CN103070870B - 甘珀酸在制备抗登革病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甘珀酸或其药学上可接受的衍生物或含有它们中任一种的药物组合物在制药领域中的新应用。经试验证明：甘珀酸能抑制登革病毒对易感细胞的感染。这提示甘珀酸在治疗登革热病毒感染性疾病领域存在潜在的应用价值。本发明为甘珀酸临床用于治疗登革热病毒感染性疾病提供实验证据，对研制抗登革热病毒药物提供了一定的指导意义，具有重要的参考价值。
Description
技术领域
本发明涉及药物用途发明领域，更具体地，涉及甘珀酸在制备抗登革病毒感染药物中的应用。
背景技术
甘珀酸(carbenoxolone)为甘草次酸的半琥珀酸酯二钠盐，甘草次酸是甘草酸及其盐（甘草甜素）水解后脱去2分子葡萄糖醛酸产生的化合物，是甘草最主要的化学成分，主要存在于甘草的根茎和根部中。甘珀酸的化学分子式为：C34H48O7Na2，分子量：614.7，甘珀酸为无色粉末，无味，溶于水形成微黄色液体。其分子结构如式（1）所示：
甘珀酸的通常医用用途有两种：1.作为缝隙连接阻断剂，用于减少细胞间的物质传导，主要用于心脏、胚胎、肿瘤等实验性研究。2. 甘珀酸可通过抑制11β-羟化类固醇脱氢酶(11β-HSD)提高内源性糖皮质激素的活性，从而增强糖皮质激素的作用，具有较强的抗炎活性，在临床上主要用于治疗慢性胃炎、慢性消化性溃疡 (别名:生胃酮)。
登革病毒(Dengue viruses)为B组虫媒病毒，归类于披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒属(Flaviviruses)。病毒有RNA基因组衣壳，呈哑铃形、杆状或球形，直径为40～50nm。可在乳鼠脑内和组织细胞中培养繁殖，以白纹伊蚊细胞纯株(C6/36)最为敏感。登革病毒有1~4四个血清型，各血清型间存在广泛的血清学交叉反应，异型二次感染可引起抗体依赖性感染增强（antibody-dependent enhancement，ADE）现象。登革病毒(Dengue virus，DENV)感染是当今人类中流行最广的虫媒病毒病。据WHO估计，全球有25~30亿人口面临感染登革病毒的危险，每年大约有5千万到1亿登革热(dengue fever，DF)病例发生，患者表现出高热、头痛、肌痛、关节痛及皮疹等症状，这其中有50万例发展成更为严重的登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克综合征 (Dengue shock syndrome，DSS)，其死亡率为5%~10%。目前，登革热主要流行于东南亚、美洲、地中海东部、非洲等一百多个国家和地区，但是，全球经济一体化程度加快、全球气候变暖等因素改写了登革热流行的世界地图，即登革热不再是热带和亚热带地区特有的地方性疾病，且登革病毒的流行范围仍在不断扩大。
登革病毒的流行严重危害到热带和亚热带人民的生命健康，给发展中国家带来了沉重的社会经济负担，由于病毒突变、抗体交叉反应和缺乏有效的动物模型等原因，目前还没研发出可应用于临床上的抗登革病毒药物和疫苗，故研发具有抗登革病毒感染的药物显得相当紧急。因此，我们应该高度重视对登革病毒的研究，加强对其的科研力度，做好相关知识和药物的储备，为我国在防控登革病毒感染的方面做出一定的贡献。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是公开了甘珀酸在医药中的新用途，即在制备抗登革病毒药物中的应用。
具体地，本发明公开了甘珀酸药学上可接受的衍生物在制备抗登革病毒药物中的应用，或其在制备防登革病毒感染药物中的应用。
更具体地，本发明公开了含甘珀酸或甘珀酸药学上可接受的衍生物中任一种的药物组合物在制备抗登革病毒感染药物中的应用。
进一步地，所述登革病毒为登革病毒1~4型。
更进一步地，所述登革病毒为登革病毒1型和2型。
进一步地，所述抗登革病毒感染是指抗登革病毒感染易感细胞或直接对登革病毒进行杀伤。
优选地，所述易感细胞为C6/36细胞、人肺癌上皮细胞（A549）、人单核细胞（THP-1）、人原代DC、人原代巨噬细胞（hMφ）、人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）。
所述甘珀酸的应用具体为：利用甘珀酸，利用其抗登革病毒活性，
