19病毒及其诸多变异株所致的肺出血的治疗应用。即，在发生或知晓原始COVID-19病毒或其变异株感染之后，再给予双环氧木脂素类化合物或组合物。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明的应用是制备用于治疗原始COVID-19病毒及其变异株所致肺出血的药物中的应用。优选地，双环氧木脂素类化合物或组合物是所述药物中的唯一药物活性成分。

在本发明的另一个具体的实施方式中，本发明提供了双环氧木质素类化合物和组合物抗炎作用，即在由流感病毒、COVID-19Delta变异株病毒所致肺炎中的应用。

在本发明的一个具体的实施方式中，本发明的应用是对由流感病毒、COVID-19Delta变异株病毒所致肺炎的抑制作用。优选地，双环氧木脂素类化合物或组合物是所述药物中的唯一药物活性成分。

相应地，对于本发明的第二方面，本发明还提供了双环氧木脂素类化合物和组合物的第二药用及使用的治疗方法。例如，本发明提供了双环氧木脂素类化合物和组合物，其用于抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株。本发明也提供了双环氧木脂素类化合物和组合物，其用于预防或治疗抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株所致疾病。又如，本发明提供了用于抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株的方法，其包括向有需要的个体(如实验动物，优选是人)给药有效量的双环氧木脂素类化合物或组合物。相应地，本发明也提供了用于预防或治疗抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株所致疾病的方法，其包括向有需要的个体(如实验动物，优选是人)给予有效量的双环氧木脂素类化合物或组合物。

在本文中，给药的剂量(有效量)和形式一般由医师根据患者的具体情况(如年龄、体重、性别、患病时间、身体状况和感染的严重程度等)确定。由于患者具体情况会发生变化，因此给药的剂量也会发生变化，选取合适的量是在临床医师的能力范围内的。给药形式根据药物组合物的剂型来确定，适合的给药形式有口服、非肠道注射、粘膜、肌肉、静脉内、皮下、眼内、皮内或经过皮肤等给药形式，优选口服的给药形式。

本发明的有益效果在于，提供了抗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其诸多变异株的方法，为更好防治日益复杂化的流行性病毒疫情做出贡献；双环氧木脂素类化合物和组合物可以有效预防和治疗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒及其变异株病毒所致的疾病，有效治疗COVID-19病毒所致的肺出血，并有效抑制炎症的发展，为未感染和已感染的人群提供了新的预防和治疗手段。

为了便于理解，以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

具体实施方式

以下通过实施例进一步示例性地说明本发明。如未特别指明，实施例中所用的方法均记载于本领域的技术文献和药品监管机构的规范文件中，仪器、原料和试剂均为公开市场所购买的。

实施例1连翘新苷合成制备方法

1、香草醛(15.2g,100mmol)溶于100ml乙腈中，加入碳酸钾(6.9g,50mmol)、碘化钾(0.66g,4mmol)和氯苄(14g,110mmol)，回流反应5小时，饱和氯化铵淬灭，减压除去乙腈，二氯甲烷萃取，旋干过柱，即可得到式2化合物,收率：92％；

2、式2化合物(21.8g,92mmol)溶于200ml热水中，加入高锰酸钾(24.1g,150mmol)，70-80℃反应1小时，碱化到pH＝10，酸化滤液，抽滤，即可得到式3化合物,收率：90％；

3、式3化合物(20.6g,81mmol)，加入50ml二氯亚砜，95℃反应8小时，蒸去二氯亚砜，加入50ml无水四氢呋喃，此溶液滴加入等量100ml乙酰乙酸乙酯钠盐的四氢呋喃溶液中，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵(8g)和100ml含有1％氨水的95％乙醇溶液，回流4小时，减压除去乙醇，二氯甲烷萃取，旋干过柱，即可得到式4化合物,收率：75％；

4、3-羟基-5-甲氧基苯甲醛(15.2g,100mmol)溶于30ml N,N-二甲基甲酰胺中，加入咪唑(13.6g,200mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(16.6g,110mmol)，35℃反应10小时，然后加入饱和氯化铵淬灭，二氯甲烷萃取，旋干过柱，即可得到式7化合物,收率：94％；

5、式7化合物(24.1g,92mol)溶于热水中，加入高锰酸钾(24.1g,150mmol)，70-80℃反应1小时，碱化到pH＝10，酸化滤液，抽滤，即可得到式8化合物,收率：93％；

6、式8化合物(22.6g,83mmol)，加入50ml二氯亚砜，95℃反应8小时，蒸去二氯亚砜，加入50ml无水四氢呋喃，此溶液滴加入等量100ml乙酰乙酸乙酯钠盐的四氢呋喃溶液中，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵(8g)和1％氨水的100ml 95％乙醇溶液，回流4小时，减压除去乙醇，二氯甲烷萃取，旋干过柱，即可得到式9化合物,收率：72％；

7、式4化合物(17.1g,52mmol)加入溶有金属钠(1.2g,52mmol)的150ml无水乙醇溶液，室温搅拌反应3小时，减压蒸除乙醇，即可得到式5化合物；式9化合物(17.6g,50mmol)加入溶于无水四氢呋喃溶液，加入溴水(11.5g,72mmol)，室温搅拌反应3小时，减压蒸除四氢呋喃，即可得到式10化合物；将上述式5化合物、式10化合物溶于100ml二氯甲烷溶液，室温搅拌反应3小时，旋干过柱，即可得到式11化合物,收率：65％；

