CN102895218B

CN102895218B - 广藿香醇的用途

Info

Publication number: CN102895218B
Application number: CN201210421296.5A
Authority: CN
Inventors: 彭成; 魏晓露; 熊亮; 万峰
Original assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2012-10-29
Filing date: 2012-10-29
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2032-10-29
Also published as: CN102895218A

Abstract

本发明公开了广藿香醇在制备抗腺病毒的药物中的用途。广藿香醇能够有效抑制人3型腺病毒合成，具有一定的抗腺病毒作用，可用于治疗腺病毒感染性疾病，尤其是人3型腺病毒感染性疾病；同时，广藿香醇对宿主细胞毒性远低于阳性药物阿昔洛韦，毒副作用更低，为临床用药提供了一种安全有效的新选择。

Description

广藿香醇的用途

技术领域

本发明涉及广藿香醇的新用途。

背景技术

腺病毒AdV（Adneovirus），是无包膜双链DNA病毒，由一个二十面体的蛋白质外壳所包裹。腺病毒主要感染多种脊椎动物，当中包括人类。其中，人腺病毒（Human adenovirus,HAdv），属于哺乳动物腺病毒属。目前发现的HAdv有56个型别，分为7个种（A-G），其中，B种腺病毒与人类致病性密切相关，尤其是B种腺病毒中的人3型腺病毒（又名人源腺病毒3型，HAdv-3）具有更高的毒性并且与严重的临床症状相关（张其威，等，人3型腺病毒GZ13株的分离鉴定及六邻体蛋白的分子进化研究）。

目前发现，腺病毒是儿童呼吸道感染的常见病毒，可引起咽炎、结膜炎、肺炎、脑炎、角膜炎、肠炎等，还可致终年性、流行性感染，容易在幼儿园、学校和军营新兵中暴发流行。腺病毒感染，多见于小于3岁的婴幼儿，年龄越小越易感染。最常引起的感染性疾病是咽扁桃体炎，其次为肺炎、胃肠炎、支气管炎及中耳炎等，严重者可并发肺外脏器损害，包括肝炎、脑炎、结膜炎及凝血功能异常，预后较差。其中，腺病毒肺炎是婴幼儿肺炎的严重类型，曾于1958年、1963年在我国北方流行，病死率甚高。

20世纪90年代以来，研究人员发现不少新的抗病毒药物，目前在临床上应用的抗病毒药物已超过20余种，但其确切疗效仍有很大争议。因为病毒是寄生在宿主细胞内，要保证抗病毒的药物具有高度选择性，既要能进入细胞，选择性地有效干扰病毒的复制过程，又要避免伤害宿主细胞，这是抗病毒尤其呼吸道病毒西药中多存在选择性高和毒副作用高的主要原因。如阿昔洛韦，对哺乳动物宿主细胞有一定毒性，大剂量注射可致动物睾丸萎缩和精子数减少。因此，抗病毒药物的研究具有重要的实际意义，寻找一种高效、安全、副作用少的抗病毒药物的研究势在必行。

广藿香醇，为广藿香挥发油的主要成分，是历版《中国药典》规定的评价广藿香药材及广藿香油质量标准的指标性成分。广藿香醇又称百秋李醇，是一种存在天然植物中的三环倍半萜化合物,其分子式为C₁₅H₂₆O,分子量为222.37，结构如下：

广藿香醇单体为无色晶体,有较淡的广藿香香气,其熔点为55～56℃,沸点280℃(常压下),相对密度为1.0284,旋光度-97.4°(c＝24,氯仿)；不溶于水,溶于醇、醚和常用有机溶剂。现代药理实验表明，广藿香醇具有抗炎、抑菌、抗雏虫、抗氧化、拮抗钙离子异常升高等药理活性，有一定的新药开发价值。

目前，还未见使用广藿香醇抗腺病毒以及治疗腺病毒感染性疾病的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供广藿香醇的医药新用途。

