CN107823215A - 黄芩苷在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄芩苷在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。该应用中所述的药物由黄芩苷和医学上可接受的辅料组成，其中黄芩苷用在药物中的质量百分含量为0.1％～100％。本发明所述的药物防治寨卡病毒感染的效果显著。

Description

黄芩苷在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及含有机有效成分的医药制品，具体涉及含黄酮类化合物的药物。

背景技术

寨卡病毒(Zika virus，Zikv)属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，病毒颗粒呈球状，直径约为40～70nm。寨卡病毒为单股正链RNA病毒，基因组长约10.8kb，含一条单一开放读码框，病毒蛋白由一个单一的多蛋白前体，经宿主蛋白酶和病毒蛋白酶切而成，包括3个结构蛋白(C、prM/M、E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)，结构蛋白位于氨基端，非结构蛋白位于羧基段，具有丝氨酸蛋白酶、RNA解旋酶和RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)功能。其中，衣壳蛋白和单股正链RNA基因组构成20面体对称的核衣壳，外层脂质包膜。

2015年5月，巴西发现首例确诊寨卡病例，泛美卫生组织(PAHO)发出警告，巴西政府估计有44～150万人感染寨卡病毒。随后，美洲多个国家相继发生寨卡病毒感染病例。公布的数据，自2007年以来，截至2016年11月2日，有73个国家或地区发生蚊媒传播的寨卡病毒感染，26个国家或地区存在与寨卡病毒感染相关的新生儿小头畸形，19个国家或地区存在与寨卡病毒感染相关的格林巴利综合征病例数增加。根据泛美卫生组织(PAHO)的统计数据，截至2016年11月2日，美洲地区2015到2016年间的寨卡病毒本地感染疑似病例数51.5万例，确诊病例16.8万例。世界卫生组织2016年2月1日宣布寨卡病毒为全球紧急公共卫生事件。并且，寨卡病毒所致寨卡热有进一步全球蔓延的趋势。2016年11月，《柳叶刀·传染病》期刊刊登的一项研究列出了8个寨卡病毒传播风险最大的亚洲和非洲国家，印度和中国排在前两位。

当前全球有近30个研究机构正在进行寨卡病毒疫苗研发，但尚没有批准的人用疫苗，寻找一种有效治疗寨卡病毒病的药物迫在眉睫。

黄芩苷，属黄酮类化合物，黄色结晶，熔点223℃。淡黄色细针晶(甲醇)，熔点223-225℃，[α]18D+123℃(c＝0.2，吡啶-水)；易溶于N，N-二甲基甲酰胺，吡啶中，可溶于碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠等碱性溶液中，但在碱液中不稳定，渐变暗棕色，微溶于热冰醋酸，难溶于甲酸、乙酸、丙酮，几乎不溶于水，乙醚、苯、氯仿等。

黄芩苷的化学结构如下式(Ⅰ)所示。

黄芩苷富含于植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)根部，是黄芩的主要有效成分,是黄芩及其制剂的主要质量控制指标,也是服药后体内浓度的控制指标。药理学研究表明黄芩苷具有抗炎，抗菌，解热，镇静，降压，利尿，利胆，保肝以及调节免疫等作用，是一种很有前途的药物。黄芩苷对四氯化碳所致肝损伤动物模型有显著保护作用，对由半乳糖胺诱导的急性重症肝炎有护肝作用。黄芩苷能够抑制乙型肝炎病毒(HBV)抗原，对病毒性肝炎疗效也较好。临床上主要用于治疗肝炎，对急性黄疽、急性无黄疽型及慢性肝炎有明显疗效。但是，目前文献报道中还没有出现黄芩苷具有抗寨卡病毒活性的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供黄芩苷的新用途，即在制药中的新应用。

上述在制药中的新应用为，黄芩苷在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。

上述应用中，所述的黄芩苷可以采用常规的方法从天然植物提取，也可以由合成或其他方法制得。

上述应用中，所述的药物由黄芩苷和医学上可接受的辅料组成，其中，黄芩苷在药物中的质量百分含量为0.1％～100％。

上述应用中，所述的药物可以是临床上可接受的大容量注射液、注射剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。

本发明用黄芩苷抗寨卡病毒是采用病毒空斑滴度法测定黄芩苷对寨卡病毒的抑制作用，观察黄芩苷对Vero细胞的毒性作用和对寨卡病毒的抑制作用，利用CCK-8检测试剂测得受试药物的半数有毒浓度(CC₅₀)为＞400μM，对半数寨卡病毒的最大效应浓度(EC₅₀)为10.89μM，其选择指数SI分别是37，为低毒高效。