以有效成分用甘珀酸或甘珀酸药学上可接受的衍生物或含有它们中任一种的药物组合物制备抗登革病毒药物以常规药用制剂的形式来使用：所述的常规药物用制剂含活性成分在制剂中与药学上可接受的载体如适合于肠胃内和肠胃外给药的有机或无机的固体或液体赋形剂混合，该药用制剂可以时固体形式如片剂、胶囊剂、散剂、丸剂或颗粒剂，也可以时液体形式如注射剂或乳剂等。
经实验证明，10~100 UM浓度的甘珀酸对1型和2型的登革病毒均有显著的抑制作用。可直接杀灭登革病毒，或降低/破坏登革病毒感染细胞的能力。
甘珀酸对A549细胞的毒性实验：
A549细胞是DENV的易感细胞。因此，首先检测甘珀酸对A549细胞的细胞毒性，以不同浓度的甘珀酸作用于A549细胞，来了解在细胞存活率为90%以上的甘珀酸的最大使用浓度，为后续的甘珀酸对DENV的抑制作用实验提供参考数据。结果表明，在0UM，10UM，25UM，50UM，100UM，200UM甘珀酸浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100%，99.27%，98.04%，93.10%，91.66%，78.48%。
甘珀酸对DENV的抑制实验：
以不同浓度的甘珀酸作用于己经感染了DENV的A549细胞，来获得甘珀酸对病毒的抑制效率。本实验中的甘珀酸的使用浓度均在使A549细胞在90%以上存活率的浓度的范围内，因此，可以排除甘珀酸的浓度过高而对实验数据的分析产生影响。结果表明，在0UM，10UM，25UM，50UM，100UM甘珀酸浓度下，甘珀酸对登革病毒的抑制率分别为0%，38.81%，94.49%，99.69%，99.99%。
除A549细胞外，本发明同样发现，在登革病毒其它易感细胞如THP-1、hDC、hMφ、HUVEC中，甘珀酸均有很显著的抑制效果，即在THP-1、HUVEC中，当甘珀酸使用浓度在25UM以上时，对DENV的抑制率可达90%以上，由于不同细胞对甘珀酸敏感性不同，在hDC及hMφ中，甘珀酸使用浓度需100UM以上时，对DENV的抑制率可达90%以上。由此可见，甘珀酸的抗登革病毒感染性是不存在细胞特异性的。另外，本发明还发现甘珀酸不仅具备抗DENV感染靶细胞的特性，还可直接对登革病毒进行杀伤，具体是指对DENV1、DENV2进行杀伤。试验结果表明，甘珀酸（100UM）与DENV1于37℃分别混合1h、6h、12h后，对登革病毒的抑制率分别为96.10%，99.99%，99.99%，且对DENV2的杀伤作用效果与DENV1类似，这说明甘珀酸对登革病毒的杀伤作用是不具备病毒亚型特异性的。
本发明首次发现，甘珀酸对DENV具有突出的抑制效果。尽管，甘珀酸与甘草甜素、甘草次酸在结构上存在一定的共同结构，而已知甘草甜素、甘草次酸均可以抑制多种病毒，但是甘珀酸还具备独特的C3一羟基端成酯结构，在我们的实验中发现，甘珀酸抑制DENV的效果相比于18α甘草次酸（18α-GA）要显著地多（抑制倍数），这表明甘珀酸的C3一羟基端成酯结构使甘珀酸相比于其它甘草酸类化合物，具备更显著的抗DENV能力。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1. 本发明通过对DENV的抑制实验证实了甘珀酸对DENV具有很好的抑制作用，从本质上证明了该药物在治疗DENV感染疾病中具有广泛的应用前景。同时，甘珀酸来源于甘草，资源十分丰富，获取方便。
2. 甘珀酸在临床上治疗慢性胃溃疡已经多年，因此，其临床使用很安全性。加强对黄病毒科黄病毒属病毒引起的疾病重视程度，增强对药物和疫苗的研发力度，十分重要，研制治疗登革病毒引起的疾病的药物，以便对病进行有效的预防和治疗，具有巨大的社会效益和研究价值。因此该发明能够为临床治疗由DENV引起的疾病提供很好的后选药物，具有十分良好的应用前景。
附图说明
图1.甘珀酸对A549细胞的毒性实验。
图2. 18α甘草次酸对A549细胞的毒性实验。
图3.甘珀酸对DENV2的抑制作用。
图4. 18α甘草次酸对DENV2的抑制作用。
图5.甘珀酸对DENV1的抑制作用。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。
本发明实施例中所使用到的研究材料均可以从市场上买到。实验中的A549细胞购买于美国标准生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）；MTT试剂盒购于Sigma公司；胎牛血清（Hyclone，USA），细胞培养板购买于上海圣纳堡生物科技有效公司；DMEM培养基和RPMI1640培养基购买于美国GIBCO公司。
