CN105193782A

CN105193782A - 木犀草素的新用途

Info

Publication number: CN105193782A
Application number: CN201410270721.4A
Authority: CN
Inventors: 苏维恒; 姜春来; 麻彤辉; 孔维; 徐琳
Original assignee: CHANGCHUN BCHT BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Jilin University
Current assignee: CHANGCHUN BCHT BIOTECHNOLOGY Co Ltd; Jilin University
Priority date: 2014-06-17
Filing date: 2014-06-17
Publication date: 2015-12-30

Abstract

本申请涉及木犀草素的新用途，具体地，涉及木犀草素用于制备用于预防和治疗手足口病的药物的用途，尤其是用于制备抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型药物的用途。

Description

木犀草素的新用途

技术领域

背景技术

手足口病是一种常见的儿童传染病，主要病原是肠道病毒71型(Enterovirus71，简称为EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxsackievirusA16，简称为CA16)。近年来，手足口病在亚太地区的频繁爆发已经成为了严重的社会健康问题。据统计，我国从2008年至2012年，超过七百万例的手足口病被报道，并导致了2443例死亡。

目前仍没有上市的疫苗来预防手足口病。在治疗方面，目前临床常使用阿昔洛韦、更昔洛韦、利巴韦林等常规抗病毒药物，并结合板蓝根、注射用双黄连、清开灵冲剂等。虽然以上药物已经用于治疗手足口病，但是它们都属于广谱的清热解毒药物，直接作用机制不明且针对性不强。仍缺乏专门针对EV71/CA16的药物。

虽然现在已经发现，黄酮类化合物猫眼草黄素(chrysosplenetin)和黄酮类垂叶黄素(penduletin)均表现出抗EV71/CA16活性(对于人横纹肌肉瘤细胞，猫眼草黄素的IC₅₀(半数抑制浓度)为0.20μM，黄酮类垂叶黄素的IC₅₀为0.37μM)，但是两者的细胞毒性较大：对于人横纹肌肉瘤细胞，猫眼草黄素的CC₅₀(细胞存活率为50％时的药物浓度)为13.9μM，黄酮类垂叶黄素的CC₅₀为74.18μM(Zhuetal.，2011)。仍然需要开发针对EV71/CA16的低细胞毒性药物。

木犀草素，化学名：3’,4’,5,’7-四羟黄酮，化学式为C₁₅H₁₀O₆，分子量为286.23，其结构式如下：

木犀草素多以糖苷的形式存在于多种植物中，这些植物以全叶青兰、辣椒、野菊花、金银花、紫苏含量较高，具有镇咳和祛痰作用。研究表明，木犀草素抑制巨噬细胞磷酸化，抑制转录因子NF-κB的活性，能够抑制脂多糖诱导的巨噬细胞产生细胞因子IL-6、TNF-α。木犀草素还能提高IFN-γ，降低特异性的Ig-E，减少嗜酸性粒细胞的浸润。另外，木犀草素除了抗炎、抗过敏作用以外，还具有抗SARS、抗HIV病毒的特性。但是尚未报道过木犀草素对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的抗病毒作用。

发明内容

发明人从400种天然产物单体中筛选获得了一个黄酮类化合物——木犀草素，并惊讶地发现木犀草素能够在细胞水平上有效抑制肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的复制，其对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型造成的细胞病变效应和空斑效应有抑制作用且对细胞的毒性较低，因此木犀草素可以成为抗手足口病病毒的候选药物，可以用于预防或治疗手足口病，尤其用于对抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型病毒。

本发明提供了木犀草素在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途。优选地，所述受试者是人。更优选地，所述受试者为16岁以下的儿童。最优选地，所述受试者为5岁以下的儿童。

优选地，所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的药物。

优选地，所述药物包含活性成分木犀草素和一种或多种可药用载体。

优选地，所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。

本发明还提供了一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的细胞病变效应的方法，所述方法包括使浓度为0.1-400μM的木犀草素与细胞接触。

优选地，木犀草素的浓度为0.39-200μM，更优选地，木犀草素的浓度为6.25-150μM，最优选地，木犀草素的浓度为12.5-100μM。

优选地，所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。

本发明还提供了一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的空斑形成的方法，所述方法包括使浓度为5-400μM的木犀草素与细胞接触。

优选地，木犀草素的浓度为6.25-100μM，更优选地，木犀草素的浓度为12.5-50μM。

在本发明中由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的细胞病变效应是指由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的效应。