本发明用黄芩苷抗寨卡病毒还采用了IFNAR^-/-基因敲除小鼠动物实验测定黄芩苷对寨卡病毒的抑制作用，观察黄芩苷对受寨卡病毒感染的IFNAR^-/-基因敲除小鼠保护作用。

1.实验材料

1.1细胞株

非洲绿猴肾细胞(Vero)，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，本实验室保存。

1.2实验组及其对应的受试药物

受试样品：取购于宝鸡市辰光生物科技有限公司(Lot：0151024)的黄芩苷，用PBS制得浓度为5mM的储备液。

1.3病毒株

Zika Vrius(GenBank accession KU963796)

来源于广东省疾病预防控制中心，ZV株在C6/36细胞扩增，上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤后储存于-80℃。病毒滴度由空斑实验在Vero细胞测定。

1.4动物

C57小鼠缺乏1型干扰素受体(B6IFNAR^-/-)，由广州医科大学赵金存实验室馈赠。所有动物实验经过广州中医药大学实验动物伦理委员会批准。所有实验在广州中医药大学BSL-2级实验室进行。

1.5试剂和仪器新生小牛血清及DMEM培养基(Gibco公司)；DMSO(Sigma公司)；胰蛋白酶(美国DIFCO公司)。Olympus PM-6倒置显微镜(日本OLYMPUS公司)。

2.方法

2.1黄芩苷在Vero细胞上毒性浓度的测定

将细胞瓶中成片生长的Vero用EDTA-胰酶消化计数，以2×10⁴/100μl/孔接种细胞于96孔板中(白色平底)，37℃5％CO₂孵育过夜。将药物用细胞生长培养液(含10％血清)按终浓度400，200，100，50，25，10，1，0.1，0.01μM稀释。吸去培养基，每孔加入药物溶液10μl，设正常细胞对照，每孔加入90μl细胞生长培养液。然后向每孔加入体积分数为10％CCK8细胞活性检测试剂(其中DMEM与CCK8试剂的比例为9：1)100μL，细胞培养板置37℃、体积分数为5％的CO2温箱中继续孵育20min。在酶标仪上测定各孔吸光度值，检测波长为450nm。细胞存活率计算公式：

细胞存活率(％)＝(药物组-空白对照)/(正常细胞组-空白对照)×100％

计算50％毒性浓度为药物半数有毒浓度(CC₅₀)

2.2体外抗病毒作用的测定

用无菌PBS配制成50mM药物母液。细胞毒性实验同1.3.1。将Vero、Hela、Huh7、BHK-21细胞均匀地接种至96孔细胞培养板中，待细胞生长至4×10⁴个/孔时更换成无血清的DMEM培养基，加入终浓度为100，75，50，25，10，2，1，0.1，0.01μM DMEM培养基梯度稀释的待测药物，37℃细胞培养箱孵育1h。孵育后每孔加入感染复数(multiplicity of infection)MOI＝0.5的寨卡病毒，37℃细胞培养箱吸附1h。弃去病毒液，用PBS润洗一次，加入含药培养基，37℃细胞培养箱培养48h。收集细胞上清液测定病毒滴度。计算50％病毒抑制浓度为药物半数有效浓度(EC₅₀)

选择指数SI＝CC₅₀/EC₅₀

2.3病毒滴度的测定

将细胞瓶中成片生长的Vero用EDTA-胰酶消化计数，以2×10⁵/500μl/孔接种细胞于24孔板中。37℃5％CO₂孵育过夜。用不含血清的培养基稀释病毒样本，设置两个稀释倍数，每个稀释倍数设置两个复孔，稀释倍数：10^-2-10^-7。吸去培养基，每孔加200μl病毒液，于37℃5％CO2培养1h。除去接种物，每孔加500μl含2％血清的0.8％CMC，37℃5％CO₂培养5-9天。用3.7％多聚甲醛固定，0.5％结晶紫染色，计数空斑。Pfu/ml＝空斑数×1000/200×稀释因子的倒数。