本发明提供了广藿香醇在制备抗腺病毒的药物中的用途。

其中，所述腺病毒为哺乳动物腺病毒。

进一步地，所述腺病毒为人腺病毒。

更进一步地，所述腺病毒为人腺病毒B亚群。

进一步优选地，所述腺病毒为人源腺病毒3型Human adenovirus 3。

其中，所述药物是治疗腺病毒感染性疾病的药物。

进一步地，所述药物是治疗腺病毒所致的呼吸道感染性疾病、眼部感染性疾病或胃肠道感染性疾病的药物。

进一步地，所述呼吸道感染疾病是鼻炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎或/和支气管炎。

其中，所述药物是由广藿香醇为活性成分，加入药学上常用的辅料制备而成的制剂。

进一步地，所述制剂为口服制剂、注射制剂或外用制剂。

广藿香醇能够有效抑制人3型腺病毒合成，具有一定的抗腺病毒作用，可用于治疗腺病毒感染性疾病，尤其是人3型腺病毒感染性疾病；同时，广藿香醇对宿主细胞毒性远低于阳性药物阿昔洛韦，毒副作用更低，为临床用药提供了一种安全有效的新选择。

具体实施方式

广藿香醇，可通过购买市售商品得到，也可通过现有分离纯化方法制备得到。本发明具体实施方式中所用广藿香醇，经鉴定后，纯度大于95%。

实施例1抗病毒制剂的制备

取广藿香醇，加入适量可溶性淀粉、糊精，制粒，即得本发明抗病毒颗粒剂。

实施例2广藿香醇抗腺病毒的作用

1、材料及仪器

1.1细胞株和病毒株

1.1.1细胞株：

Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞），购自中国药品与生物制品检定所。

1.1.2病毒株：

腺病毒选用常见的人3型腺病毒（HAdv-3），是由甘肃省疾控中心馈赠的临床分离株。

1.2药物及对照药物

试验药物：广藿香醇。

阳性药物：注射用阿昔洛韦：规格为0.25g/瓶，天津药业焦作有限公司生产。

批准文号：国药准字H20034034，生产批号：10122403。

1.3培养基、试剂及耗材

DMEM培养基（Gibco^TM公司，批号1345538）；胎牛血清（HyClone生物化学制品（北京）有限公司，批号NVM0347）；胰蛋白酶（Amresco公司）；青霉素G钠、链霉素无菌细胞培养瓶和96孔细胞培养板（美国Corning公司）。1、5、10ml一次性吸管，200μl、1ml一次性枪头（江苏海门生物耗材公司）

1.4主要仪器

隔水式恒温CO₂培养箱（型号MCO-15AC，日本三洋公司）；

酶标仪（型号Varioskan Flash，美国Thermo Scientific公司）；

OLYMPUS倒置显微镜（型号CKX41，日本奥林巴斯公司）；

微量移液器（法国GILSON公司生产）；

隔水式电热恒温培养箱（型号GSV-DA-1，湖北省黄石市医疗器械厂）；

水平离心机（型号LXJ-II，上海医用分析仪器厂）；

电子天平（型号JA-2603，上海天平仪器厂）

2、试验方法

2.1药物及阳性对照的前处理

将广藿香醇先与大豆油以2:1的体积比混合，然后加0.5%吐温-80助溶为白色液体制剂，其初始浓度为100mg/ml，过滤除菌后备用。

将用于腺病毒的阳性对照药物注射用阿昔洛韦用无菌水做1/10稀释（即10mg/ml）以备用。

2.2 50%组织细胞感染剂量的测定

腺病毒用3%胎牛血清DMEM，稀释成不同浓度的病毒液。

腺病毒接种Hep-2细胞，于37℃，5%CO₂孵箱中培养7d后观察感染细胞圆缩、脱落等细胞病变（cytopathiceffect,CPE）情况，以测定各病毒引起50%组织细胞病变的感染剂量（50%tissue culture infective dose,TCID₅₀）。

2.3细胞毒性测定

将配制好备用的广藿香醇预先100倍稀释，然后与阳性对照药阿昔洛韦用DMEM细胞培养液做连续对倍稀释，共7个稀释浓度，加入到Hep-2单层细胞中，不同稀释度各药物均重复3孔。37℃、5%CO₂培养5天，每天观察细胞病变情况（CPE）。以引起半数细胞发生病变的药物浓度判定为半数毒性浓度（TC₅₀），以完全不引起细胞发生病变的药物浓度判定为最大无毒浓度（TC₀）。实验设连续对倍稀释的0.5%吐温-80和正常细胞对照。

2.4抗病毒实验

根据病毒的复制周期，设计广藿香醇抗病毒作用的三种途径，每种病毒进行三组给药途径实验，每一组都设正常细胞对照组、病毒对照组和阳性药物对照组。具体操作如下：

2.4.1药物抗病毒生物合成实验（先上毒）

将100μl×TCID50的相应病毒液加入生长完好的对应单层细胞培养板中，37℃，5%CO₂孵育2h后，弃去病毒液，再加入不同浓度的广藿香醇液100μl和细胞维持液继续培养。