在本发明中由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的空斑形成是指肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型感染已形成致密单层状态的细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染、死亡、脱落，形成肉眼可见的空斑。所述细胞是人细胞，更优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。

具体实施方式

除非另外说明，实施例中使用的各种仪器和试剂均为普通市售品。在文本中，ATCC是美国典型培养物保藏中心的简称。

实施例1：木犀草素对细胞的细胞毒性以及对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型造成的细胞病变效应的抑制作用

取对数生长期的人横纹肌肉瘤细胞(RD细胞，购自ATCC，登录号：#CCL-136)和稳定表达EV71/CA16受体hSCARB2基因(NCBI登录号：NM_005506.3)的RD细胞(简称RDS细胞，获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室，构建方法参见Lietal.VirologyJournal,10:250)分别以3×10⁴个/孔和6×10⁴个/孔的浓度接入96孔培养板，培养24小时。RD细胞和RDS细胞均在37℃和5％CO₂下培养，其中培养RD细胞使用的培养基为补充有10％胎牛血清的DMEM培养基(简称为10％FBS-DMEM，FBS和DMEM均购自Sigma)，培养RDS细胞使用的培养基为含有0.5μg/ml嘌呤霉素(购自Clontech)的10％FBS-DMEM。

各孔加入50μL含不同浓度木犀草素(购自中国药品生物制品检定所)的补充有2％胎牛血清的DMEM培养基(简称为2％FBS-DMEM，FBS和DMEM均购自Sigma)，使孔中的木犀草素终浓度为200μM,100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.12μM,1.56μM，0.78μM，0.39μM，每个浓度设3个复孔，继续培养细胞48小时，用荧光细胞活性检测试剂盒(购自Promega公司)检测细胞活性。操作按照试剂盒说明书进行，在多标记微孔板检测系统(MultilabelPlateReader2030，购自PerkinElmer公司)上测定560nm下的荧光值，荧光值的大小反映细胞的活性。

在检测木犀草素对由EV71和CA16造成的细胞病变效应的抑制作用时，加药的同时各孔加入50μLEV71(EV71-C4b)或CA16(CA16-Bla)病毒(获自吉林大学艾滋病疫苗国家工程实验室，参见Lietal.VirologyJournal,10:250)进行感染(两种病毒在RDS细胞中的感染复数为0.005，在RD细胞中感染复数为0.1)，继续培养细胞48小时后，如上所述测定560nm下的荧光值。

同时还设置了仅加入2％FBS-DMEM细胞培养液处理的细胞对照及仅加入EV71或CA16进行感染的病毒对照，除了加入的物质不同以外，其他操作同上。

细胞毒性用CC₅₀表示(细胞存活率为50％时的药物浓度)表示，细胞存活率＝(给药组荧光值/细胞对照组荧光值)×100％；

EV71(或CA16)细胞病变效应抑制率＝[(感染EV71(或CA16)并给药组荧光值-感染EV71(或CA16)对照组荧光值)/细胞对照组荧光值]×100％；根据不同浓度的木犀草素对每孔细胞病变效应的抑制率分别算出抑制率为50％时的药物浓度，用半数抑制浓度IC₅₀表示；

药物抗EV71和CA16效果以治疗指数SI₅₀评价，SI₅₀＝CC₅₀/IC₅₀，独立实验重复两次，结果取两次平均值。

实验结果如下：

表1木犀草素对RDS细胞的细胞毒性及对EV71和CA16的抑制率

表2木犀草素对RD细胞的细胞毒性及对EV71和CA16的抑制率

表3木犀草素对RDS和RD细胞的治疗效果

这些结果表明：木犀草素对RDS和RD细胞株的细胞毒性很低(CC₅₀分别为166.36μM和292.00μM)，而对EV71和CA16造成的细胞病变效应有明显的抑制作用；木犀草素在RDS细胞中对EV71和CA16的半数抑制浓度IC₅₀分别为10.31μM和7.39μM，在RD细胞中对EV71和CA16的IC₅₀分别为31.56μM和14.87μM(表3)；可用治疗指数SI₅₀综合评价木犀草素药物抗EV71和CA16病毒的效果，当SI₅₀>2时为有效，SI₅₀＝1时既有效又有毒，SI₅₀<1时为毒性作用较强，木犀草素在RDS细胞中对EV71和CA16的SI₅₀分别为16.14和22.5，在RD细胞中对EV71和CA16的SI₅₀分别为9.25和19.64，表明木犀草素是低毒性并且具有抗EV71和CA16作用的药物。

