CN107714689A - 汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药领域，涉及汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒感染药物中的应用；本发明通过实验验证了汉黄芩素在体外实验中具有较强的抗单纯疱疹病毒的活性，能够抑制病毒结构蛋白gD在mRNA转录及蛋白水平的表达；对汉黄芩素的体外毒性实验发现，该黄酮类化合物对人和非洲绿猴的细胞具有较低的毒性，可以获得较高的治疗指数；因此，汉黄芩素素具有作为一种新型抗单纯疱疹病毒药物的潜在价值，可在制备抗单纯疱疹病毒药物中进行应用。

Description

汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用

技术领域

本发明属于制药领域，涉及汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒的药物中的应用。

背景技术

单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus, HSV）是目前传播范围最广的人类病原微生物之一，主要分为单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1和HSV-2）两类。HSV的传播主要依赖于接触，其感染症状主要包括口、唇或生殖器的皮肤或粘膜上出现的水泡，皮肤损伤愈合时会结痂。HSV-1主要通过口腔途径进行传播，并在人的面部三叉神经节建立潜伏感染；而HSV-2主要依赖于性传播，并在人的骶神经节建立持续性潜伏感染。HSV病毒通过潜伏于人的神经系统来躲避免疫系统的清除，当机体免疫功能下降如风寒、流感、身体或精神压力以及月经或过度暴露于紫外线（如暴晒）等情况时，潜伏的病毒可以被激活，导致病毒复制和再感染。在病毒复发期，伴随有可见的和典型的皮肤症状以及疼痛，且容易发生传染。目前仍未有针对HSV的有效预防性疫苗。现在普遍采用的治疗HSV感染药物，如阿昔洛韦（Acyclovir）、喷昔洛韦(Penciclovir)等，主要为核苷类似物，其作用靶点为病毒DNA聚合酶，通过抑制其酶活性而阻断病毒DNA的合成。此类药物抗病毒机制类似，一旦病毒DNA聚合酶发生突变，极易出现耐药毒株并产生交叉耐药现象。在免疫功能低下或受损如骨髓移植或艾滋病患者中，如果合并感染HSV，其耐药毒株产生的频率更高。因此，研发具有全新作用机制的抗HSV药物具有重要的意义。

唇形科（Labiatase）植物黄芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）是传统的中草药，具有清热解毒，消炎抗菌，消肿等功效。汉黄芩素（Wogonin）是分离自黄芩及同属多种植物的黄酮类化合物，具有式（1）的结构。

式（1）

目前的研究报道主要集中在汉黄芩素抗肿瘤以及抗炎症作用等方面，而汉黄芩素抗病毒的作用较少被报道。专利号为200310110337.X，名称为“汉黄芩素的提取工艺、药物组合物及制剂制备工艺”的专利文献指出高纯度的汉黄芩素及其药物组合物“可以用于各种病毒感染性疾病，优选在制备治疗肝炎、病毒性感冒、病毒性感染引起的急性呼吸道综合征等的药物中应用”。但该文献未公开汉黄芩素对单纯疱疹病毒的抗感染效果。在本发明中，申请人发现汉黄芩素具有显著的抑制单纯疱疹病毒复制的活性，其有望作为新型抗单纯疱疹病毒药物进行开发与应用，以满足临床对于该类药物的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足，而公开汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒药物中的应用。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种汉黄芩素在制备治疗或预防单纯疱疹病毒感染药物中的应用，尤其是汉黄芩素在制备抑制单纯疱疹病毒复制药物中的应用，所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型及2型。

根据本发明的技术方案，可以将治疗有效剂量的汉黄芩素和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其它与汉黄芩素无拮抗作用的抗单纯疱疹病毒药物。其制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂，脂质体等。

本发明的有益效果：

本发明借助病毒分子生物学手段，证明汉黄芩素能够同时抑制单纯疱疹病毒1型与2型在宿主细胞内的复制与传播，同时抑制病毒结构蛋白基因在mRNA以及蛋白水平的表达，具有较强的抑制单纯疱疹病毒感染的活性，同时汉黄芩素作为传统中药黄芩中的主要活性成分，具有低细胞毒性，安全可靠等优势，所以其有望作为预防或治疗单纯疱疹病毒感染的药物进行应用，以缓解目前临床上出现的日趋严重的HSV耐药现象。