8、式11化合物(20.3g,31mmol)溶于100ml无水四氢呋喃中，加入含有15g四氢铝锂的无水四氢呋喃溶液，回流反应6小时，室温搅拌过夜，加入100ml乙酸乙酯分解过量的四氢铝锂，用浓盐酸调至中性，旋干过柱，即可得到式12化合物,收率：82％；

9、式12化合物(11.3g,21mmol)溶于20mL重蒸苯中，加入对甲苯磺酸吡啶盐粉末，回流反应3小时，然后冷却至室温，直接旋干过柱，即可得到式13化合物,收率：32％；

10、在氢气条件下式13化合物(3.0g,6mmol)溶于20mL甲醇中，加入2g 10％钯碳，室温搅拌反应3小时，过滤，旋干过柱，即可得到式14化合物,收率：90％；

11、在氮气保护下，式14化合物(2.1g,5mmol)溶于无水二氯甲烷中，加入2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯(3.7g，7.5mmol)、三氟甲磺酸三甲基硅酯(0.3ml,15mmol)和

型硅铝酸盐分子筛(4.2g)，在0℃下搅拌反应10小时，加入三乙胺(1.5mmol)淬灭反应，过滤，旋干过柱，即可得到式15化合物,收率：72％；

12、式15化合物(2.2g,3mmol)溶二氯甲烷与甲醇的混合溶液中(体积比为1：2)，加入甲醇钠、在25℃下搅拌反应4小时，醋酸调pH＝7，旋干过柱，即可得到式16化合物,收率：90％；

13、式16化合物(1.1g,2mmol)溶于溶于无水四氢呋喃中，加四丁基氟化铵，在35℃下搅拌反应3小时，饱和氯化铵淬灭，二氯甲烷萃取，旋干过柱，即可得到式17化合物,收率：90％。高效液相检测其纯度为99.95％。

14、本发明化合物高分辨质谱图中m/z 543.18309峰为样品的[M+Na]+峰，故化合物的分子量为520，核磁数据如下：

化学结构¹³CNMR谱全归属：

/>

¹HNMR数据：¹HNMR(600MHz,d6-DMSO)δ：8.85(br,1H,-OH)，7.04(d,1H,J＝8.49Hz,-CH＝)，6.96(d,1H,J＝1.94Hz,-CH＝)，6.89(s,1H,-CH＝)，6.86(dd,1H,J＝8.49Hz,1.94Hz,-CH＝)，6.74(d,2H.J＝0.77Hz,-CH＝)，5.19(d,1H,J＝4.92Hz,-OH)，5.05(d,1H,J＝4.47Hz,-OH)，4.99(d,1H,J＝5.36Hz,-OH)，4.88(d,1H,J＝7.45Hz,>OH-),4.76(d,1H,J＝5.81Hz,>OH-)，4.51(t,1H,J＝5.51Hz,-OH)，4.37(d,1H,J＝6.85Hz,>OH-)，4.08(d,1H,J＝9.39Hz,-CH2-)，3.77(s,3H,-OCH3)，3.76(s,3H,-OCH3)，3.74(m,2H,-CH2-)，3.67(m,1H,-CH2-)，3.45(m,1H,-CH2-)，3.35(m,1H,>OH-)，3.27(m,3H,>OH-)，3.16(m,1H,>OH-)，3.11(t,1H,J＝8.49Hz,-CH2-)，2.82(m,1H,>OH-)。

由此可确定本实验合成的化合物为图示结构：

实施例2本发明的药物抗新冠病毒及其变异株的体外药效实验研究

1体外抗病毒试验

1.1试验材料

(1)药物

双环氧木脂素类化合物：连翘新苷(纯度为99.95％)、连翘苷(含量为99.96％)、连翘脂素(纯度为99.96％)、连翘脂素硫酸酯(纯度为99.95％)、连翘脂素葡萄糖醛酸酯(纯度为99.95％)、连翘脂素布洛芬酯(纯度为99.95％)。

双环氧木脂素类组合物：连翘新苷/连翘苷、连翘新苷/连翘脂素、连翘新苷/连翘脂素硫酸酯、连翘新苷/连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘新苷/连翘脂素布洛芬酯、连翘苷/连翘脂素硫酸酯、连翘苷/连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘苷/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素/连翘脂素硫酸酯、连翘脂素/连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素硫酸酯/连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素硫酸酯/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯/连翘脂素布洛芬酯、连翘苷/连翘新苷/连翘脂素硫酸酯、连翘新苷/连翘苷/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素/连翘新苷/连翘脂素葡萄糖醛酸酯。

以上试验药物，均为大连富生天然药物开发有限公司提供。

阳性药物：①瑞德西韦，由中国科学院广州生物医药与健康研究院(张健存教授团队合成)提供，规格：1g。配制方法：体外试验时以DMSO配制成母液，分装，4℃保存备用，使用前以细胞工作液进行稀释溶解到所需浓度。体内试验时以0.5％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度。②磷酸奥司他韦，中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-201901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。

(2)细胞株：Vero E6细胞(非洲绿猴肾细胞)，广州呼吸研究院呼吸疾病国家重点实验室。

(3)病毒株：新冠病毒株、COVID-19病毒Beta变异株、COVID-19病毒Delta变异株：广州海关技术中心P3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)。