实施例1
甘珀酸对A549细胞的毒性实验:
本发明所采用的甘珀酸购买于Sigma（C4790-1G）公司。
毒性实验
1．接种A549细胞：用含5%胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；
2．培养A549细胞：在37℃，5%CO2培养条件下，培养1天；
3．加入甘珀酸：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含5%胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(10UM，25UM，50UM，100UM，200UM)的甘珀酸，对照孔加不含药物的5%胎牛血清的DMEM培养基 100ul；
4．呈色：培养24小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5%CO2培养条件下继续孵育4小时， 然后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解；
5．测光吸收值：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果见表1。
表1不同浓度的甘珀酸对A549细胞的毒性实验
6．实验结果见图1。
由图1甘珀酸对A549的细胞毒性实验可知，在0UM，10UM，25UM，50UM，100UM，200UM甘珀酸浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100%，99.27%，98.04%，93.10%，91.66%，78.48%。
实施例2
18α甘草次酸对A549细胞的毒性实验:
本发明所采用的18α甘草次酸购买于Sigma（G8503-250MG）公司。
毒性实验
1．接种A549细胞：用含5%胎牛血清的DMEM培养基配成单个细胞悬液，以每孔2000-3000个细胞接种到96孔细胞培养板，每孔接种体积100ul；
2．培养A549细胞：在37℃，5%CO2培养条件下，培养1天；
3．加入18α甘草次酸：吸弃每个孔中的DMEM培养基，向各个孔中加入100ul用含5%胎牛血清的DMEM培养基稀释成相应浓度(10UM，25UM，50UM)的18α甘草次酸，对照孔加不含药物的5%胎牛血清的DMEM培养基 100ul；
4．呈色：培养24小时后，每孔加MTT溶液10ul，在37℃，5%CO2培养条件下继续孵育4小时， 然后终止培养，吸弃孔内培养上清液，每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解；
5．测光吸收值：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果见表2。
表2不同浓度的18α甘草次酸对A549细胞的毒性实验
6．实验结果见图2。
由图2 18α甘草次酸对A549的细胞毒性实验可知，在0UM，10UM，25UM，50UM 18α甘草次酸浓度下，A549细胞的平均存活率分别为100%，95.80%，94.01%，91.62%。
实施例3
甘珀酸对DENV2的抑制作用:
DENV2 MOI=1感染A549细胞，实验步骤如下：
1．种植细胞：在24孔细胞培养板中接种A549细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80~90%)，吸出培养基，接入病毒样品100ul，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含5%胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(10UM，25UM，50UM，100UM)的甘珀酸，于37℃，5%CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据TCID50检测病毒滴度。
表3不同浓度的甘珀酸对DENV2滴度降低实验
2．TCID50实验：