附图说明

图1为汉黄芩素抑制单纯疱疹病毒引起的HEC-1-A细胞病变效应；图中，Mock为正常培养的HEC-1-A细胞；Wog.only为添加汉黄芩素培养（终浓度100μM）的HEC-1-A细胞；HSV-2为添加HSV-2（G）病毒液（moi=1）培养的HEC-1-A细胞；Wog./HSV-2为汉黄芩素（终浓度100μM）与HSV-2（G）病毒液（moi=1）共培养的HEC-1-A细胞；箭头指示的是病毒感染后导致的细胞病变。

图2为汉黄芩素抑制单纯疱疹病毒在HEC-1-A细胞上复制的结果；图中，A为汉黄芩素抑制HSV-1(HF) 病毒（moi=1）的复制；B为汉黄芩素抑制HSV-2 (G) 病毒（moi=1）的复制。

图3为汉黄芩素在RNA水平上抑制单纯疱疹病毒在HEC-1-A细胞上复制的结果；图中，A为汉黄芩素抑制HSV-1(HF) 病毒（moi=1）的gD基因 mRNA的表达水平；B为汉黄芩素抑制HSV-2 (G) 病毒（moi=1）的gD基因 mRNA的表达水平。

图4为汉黄芩素在蛋白水平上抑制单纯疱疹病毒在HEC-1-A细胞和Vero细胞上复制的结果；图中，A为汉黄芩素抑制HSV-1(HF) 病毒（moi=1）与HSV-2 (G) 病毒（moi=1）在HEC-1-A细胞上的gD蛋白表达水平；B为汉黄芩素抑制HSV-1(HF) 病毒（moi=1）与HSV-2 (G)病毒（moi=1）在Vero细胞上的gD蛋白表达水平。

图5为汉黄芩素对Vero和HEC-1-A的细胞毒性测试结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

以下实例所用的实验材料：

（1）受试药物：

汉黄芩素（纯度大于99.5%）以及抗单纯疱疹病毒药物阿昔洛韦由中国食品药品检定所提供。

（2）细胞株来源：

非洲绿猴肾细胞Vero，人子宫颈内膜腺癌细胞HEC-1-A均购自美国模式培养物保藏所(ATCC)。

（3）病毒株来源：

HSV-1(HF)，HSV-2 (G)病毒株引自南京大学公共健康医学中心。

（4）实验试剂

mouse-anti-HSV gD-1/2, rabbit-anti-Human GAPDH购自于美国 Santa Cruz公司；qPCR引物由上海生工生物技术有限公司合成；DMEM高糖培养基购于美国Hyclone公司；Macoy’s 5A培养基购于加拿大Wisent公司；Trypsin-EDTA，胎牛血清均来自于美国LifeTechnologies公司；RIPA裂解液购于碧云天生物技术研究所；Tween-20购于美国Sigma-Aldrich公司。TRIzol reagent，SYBR Green Master Mix购于美国Life Technologies公司。

预染蛋白marker购于美国Thermo Fisher公司；0.45μm的低荧光PVDF膜购于美国Millipore公司；ReverTra Ace qPCR RT kit 购于日本TOYOBO公司； BCA蛋白定量试剂盒购于美国Pierce公司；CCK-8细胞活力检测试剂盒购于日本Dojindo公司；OdysseyBlocking Buffer，IRDye 680 goat-anti-rabbit及IRDye 800 goat-anti-mouse抗体购于美国LI-COR公司；其他试剂均为分析纯，均购于南京生兴生物技术有限公司。