1.2实验方法

试验在BSL-3实验室进行。设细胞对照、空白对照(溶剂对照)、病毒对照(阴性对照)、不同浓度受试药物组。将细胞密度为2×10⁵cells/mL的VeroE6细胞悬液分别铺于无菌96孔培养板中，每孔加入100μL，在37℃、5％CO2环境下培养24h；弃培养上清液，实验组和病毒对照组加入100TCID50病毒液，100μL/孔，常规培养吸附2h；弃去培养上清液，每孔加入100μL的不同浓度的药物(250、125、62.5、31.25、15.62μg/mL)，100μL/孔，每个浓度3个复孔，常规培养孵育3-4天。光学显微镜下观察细胞病变(CPE)，细胞出现病变程度按以下6级标准记录：“-”为细胞无病变；“±”为细胞病变少于10％；“+”为细胞病变约25％；“++”为细胞病变约50％；“+++”为细胞病变约75％：“++++”为细胞病变超过75％。计算半数抑制浓度(IC50)及选择指数(SI)。

1.3实验结果

表2-1结果显示，所试药物对新冠病毒及其变异株均具有明显的抑制作用。

/>

实施例3本发明的药物体外抗流感病毒、副流感病毒的药效实验结果

1.体外抗病毒实验

1.1试验材料

(1)药物

以上试验药物，均为大连富生天然药物开发有限公司提供。

磷酸奥司他韦：中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-201901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。

上述药品均用纯净水溶解，滤过，除菌分装，4℃备用，为本次试验待测药物。

(2)细胞株：Vero(非洲绿猴肾细胞细胞)：吉林大学基础医学院。

(3)病毒株：①流感病毒株、副流感病毒株：中国预防医学科学院病毒研究所。

(4)主要设备与试剂：

生物安全柜：BHC-1300ⅡA/B3，AIRTECH；CO2培养箱：MCO-18AIC，SANYO；倒置显微镜：CKX41，OLYMPUS；电子分析天平：AR1140/C，DHAUS；培养基：DMEM，HyClone；胎牛血清：HyClone；胰蛋白酶：Gibco；MTT：Sigma；DMSO：天津市北联精细化学品开发有限公司。

1.2试验方法

(1)细胞准备

Vero细胞传代培养1-2d，使之成片，界线清晰，立体感及折光度强时，用胰酶消化，待细胞面出现针尖样小孔，吸尽消化液，取数毫升培养液吹散细胞，计数，用培养液(含10％胎牛血清的DMEM)稀释至约5×107个/L后，接种于96孔培养板内，待细胞长成单层。

(2)药物毒性测定

细胞毒性试验：将药物按表3-1所示浓度进行稀释，用于细胞毒性测定。

表3-1药物稀释参照表(单位：g/L)

注：试验药物为双环氧木脂素类化合物及双环氧木脂素类组合物

将上述用维持液(含2％胎牛血清的DMEM)稀释好的不同浓度的药品滴加于Vero单层细胞上，每孔0.2ml，每个浓度6个复孔，另设6孔正常对照(不加药物的正常对照组)和6孔空白对照(培养液)，置37℃，5％CO2培养箱中培养，每日置倒置显微镜观察CPE并记录。72h后，每孔加入MTT溶液20μL(5mg·mL－1)，继续孵育4h，吸弃各孔培养液，每孔加入100μLDMSO，振荡5min，492nm测定OD值，计算细胞存活率。在SPSS 18.0统计软件中，将细胞存活率进行Probit回归分析，计算药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC0)和半数毒性浓度(TC50)。

(3)流感病毒TCID50的测定

将病毒进行10倍递减稀释为10-1,10-2,10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释度，按序接种于单层的Vero细胞96孔培养板上，每孔100μL，每个稀释度6孔，同时设正常细胞对照组。置37℃，5％CO2中孵育2h，弃病毒液，随即每孔加细胞维持液100μL，置37℃，5％CO2中培养。第3天开始在显微镜下观察细胞病变结果，第7-8天判定结果并做好记录，以能使50％细胞孔发生阳性病变的最高稀释度作为终点，用karber法计算病毒滴度。

公式

(TCID₅₀：50％组织细胞感染量；XM：病毒最高浓度稀释度的对数；d：稀释度系数(倍数)的对数；Σpi：每个稀释度病变百分数的总和。)

(4)药物对病毒致细胞病变作用的影响

取已长满单层细胞的培养板，吸弃培养液，以100TCID50对应的病毒攻击量接种细胞，37℃，5％CO2培养箱吸附2h，加入特定浓度(最大无毒浓度左右)的各药液，每浓度6个复孔培养，200μL/孔。设磷酸奥司他韦为阳性药物对照组，同时设正常对照组(不加病毒不加药)和病毒对照组(加病毒但不加药物的对照组)，观察药物对病毒致CPE的影响。72h后，用MTT比色法，在492nm波长下测定OD值，计算药物抗病毒有效率(ER％)。在SPSS 18.0统计软件中用ANOVA法比较各药物抗病毒有效率之间的显著性差异。

ER％＝(药物处理组平均OD值－病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值－病毒对照组平均OD值)×100％