实施例2：木犀草素对EV71和CA16造成的空斑形成的抑制作用

取对数生长期的RDS细胞，以6×10⁵个/孔的浓度接入12孔培养板，培养24小时。

各孔吸去培养基，加入300μL含不同浓度木犀草素的2％FBS-DMEM细胞培养液，使孔中木犀草素的终浓度为50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,每个浓度设3个复孔；加药的同时各孔加入300μLEV71或CA16(100PFU/孔)病毒进行感染；并设置仅加入2％FBS-DMEM细胞培养液的细胞对照及仅加入EV71或CA16进行感染的病毒对照；继续培养细胞1小时后，吸去培养液上清并用无菌PBS漂洗细胞两遍，向加药组加入含相应浓度木犀草素的1％琼脂2％FBS-DMEM培养基，向细胞对照和病毒对照组加入1％琼脂2％FBS-DMEM培养基，来覆盖细胞；待培养基凝固后，倒置培养72小时，观察空斑；观察后用结晶紫(购自Clontech)染色，计数空斑。

EV71(或CA16)空斑形成抑制率＝[(感染EV71(或CA16)对照组空斑数-感染EV71(或CA16)并给药组空斑数)/感染EV71(或CA16)对照组空斑数]×100％；根据不同浓度的木犀草素对每孔空斑形成的抑制率分别算出抑制率为50％时的药物浓度，用EC₅₀表示。

实验结果如下：

表4木犀草素对EV71和CA16空斑形成的抑制率

结果表明：木犀草素对EV71和CA16的空斑形成也有明显的抑制作用，且呈浓度依赖性；经计算，木犀草素在RDS细胞中对EV71和CA16的半数空斑抑制浓度EC₅₀分别为10.37μM和10.52μM，这说明木犀草素是具有一定的抗EV71和CA16作用的药物。

参考文献：

1.Zhu,Q.C.,Wang,Y.,Liu,Y.P.,Zhang,R.Q.,Li,X.,Su,W.H.,Long,F.,Luo,X.D.,Peng,T.,2011.Inhibitionofenterovirus71replicationbychrysosplenetinandpenduletin.Europeanjournalofpharmaceuticalsciences:officialjournaloftheEuropeanFederationforPharmaceuticalSciences44,392-398.

2.Li,X.J.,Fan,P.H.,Jin,J.,Su,W.H.,An,D.,Xu,L.,Sun,S.Y.,Zhang,Y.,Meng,X.Y.,Gao,F.,Kong,W.,Jiang,C.L.,2013,EstablishmentofcelllineswithincreasedsusceptibilitytoEV71/CA16bystableoverexpressionofSCARB2.Virologyjournal,10:250.

所有参考文献均以引用的方式全文纳入本文。

Claims

1.木犀草素在制备用于预防或治疗受试者中的手足口病的药物中的用途，优选地，所述受试者是人，更优选地，所述受试者为16岁以下的儿童，更优选的，所述受试者为5岁以下的儿童。

2.权利要求1的用途，其中所述预防或治疗手足口病的药物是抗肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的药物。

3.权利要求1的用途，其中所述药物包含活性成分木犀草素和一种或多种可药用载体。

4.权利要求3的用途，其中所述药物还可包含其他用于治疗手足口病的活性成分。

5.一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的细胞病变效应的方法，所述方法包括使浓度为0.1-400μM的木犀草素与细胞接触。

6.权利要求5的方法，其中木犀草素的浓度为0.39-200μM，更优选地，木犀草素的浓度为6.25-150μM，最优选地，木犀草素的浓度为12.5-100μM。

7.权利要求5的方法，其中所述细胞是人细胞，优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。

8.一种用木犀草素抑制由肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型引起的空斑形成的方法，所述方法包括使浓度为5-400μM的木犀草素与细胞接触。

9.权利要求8的方法，其中木犀草素的浓度为6.25-100μM，更优选地，木犀草素的浓度为12.5-50μM。

10.权利要求8的方法，其中所述细胞是人细胞，优选地，所述细胞是人横纹肌肉瘤细胞或稳定转染肠道病毒71型和/或柯萨奇病毒A16型的受体hSCARB2的人横纹肌肉瘤细胞。