2.4.2药物抗病毒吸附实验（先上药）

将不同浓度的广藿香醇培养液100μl加入生长完好的单层细胞培养板中，37℃，5%CO₂孵育2h后，弃去含药培养液，再加入100μl×TCID50的相应病毒液，37℃，5%CO₂孵育2h后，弃去病毒液，再加入细胞维持液继续培养。

2.4.3药物直接作用实验（中和）

将不同浓度的100μl广藿香醇培养液和100μl×TCID50的相应病毒液混合，37℃，5%CO₂孵育2h后，再加入到生长完好的对应单层细胞培养板中，37℃，5%CO₂孵育2h后，弃去含药与病毒培养液，再加入细胞维持液继续培养。

各培养板于37℃、5%CO₂继续培养5d，每天显微镜下观察CPE。应用Reed-Muench法计算各药物的50%细胞病变抑制浓度（50%inhibiting concentration,IC50），以药物最高稀释度出现的IC50值作为抗病毒效果判断的终点。以上广藿香醇的每个浓度做3个复孔，每组实验重复3次。

3.实验结果及药效学指标计算

3.1各病毒的TCID₅₀值

腺病毒Ad-3接种Hep-2细胞后约5天出现CPE。腺病毒Ad-3的TCID₅₀效价均为10^-12。

3.2广藿香醇的细胞毒性

在受试时间内，正常对照孔的细胞形态正常。广藿香醇对三种细胞的毒性试验结果见表1。

表1广藿香醇和阿昔洛韦的细胞毒性测定结果

由细胞毒性实验结果显示，广藿香醇对三种细胞的毒性结果是一致的。其中：广藿香醇对细胞的TC₅₀浓度为1/800（0.125mg/ml），TC₀浓度为1/3200（0.031mg/ml）；阳性对照药物注射用阿昔洛韦对细胞的TC₅₀浓度为1/20（5.00mg/ml），TC₀浓度为1/80（1.25mg/ml）；0.5%吐温在做1/4稀释后（即0.125%）即对三种细胞均无毒性。

实验表明，广藿香醇对细胞毒性极低，远小于阳性药物阿昔洛韦的细胞毒性作用。

3.3广藿香醇抗病毒实验效果及药效学指标计算

3.3.2广藿香醇抗人3型腺病毒实验结果及药效学指标

在受验时间内正常对照孔细胞形态均正常，人3型腺病毒感染对照孔细胞在预计的时间内出现明显的CPE。广藿香醇三种给药途径实验结果见表2。

表2广藿香醇抗人3型腺病毒实验结果（n=3）

由表显示注射用阿昔洛韦有抗人3型腺病毒的作用，IC₅₀浓度为1/2560（0.039mg/ml）；广藿香醇对人3型腺病毒有一定的抑制作用，其中药物直接作用（中和）实验的效果相对最好，IC₅₀浓度为1/6400（15.63mg/ml）；广藿香醇抗病毒生物合成（先上毒）和抗病毒吸附（先上药）实验的效果相当，IC₅₀浓度均为1/3200（31.25mg/ml）。

综上所述，广藿香醇能够有效抑制人3型腺病毒合成，具有一定的抗腺病毒作用，可用于治疗腺病毒感染性疾病，尤其是人3型腺病毒感染性疾病；同时，广藿香醇对宿主细胞毒性远低于阳性药物阿昔洛韦，毒副作用更低，为临床用药提供了一种安全有效的新选择。

Claims

1.广藿香醇作为唯一活性成分在制备抗腺病毒的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述腺病毒为哺乳动物腺病毒。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述腺病毒为人腺病毒。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述腺病毒为人腺病毒B亚群。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述腺病毒为人源腺病毒3型Human adenovirus 3。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗腺病毒感染性疾病的药物。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述药物是治疗腺病毒所致的呼吸道感染性疾病、眼部感染性疾病或胃肠道感染性疾病的药物。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于：所述呼吸道感染疾病是鼻炎、咽炎、扁桃体炎、喉炎、气管炎或/和支气管炎。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述药物是由广藿香醇为活性成分，加入药学上常用的辅料制备而成的制剂。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述制剂为口服制剂、注射制剂或外用制剂。