2.4体内抗病毒作用的测定

取6-8周龄B6IFNAR^-/-小鼠，雌雄各半，SPF级，18只，饲养于广州中医药大学新药开发研究中心病原微生物实验室，温度22℃-25℃，12h/12h明暗光照，动物喂以无菌的颗粒鼠料，饮用水为超纯水，垫料为无菌玉米芯。适应性喂养数天，给予超纯水、高温高压灭菌后饲料，12h/12h明暗光照，随后随机将小鼠分为Control组、ZikV组、Baicalin组；共3组，每组6只。取BA粉末48mg，PBS稀释至12ml，超声波震荡15min，功率90％，温度37℃，溶解后与细胞房内过0.45μm微孔滤膜，得到4g/L BA药液。细胞房内取75μl病毒原液，用无菌PBS稀释至300μl；ZikV组、Baicalin组每只小鼠腹腔注射300μl病毒稀释液，感染剂量即7.5×10⁵pfu,Control组给予等体积无菌PBS。Baicalin组于病毒感染前0d至14d腹腔注射100mg/kg BA，每天一次。感染当天同时与病毒稀释液同时注射。Control组、ZikV组注射等体积无菌PBS。记录每天小鼠体重及状态。分别在第1、2、3、4天经眼底静脉丛取血7滴(约200μl)，血样静置2h后3000r离心10min，取血清-80℃保存，用于噬斑或Elisa实验，余下血样加入1000ulTrizol裂解液(invitrogen)，超声裂解3-4次，每次2s间隔2s，功率40％；剧烈震荡，静置5min，根据康为世纪RNA提取试剂盒步骤提取总RNA。

3.结果

3.1药物毒性结果见下表1。

表1黄芩苷对Vero细胞毒性

利用软件GraphPad Prism5.0绘图如图1所示。

由表1和图1可见，黄芩苷在Vero细胞的药物毒性的CC₅₀为＞400μM，为低细胞毒性药物。

3.2药物抗病毒作用的测定结果见下表2。

表2黄芩苷对寨卡病毒的抑制作用

将表2的数据作出条形图如图2所示。

由表2和图2可见，黄芩苷在Vero细胞的抗病毒作用的经病毒滴度测定，计算得到的EC₅₀为10.9μM，SI为37，计算得到的EC₅₀为10.9μM，表明黄芩苷具抗寨卡病毒的选择指数SI>36.69，有较好的抗病毒作用和安全性。

3.3黄芩苷对C57小鼠的保护作用见图3。

由图3可见，黄芩苷对寨卡病毒感染IFNAR^-/-基因敲除小鼠连续14d腹腔注射4g/L药液，对寨卡病毒感染的小鼠具有保护作用，黄芩苷药物组小鼠存活率由病毒组50.0％提高至83.3％。

3.4黄芩苷对C57小鼠的体重影响见图4。

由图4可见，黄芩苷对寨卡病毒感染IFNAR^-/-基因敲除小鼠连续14d腹腔注射4g/L药液能够，减轻小鼠体重下降趋势。

3.5黄芩苷对C57小鼠的1～4d血清病毒载量影响见图5。

由图5可见，黄芩苷对寨卡病毒感染IFNAR^-/-基因敲除小鼠连续14d腹腔注射4g/L药液能够降低小鼠血液2～4d中寨卡病毒的载量。提示黄芩苷可以抑制寨卡病毒在小鼠体内的复制，并对病毒感染的小鼠具有保护作用。

附图说明

图1为染毒Vero细胞细胞存活率与黄芩苷浓度关系曲线。

图2为黄芩苷对寨卡病毒的抑制作用的条形图。

图3为IFNAR^-/-小鼠的生存曲线图。

图4为Control组、ZikV组和Baicalin组IFNAR^-/-小鼠体重变化的曲线图。

图5为2～4d血清病毒载量的条形图。

具体实施方式

例1：(注射剂)

取黄芩苷1000mg，加枸橼酸1000mg，枸橼酸钠500mg，氯化钠1800mg，加1000ml的注射用水，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经100℃15分钟流通蒸汽灭菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

例2：(胶囊剂)

取黄芩苷5000mg，采用辊压法进行干法制粒，填充入3#空心胶囊，制成规格为100mg/粒的胶囊剂供口服使用。

例3：(片剂)

取黄芩苷5000mg与4000mg淀粉、200mg交联PVP、300mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％PVP的75％乙醇溶液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入适量滑石粉，混匀，压片，制成规格为100mg/片的片剂供口服使用

例4：(颗粒剂)

取黄芩苷5000mg与4000mg淀粉、200mg交联PVP、300mg羧甲基淀粉钠混合均匀，用5％PVP的75％乙醇溶液作为粘合剂，制软材，以18目筛制粒，60℃干燥后1h，制成规格为100mg/片的颗粒供口服使用。

例5：(大容量注射液)

取黄芩苷100mg，氯化钠900mg，加1000ml的注射用水，搅拌使溶解，除菌滤过，灌封，经100℃15分钟流通蒸汽灭菌，制成每支0.1mg/1ml的注射液供注射使用。

Claims (3)

1.黄芩苷在制备防治寨卡病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物由黄芩苷和医学上可接受的辅料组成，其中黄芩苷用在药物中的质量百分含量为0.1％～100％。

3.根据权利2所述的应用，其特征在于，所述的药物是大容量注射液、注射剂、胶囊剂、颗粒剂或片剂。