1.3试验结果

(1)TCID₅₀

流感病毒：

副流感病毒：

(2)药物毒性测定

1)药物对细胞毒性的测定

各药物对Vero细胞的最大无毒浓度(TC₀)、半数毒性浓度(TC₅₀)及药物抗病毒实验用浓度见表。

表3-2药物细胞毒性实验结果(单位：g/L)

2)药物对病毒致细胞病变保护作用结果

双环氧木质素类化合物和组合物对流感病毒和副流感病毒均有明显抑制作用，有效率均超过磷酸奥司他韦。具体数据详见表。

表3-3药物抗流感和副病毒疗效结果(有效率，ER％)

2.体内抗病毒试验

2.1实验材料

(1)实验动物

昆明种小鼠，由吉林大学白求恩医学部实验动物中心提供。

(2)检测仪器、试剂

2.2实验方法

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定

将流感病毒和副流感病毒(细胞裂解液)10倍递比稀释为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的病毒液。取昆明种小鼠120只，流感病毒和副流感病毒组各60只，分别随机分成6组，乙醚轻度麻醉小鼠，滴鼻感染不同稀释度病毒液0.03mL/只。同时设空白对照，用生理盐水代替病毒悬液。以死亡和生存为观察指标，每天观察，直至感染后的14天。感染24h内死亡的为非特异死亡，不予统计，Karber法计算病毒液LD50。计算公式：

[其中：LD₅₀：半数致死量；XM：病毒最高浓度稀释度的对数；d：稀释度系数(倍数)的对数；Σpi：每个稀释度病变百分数的总和]。

(2)连翘苷/连翘脂素组合物抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的研究

1)试验动物及分组

取四周龄的昆明小鼠，随机分组，每组10只，用于双环氧木脂素类化合物和组合物对流感和副流感病毒感染小鼠肺指数和肺指数抑制率的测定试验

另取随机分组小鼠，每组10只，用于双环氧木脂素类化合物和组合物对肺悬液病毒血凝滴度的测定试验。

2)感染方法

在200～300mL大小的烧杯内放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显呈无力样时，将小鼠仰卧，滴鼻感染15LD₅₀流感病毒和副流感病毒0.03ml/鼻孔，正常对照组用生理盐水代替病毒悬液。

3)给药方法及给药剂量

双环氧木脂素类化合物和组合物药物组和磷酸奥司他韦对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，双环氧木脂素类化合物和组合物药物组分为高、低剂量组，给药剂量分别为13.0、3.25mg/kg，磷酸奥司他韦给药剂量为19.5mg/kg，每天一次，连续给药5d，正常对照组、病毒对照组灌服相同体积的生理盐水。

4)观察指标

①肺指数测定

小鼠用药后第5天，先禁食水8小时，称体重后摘眼球放血处死动物，打开胸腔摘出全肺，以生理盐水洗涤两次，用滤纸吸干表面水份，电子天平称肺重，按下列公式计算计算肺指数和肺指数抑制率：

肺指数＝(小鼠肺重/小鼠体重)×100％

肺指数抑制率＝(感染模型组平均肺指数-实验组平均肺指数)/感染模型组平均肺指数×100％

②肺悬液病毒血凝滴度测定

分别取治疗后第5天的各组小鼠肺，低温下置匀浆器研磨成匀浆，生理盐水稀释为10％的肺组织悬液，离心取上清，倍比稀释，按0.2ml/孔滴于滴定板上,每孔加入0.2ml 1％鸡红细胞悬液,混匀,置室温30min,观察记录血凝滴度。以红细胞凝集(++)时为終点，以悬液稀释倍数表示其滴度。

2.3试验结果及分析

(1)流感病毒和副流感病毒对小鼠半数致死量的测定结果

试验组昆明种小鼠分别被滴鼻感染不同浓度流感病毒、副流感病毒液30μL，感染第3天前3组(病毒浓度为10^-1组、10^-2组、10^-3组)小鼠均出现不同程度的发病症状：耸毛、发抖、饮食减少等；第5天小鼠出现走路摇摆不定；第6天最高病毒浓度组小鼠开始出现死亡，其余各组于感染后第7天陆续出现死亡现象。观察14天结束后，统计各组小鼠死亡数目，结果见下表。计算该流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.9，副流感病毒的LD₅₀为稀释度10^-2.5。

表3-4流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD₅₀。流感病毒的LogLD₅₀如下：

表3-5副流感病毒半数致死量试验结果统计

Karber法计算病毒的LD₅₀。副流感病毒的LogLD₅₀如下：

(2)连翘苷/连翘脂素组合物抗流感病毒和副流感病毒感染所致肺炎的作用结果

①肺指数测定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，平均肺指数结果显示：与感染模型组比较，正常对照组、双环氧木脂素类化合物和组合物药物组及磷酸奥司他韦组的肺指数明显降低(P<0.05或P<0.01)。其中，高剂量药物组的肺指数低于磷酸奥司他韦、肺指数抑制率高于磷酸奥司他韦，疗效优于磷酸奥司他韦(P<0.01或P<0.05)，结果见表。

表3-6双环氧木脂素类化合物和组合物药物组对流感病毒感染小鼠肺指数的抑制率

各试验组与病毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表3-7连翘苷/连翘脂素组合物对副流感病毒感染小鼠肺指数的抑制率