测定DV2病毒感染易感细胞C6/36培养后，引起50%发生病变的最小病毒量，即：C6/36细胞接种于96孔板→24h后依次接种100ul含2%FBS培养基10倍稀释的DENV2，稀释度为10-1~0-10，每个稀释度6个副孔→置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加100ul含2%FBS培养基，35℃，5％CO2培养箱培养，5~6天左右观察结果。
3．实验结果见图3。
由图3甘珀酸对DENV2的抑制作用实验可知，在0UM，10UM，25UM，50UM，100UM浓度的甘珀酸下，甘珀酸对DENV的抑制率分别为0%，54.35%，94.78%，99.99%，99.99%。
实施例4
18α甘草次酸对DENV2的抑制作用:
DENV2 MOI=1感染A549细胞，实验步骤如下：
1．种植细胞：在24孔细胞培养板中接种A549细胞，24小时后细胞长至单层(细胞覆盖孔底的面积约为80~90%)，吸出培养基，接入病毒样品100ul，37℃吸附1小时。吸附完成后，吸弃各孔中的病毒液，用DMEM培养基洗去未吸附的病毒。加入用含5%胎牛血清的DMEM培养基稀释的指定浓度(10UM，25UM，50UM)的18α甘草次酸，对照孔加入同体积的DMSO，于37℃，5%CO2的培养箱中培养24小时，收集各个孔中的上清，再根据TCID50检测病毒滴度。
表4不同浓度的18α甘草次酸对DENV2滴度降低实验
2．TCID50实验：
测定DV2病毒感染易感细胞C6/36培养后，引起50%发生病变的最小病毒量，即：C6/36细胞接种于96孔板→24h后依次接种100ul含2%FBS培养基10倍稀释的DENV2，稀释度为10-1~0-10，每个稀释度6个副孔→置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加100ul含2%FBS培养基，35℃，5％CO2培养箱培养，5~6天左右观察结果。
3．实验结果见图4。
由图4 18α甘草次酸对DENV2的抑制作用实验可知，在10UM，25UM，50UM的浓度下，18α甘草次酸对DENV的抑制率分别为46.64%，84.56%，97.51% 。
实施例5
甘珀酸对DENV1的抑制作用:
DENV1 MOI=1感染A549细胞，实验步骤如下：
1．将甘珀酸(100UM)与DENV1悬液直接混合，于37℃，5%CO2的培养箱中分别放置1h、6h、12h，再根据TCID50检测病毒残留的滴度。
表5 甘珀酸（100UM）对DENV1滴度降低实验
2．TCID50实验：
测定DV2病毒感染易感细胞C6/36培养后，引起50%发生病变的最小病毒量，即：C6/36细胞接种于96孔板→24h后依次接种100ul含2%FBS培养基10倍稀释的DENV1，稀释度为10-1~0-10，每个稀释度6个副孔→置于37℃，5％CO2培养箱培养吸附1h，然后加100ul含2%FBS培养基，35℃，5％CO2培养箱培养，5~6天左右观察结果。
3．实验结果见图5。
由图5甘珀酸(100UM)对DENV1的抑制作用实验可知，在1h、6h、12h的作用时间下，甘珀酸对DENV1的抑制率分别为96.10%，99.99%，99.99%。
Claims (5)
1.甘珀酸在制备抗登革病毒药物中的应用；所述甘珀酸具有C3一羟基端成酯结构；所述抗登革病毒是指抗登革病毒感染细胞或直接对登革病毒进行杀伤；所述登革病毒为登革病毒2型。
2.甘珀酸在制备抗登革病毒感染药物中的应用；所述甘珀酸具有C3一羟基端成酯结构；所述抗登革病毒是指抗登革病毒感染细胞或直接对登革病毒进行杀伤；所述登革病毒为登革病毒2型。
3.含有甘珀酸的药物组合物在制备抗登革病毒感染药物中的应用；所述甘珀酸具有C3一羟基端成酯结构；所述抗登革病毒是指抗登革病毒感染细胞或直接对登革病毒进行杀伤；所述登革病毒为登革病毒2型。
4.根据权利要求1至3任一所述应用，其特征在于，所述细胞为C6/36细胞、人肺癌上皮细胞（A549）、人单核细胞（THP-1）、人原代DC、人原代巨噬细胞（hMφ）、人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）。
5.根据权利要求2至3任一所述应用，其特征在于，制备的抗感染药物采用片剂、胶囊剂、散剂、丸剂、颗粒剂、注射剂或乳剂。
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