各试验组病毒对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

②肺悬液病毒血凝滴度测定

流感病毒和副流感病毒感染小鼠后，感染模型组肺组织病毒血凝滴度(InX)分别为35.47和34.62，双环氧木脂素类化合物和组合物药物组用药治疗5天后，肺组织病毒血凝滴度均有所下降，抑制率显著。与感染模型组比较，药物组的高低剂量组的血凝滴度，皆低于磷酸奥司他韦组，抑制率明显高于磷酸奥司他韦。上述试验结果详见表。

表3-8双环氧木脂素类化合物和组合物对流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响

/>

*P<0.05，**P<0.01。

表3-9连翘苷/连翘脂素组合物对副流感病毒感染小鼠肺悬液血凝滴度的影响

/>

*P<0.05，**P<0.01。

实施例4本发明药物治疗COVI D-19De l ta病毒的体内药效研究

1.1小鼠：hACE2小鼠，6-7周龄，20-40g，实验动物供应商：江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2018-0008，饲料供应商：江苏美迪森生物医药有限公司。

1.2病毒：COVID-19Delta病毒(广州海关技术中心BSL-3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)。

1.3药物

双环氧木脂素类化合物：连翘新苷(纯度为99.95％)、连翘苷(含量为99.96％)、连翘脂素(纯度为99.96％)；双环氧木脂素类组合物：连翘新苷/连翘苷、连翘苷/连翘新苷、连翘脂素/连翘新苷、连翘苷/连翘新苷/连翘脂素硫酸酯、连翘新苷/连翘苷/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素/连翘新苷/连翘脂素葡萄糖醛酸酯。以上试验药物，均为大连富生天然药物开发有限公司提供。以上药物由大连富生天然药物开发有限公司提供。

瑞德西韦：规格1g。配制方法：体外试验时以DMSO配制成母液，分装，4℃保存备用，使用前以细胞工作液进行稀释溶解到所需浓度。体内试验时以0.5％羧甲基纤维素钠配制成所需浓度。

1.4实验方法

1.4.1将hACE2转基因C57BL/6小鼠分为正常组、COVID-19Delta病毒感染组、药物组(低剂量组40mg/kg，高剂量组80mg/kg)，阳性对照组(瑞德西韦50mg/kg)，每组8只。除正常组滴鼻给予PBS之外，其它各组小鼠滴鼻感染10⁵PFU的COVID-19Delta病毒。感染后2小时，各药物组小鼠灌胃给予药物，连续5日，1次/日。濒死或者死亡动物安乐死后解剖取肺，存活动物在感染后第5日解剖取肺。

1.4.2感染组每组取4例动物剖取肺部组织做病理学研究；取4例动物剖取肺部组织，采用Trizol法对肺组织匀浆上清进行提取总RNA，RT-qPCR检测炎症因子白介素1β(IL-1β)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)。

1.4.3肺部组织病理学研究具体操作步骤如下：

①固定包埋：固定(用4％的多聚甲醛固定)→洗涤修块，将组织修出平整的切面→用50％、70％、80％、95％、100％各级乙醇溶液进行脱水→分别浸入二甲苯I、II进行透明→分别浸入60℃蜡I、II透蜡→石蜡包埋

②切片染色：切片(厚度约为4um)→石蜡切片分别浸入透明剂I、透明剂II、透明剂Ⅲ脱蜡→100％、90％、80％、70％等各级酒精溶液中浸泡各5min→水洗→苏木素染色3min→水洗→0.5％盐酸乙醇分化数秒→自来水洗15min反蓝→伊红染色2min→分别浸入95％乙醇I、95％乙醇II、100％乙醇I、100％乙醇II、透明剂I、透明剂II、透明剂Ⅲ中进行脱水透明→中性树胶封存→显微镜观察拍照。

1.4.4RT-qPCR检测小鼠肺组织炎症因子具体操作步骤如下：

①RNA的提取

取小鼠肺组织100mg置于1.5mL EP管中，向EP管中加入1mL Trizol Reagent，插入冰中，迅速剪碎研磨器，室温放置5min。加入氯仿200μL，盖紧，剧烈振荡1min，室温静置5min。4℃，10000rpm/min离心10min，混悬液分为三层，上层为水相澄清液体，小心吸出上层水相，移至另一新的1.5mL EP管中，约500μL，加入等体积的异丙醇，震荡混匀后，室温静置10min。4℃，10000rpm/min，离心10min。离心后EP管底侧壁上可见一乳白色半透明的胶状沉淀，即为总RNA。倾去上清液，在沉淀中加入500μL的75％乙醇，反复颠倒洗净，4℃，10000rpm/min，离心10min。倾去上清，再加入500μL的75％乙醇，反复颠倒清洗，4℃，10000rpm/min，离心5min。烘干乙醇后，室温静置5min，加入无RNA酶的ddH₂O溶解RNA，并进行逆转录成cDNA。

②逆转录反应

将RNA逆转录之前先进行去基因组DNA反应，反应体系如下表：

表4-1反应体系表

反应条件：42℃，2min；去基因组DNA的RNA置于4℃保存。mRNA逆转录成cDNA；配置逆转录反应体系如下表：

表4-2配置反应体系表

逆转录反应条件如下：37℃，15min；85℃，5s；4℃。

③实时荧光定量PCR检测

反应体系及反应条件如下表：

表4-3时荧光定量PCR检测反应体系

表4-4 PCR反应条件

④引物的设计和合成

利用引物设计软件Primer Premier 5.0进行引物设计，引物序列如下：

表4-5 RT-qPCR引物序列表

⑤数据统计处理方法

用SPSS23.0软件进行统计分析，以均数±标准差

表示。

1.5试验结果

(1)小鼠肺部病理学结果显示，与正常组比，感染模型组动物肺组织出现肺出血，间质肺炎等病理变化。感染动物各组具体病变类型和程度如下：

表4-6 COVID-19Delta病毒感染小鼠的肺部病理形态观察结果

以上病变各组间比较，药物40mg/kg和80mg/kg对COVID-19Delta病毒引起的肺部病变和肺出血具有明显改善作用，药物在肺出血和间质性肺炎方面的病理改善也明显优于瑞德西韦。

(2)肺部炎症因子mRNA表达结果显示，COVID-19Delta病毒感染小鼠第5天，与正常组相比，病毒模型组IL-1β、MCP-1表达显著升高；与病毒模型组相比，药物组的高低剂量组(40mg/kg和80mg/kg)的IL-1β、MCP-1炎症因子显著降低；且80mg/kg给药组抑制炎症介质过度表达的能力优于瑞德西韦。

表4-7 COVID-19Delta病毒感染小鼠肺匀浆中IL-1β、MCP-1的表达量

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实施例5本发明药物治疗流感病毒的体内药效研究

1.1小鼠：ICR小鼠，20-30g，实验动物供应商：湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(湘)2019-0004，饲料供应商：江苏美迪森生物医药有限公司。

1.2病毒：流感病毒：广州海关技术中心BSL-3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)。

1.3药物

双环氧木脂素类化合物：连翘新苷(纯度为99.95％)、连翘苷(含量为99.96％)、连翘脂素(纯度为99.96％)；双环氧木脂素类组合物：连翘新苷/连翘苷、连翘苷/连翘新苷、连翘脂素/连翘新苷、连翘苷/连翘新苷/连翘脂素硫酸酯、连翘新苷/连翘苷/连翘脂素布洛芬酯、连翘脂素/连翘新苷/连翘脂素葡萄糖醛酸酯。以上试验药物，均为大连富生天然药物开发有限公司提供。

磷酸奥司他韦(磷酸奥司他韦)：中国药品生物制品检定所。产品批号：101096-201901，100mg/支作为本次试验阳性对照药物。

1.4实验方法

(1)病毒接种

流感病毒鼻腔接种：用200-300mL大小的烧杯，放入一团脱脂棉，然后倒入适量的乙醚(使脱脂棉变湿即可)，把装有脱脂棉的烧杯倒扣过来，把小鼠放入进行麻醉，见小鼠极度兴奋，明显成无力样时，即麻醉深度适中时马上取出，将乙醚麻醉后的小鼠仰卧，将鼠头仰起放置，滴鼻感染，每鼻孔稀释好的流感病毒0.03mL/每个鼻孔(15LD₅₀)，空白对照用生理盐水代替病毒悬液。

(2)给药方法

双环氧糖苷化合物和组合物药物组(高剂量26.0mg/kg，低剂量13.0mg/kg)、模型组、磷酸奥司他韦药物对照组，分别于感染前一天开始常规灌胃给药，每天一次，连续给药5d，阳性对照组和模型组灌服相同体积的0.5％羧甲基纤维素钠。

(3)IL-2和TNF-a检测

于流感病毒感染后第5天、即给药后第六天，禁食8小时后，称体重、眼丛后静脉取血、留取各小组小鼠血液，分离血清，冰箱保存备用。按检测试剂盒操作说明进行各项检测分析，根据标准品检测与绘制标准曲线，计算IL-2和TNF-a浓度。

(4)TNF-a与IL-2检测

结果显示，不同浓度药物对TNF-a与IL-2均发挥了干预作用。其中高剂量组的疗效，优于磷酸奥司他韦。

表5-1流感病毒感染小鼠TNF-a、IL-2的表达量

(5)肺病变组织学和病理学检查

取各试验组4只鼠肺、固定、包埋、切片染色、镜检等。小鼠肺部病理学结果显示，与正常组比，感染模型组动物肺组织出现肺出血，间质肺炎等病理变化。感染动物各组具体病变类型和程度如下：

表5-2流感病毒感染小鼠的肺部病理形态观察结果

病变各组间比较，各组存活动物病理学改变较死亡动物轻；药物低、高剂量组病变程度明显较病毒组轻，13.0mg/kg和26mg/kg药物对流感病毒引起的肺部病变具有较好的改善作用，效果优于磷酸奥司他韦。

实施例6本发明的药物预防流感病毒的药效研究

1.药物

以上试验药物，均为大连富生天然药物开发有限公司提供。

(3)病毒株：流感病毒、副流感病毒流感病毒FM₁株：中国预防医学科学院病毒研究所。

2.探讨药物的具体作用环节，给药方法及试验目的如下：

I组：先加药24h后加入病毒液，观察药物能否进入细胞或吸附细胞表面以阻止病毒的吸附和进入，起到对病毒的预防作用，相当于先给予药物再感染流感病毒，观察其预防流感的疗效。

II组：先加病毒液，吸附1h后加药，观察药物能否对进入细胞内的病毒起作用，抑制其生物合成及成熟释放，起到治疗作用，相当于已经感染流感病毒后再给药，观察其治疗效果。

III组：药液与病毒液同时加入，观察药物与病毒在不同的条件下作用，对病毒是否有直接灭活作用，相当于感染流感后即时给药，观察其治疗效果。

IV组：药液与病毒混合吸附2h后加入细胞，是观察药物与病毒在不同的条件下作用，对病毒是否有直接灭活作用，相当于感染流感后一段时间再给药，观察其治疗效果。

3.实验结果

I组：试验结果表明双环氧木脂素化合物和组合物能进入细胞或吸附细胞表面，阻止流感病毒和副流感病毒的吸附和进入，阻止作用达75％以上。

II组：试验结果表明双环氧木脂素化合物和组合物能对进入细胞内的病毒起作用，对流感病毒和副流感病毒具有抑制其合成与释放的作用，抑制率达到75％以上。

III、IV组：试验结果表明双环氧木脂素化合物和组合物对流感病毒和副流感病毒的直接灭活作用。双环氧木脂素化合物和组合物药液与病毒液同时加入，对流感、副流感病毒的灭活率均达到100％左右；双环氧木脂素化合物和组合物药液与病毒混合吸附2h后加入细胞，对副流感病毒的灭活率亦均达到100％左右。因此，不论病毒与双环氧木脂素化合物和组合物作用的时间长短，只要双环氧木脂素化合物和组合物与上述病毒有直接接触的机会，均有明显的灭活作用，其效果明显好于其他作用途径。详见表。

表6-1连翘苷对病毒感染组织细胞的保护率比较(ER％)

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实施例7本发明的药物预防COVID-19Delta病毒的药效研究

1.1小鼠hACE2小鼠，6-7周龄，20-40g，雄性，实验动物供应商：江苏集萃药康生物科技有限公司，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2018-0008，饲料供应商：江苏美迪森生物医药有限公司。

1.2COVID-19Delta病毒(广州海关技术中心P3实验室(呼吸疾病国家重点实验室高致病病原微生物研究室)

1.3药物

1.4实验方法

将hACE2转基因C57BL/6小鼠，8只为一组，分为正常组(NC)、病毒感染组(Virus)、药物组(COVID-19Delta病毒低剂量组40mg/kg，高剂量组80mg/kg；阳性对照组(瑞德西韦50mg/kg)。滴鼻感染前提前5天灌胃给药，1次/日。连续灌胃5天后进行滴鼻感染，除正常组滴鼻给予PBS之外，各新冠病毒感染组的小鼠滴鼻感染10⁵PFU的COVID-19Delta病毒。

感染后每日记录体重变化，记录感染5天内动物死亡情况，计算5日平均生存天数和死亡率；在感染后第5日解剖取肺，取一半肺组织进行匀浆检测病毒滴度。

其中，小鼠肺匀浆病毒滴度检测包括：摘取小鼠的肺组织后，置于培养皿内，剪碎，移入匀浆管中，生理盐水1:10(w/v)稀释，8000rpm/min，匀浆10min。以上操作均在冰浴中进行。将匀浆液转入1.5mL EP管中，4℃，10000rpm离心10min。吸取上清，分装，-80℃保存备用。

将生长状态良好的VERO E6细胞接种在96孔板中，1×10⁴个细胞/孔，继续培养24h，细胞贴壁长成完整单层后，弃去上清液，PBS洗涤细胞2次。将冻存的肺匀浆上清融化后按10倍倍比稀释为10^-1-10^-5五个浓度，在96孔板中分别加入每组小鼠的稀释好的肺匀浆上清液，每孔加入100μL的肺上清液，同时设置空白对照孔，空白对照孔中加入细胞培养基，每个浓度平行做8个复孔，置培养箱中培养。连续观察4d，每天观察细胞病变(CPE)，记录每个梯度浓度的病变孔数，并计算其对VERO E6细胞的TCID50值。

1.5实验结果

(1)本发明的药物预防给药对新冠病毒死亡的保护研究结果

数据结果见表14。病毒组100％小鼠死亡，瑞德西韦给药组的小鼠死亡保护率为75％，本发明的药物对感染新冠病毒小鼠保护作用最高可达87.50％；预防给药本发明的药物组死亡保护率优于瑞德西韦组。

本发明的药物预防给药对COVID-19Delta病毒感染小鼠肺病毒的病毒滴度。

病毒滴度检测结果见表。结果显示，本发明的药物给药组小鼠的肺病毒滴度显著降低。

表7-1预防给药对Delta感染小鼠死亡保护作用的实验结果(

n＝8)

表7-2预防给药对新冠病毒Delta感染小鼠肺组织病毒滴度检测结果(

n＝8)/>

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Claims

1.双环氧木脂素类化合物、双环氧木脂素类或双环氧木脂素组合物在制备用于预防或治疗流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒或COVID-19病毒变异株、用于预防或治疗COVID-19病毒或COVID-19病毒变异株所致肺出血，或用于抗由流感病毒、副流感病毒、COVID-19病毒与COVID-19病毒变异株引起的肺炎的保健食品或药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其中，双环氧木脂素类化合物是指双环氧木脂素单体化合物，如连翘苷、连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯、连翘脂素布洛芬酯，或，双环氧木脂素类组合物是连翘苷分别与连翘新苷、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯以及连翘脂素布洛芬酯中的一种或多种成分组成的组合物，或，双环氧木脂素类组合物是连翘新苷、连翘脂素、连翘脂素硫酸酯、连翘脂素葡萄糖醛酸酯以及连翘脂素布洛芬酯中的任意两种或多种成分组成的组合物。

3.权利要求2所述的应用，其中双环氧木脂素类化合物的单体成分含量为95-99.9％，组合物中各成分所占比例为0.1～99.9％。

4.权利要求1所述的应用，其中，COVID-19病毒变异株是COVID-19病毒变异株Beta或COVID-19病毒变异株Delta。

5.权利要求1所述的应用，其是双环氧木脂素类化合物或双环氧木脂素组合物作为唯一活性成分的应用。

6.权利要求1所述的应用，其中，所述药物以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、注射剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂等形式存在，或，所述保健食品以片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、喷雾剂、气雾剂、凝胶剂、霜剂、巴布剂、橡胶贴膏剂或贴膏剂、糖果蜜饯、茶、饮料、焙烤食品、酒制品等食品形式存在。

7.连翘新苷的合成方法，其包括如下步骤：

1)以香草醛(式1化合物)和3-羟基-5甲氧基苯甲醛(式6化合物)为原料，分别经酚羟基保护，氧化，Claisen缩合反应得到相应的β-酮酸酯(式4化合物)和(式9化合物)，然后分别将其转化为相应的钠盐(式5化合物)和溴化物(式10化合物)，然后将这两个片段通过偶联反应得到中间体(式11化合物)；

2)中间体(式11化合物)经过还原，关环，还原反应得到苷元(式14化合物)；

3)苷元(式14化合物)经过糖苷化，脱保护基，即可得到目标产物(式17化合物)；

其反应式如下：

其中，a.氯苄；b.高锰酸钾；c.氯化亚砜/乙酰乙酸乙酯/乙醇钠；d.乙醇钠；e.叔丁基二甲基氯硅烷；f.溴水；g.二氯甲烷；h.四氢铝锂；i.甲基磺酰氯/吡啶；j.钯碳/氢气；k.乙酰葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯；l.甲醇钠；m.四丁基氟化铵。

8.权利要求7所述的合成方法，其中，步骤1)中，

式2化合物的合成为：香草醛溶于乙腈中，加入碳酸钾、碘化钾和氯苄，回流反应5小时，即得到式2化合物；

式3化合物的合成为：式2化合物溶于热水中，加入高锰酸钾，70-80℃反应1小时，即得到式3化合物；

式4化合物的合成为：式3化合物溶于二氯亚砜，95℃反应8小时，蒸去二氯亚砜，加入无水四氢呋喃，加入乙酰乙酸乙酯的钠盐，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵和含有1％氨水的95％乙醇溶液，回流4小时，即得到式4化合物；

式7化合物的合成为：3-羟基-5甲氧基苯甲醛溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入咪唑和叔丁基二甲基氯硅烷，35℃反应10小时，即得到式7化合物；

式8化合物的合成为：式7化合物溶于热水中，加入高锰酸钾，70-80℃反应1小时，即得到式8化合物；

式9化合物的合成为：式8化合物加入二氯亚砜，95℃反应8小时，蒸去二氯亚砜，加入无水四氢呋喃，加入乙酰乙酸乙酯的钠盐，回流8小时，除去四氢呋喃，然后在残余物中直接加氯化铵和含有1％氨水的95％乙醇溶液，回流4小时，即得到式9化合物；和/或，

式11化合物的合成为：式4化合物加入溶有等量金属钠的无水乙醇溶液，室温搅拌反应3小时，即得到式5化合物；式9化合物溶于无水四氢呋喃溶液，加入溴水，室温搅拌反应3小时，即得到式10化合物；式5化合物、式10化合物溶于二氯甲烷溶液，室温搅拌反应10小时，即得到式11化合物。

9.权利要求7所述的合成方法，其中，步骤2)中，

式12化合物的合成为：式11化合物溶于无水四氢呋喃中，加入含有四氢铝锂的无水四氢呋喃溶液，回流反应6小时，室温搅拌过夜，即得到式12化合物；

式13化合物的合成为：式12化合物溶于重蒸苯中，加入对甲苯磺酸吡啶盐粉末，回流反应3小时，即得到式13化合物；和/或，

式14化合物的合成为：在氢气条件下，式13化合物溶于甲醇中，加入10％钯碳，室温搅拌反应10小时，即得到式14化合物。

10.权利要求7所述的合成方法，其中，步骤3)中，

式15化合物的合成为：在氮气保护下，式14化合物溶于无水二氯甲烷中，加入四乙酰葡萄糖基三氯乙酰亚胺酯、三氟甲磺酸三甲基硅酯和

型硅铝酸盐分子筛，在0℃下搅拌反应10小时，即得到式15化合物；

式16化合物的合成为：式15化合物溶二氯甲烷与甲醇的混合溶液中，加入甲醇钠、在25℃下搅拌反应4小时，即得到式16化合物；和/或，

式17化合物的合成为：式16化合物溶于溶于无水四氢呋喃中，加四丁基氟化铵，在35℃下搅拌反应3小时，即得到式17化合物。