实施例1：汉黄芩素抑制单纯疱疹病毒引起的HEC-1-A细胞病变效应

HEC-1-A细胞来源于人子宫颈内膜腺癌，以往研究表明其能够支持HSV-1与HSV-2在其细胞内的感染与复制过程，因此HEC-1-A细胞与经典的用于HSV病毒学研究的Vero细胞一样，也是研究该病毒良好的细胞模型（Qiu M, et al. Pyrrolidine dithiocarbamateinhibits herpes simplex virus type 1 and 2 replication and its activity maybe mediated through dysregulation of ubiquitin-proteasome system. Journal ofVirology, 2013, 87(15): 8675-8686.）。

将HEC-1-A细胞分为4组，第1组为空白对照组，正常培养的HEC-1-A细胞；第2组为病毒对照组（HSV-2），添加HSV-2（G）病毒液（moi=1）培养的HEC-1-A细胞；第3组为汉黄芩单独孵育组（Wog.），添加汉黄芩素培养（终浓度100μM）的HEC-1-A细胞；第4组为汉黄芩素/病毒共孵育组（Wog./HSV-2），为汉黄芩素（终浓度100μM）与HSV-2（G）病毒液（moi=1）共培养的HEC-1-A细胞

本实验首先将HEC-1-A细胞以合适密度接种于96孔板上，次日待细胞融合后，分组别在空白对照组（Mock）和病毒对照组（HSV-2）中只加入培养基（10%FBS DMEM），另两组加入汉黄芩素（终浓度为100μM），37℃、5% CO₂预孵育30 min，之后病毒对照组（HSV-2）与汉黄芩素/病毒共孵育组（Wog./HSV-2）均加入HSV-2（G）（moi=1），37℃、5% CO2孵育24hrs，在倒置显微镜10X下观察并拍照。

如图1所示，空白对照组（Mock）的HEC-1-A细胞呈经典上皮细胞形态，而汉黄芩单独孵育组（Wog. only）未观察到HEC-1-A细胞形态的改变。病毒对照组（HSV-2）细胞感染后出现肿胀、变圆，相互融合形成巨细胞等病变，而汉黄芩素/病毒共孵育组（Wog./HSV-2）细胞形态基本正常，说明汉黄芩素可有效抑制HSV-2感染引起的HEC-1-A细胞病变。

实施例2：汉黄芩素抑制单纯疱疹病毒在HEC-1-A细胞上的复制试验

HEC-1-A 细胞以合适密度接种于96孔板上，次日待细胞融合后，首先分别加入梯度稀释的不同浓度汉黄芩素溶液与细胞进行预孵育，之后分别加入HSV-1 (HF)或HSV-2 (G)（moi=1）对细胞进行感染。培养24 hr后，每孔中加入200 μL新培养基，将该96孔板细胞转入负80℃与37℃温度条件下反复冻融三次，从而释放出病毒粒子。将病毒液进行5倍梯度稀释，取50 μL稀释液加入到铺有单层HEC-1-A细胞的96孔板中，培养48 hr后计数噬斑数量，从而计算病毒滴度。

噬斑计数实验结果如图2显示，汉黄芩素对HSV-1和HSV-2的复制均具有抑制作用，且呈现剂量依赖性。

实施例3：汉黄芩素在RNA水平上抑制单纯疱疹病的复制试验

将HEC-1-A细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入梯度稀释的不同浓度汉黄芩素溶液，37℃孵育30 min，而后分别加入HSV-1（HF）或HSV-2 (G)，感染滴度moi=1。24 hrs后，弃去培养基，加入200μL Trizol裂解细胞，按说明书中叙述的步骤提取细胞总RNA。

利用TOYOBO逆转录试剂盒说明，进行cDNA第一链的合成后进行qPCR检测，采用SYBR Green法对HSV-1 gD基因（GenBank ID：2703444）、HSV-2 gD基因（GenBank ID：1487358）和内参基因GAPDH扩增。反应体系20μL，反应条件为预变性95℃，10min；95℃，15s，60℃,15s，72℃，45s，共40循环，延伸阶段检测荧光（Song, S., et al., Downregulationof cellular c-Jun N-terminal protein kinase and NF-κB activation by berberinemay result in inhibition of herpes simplex virus replication. AntimicrobialAgents & Chemotherapy, 2014. 58(9): 5068-5078.）。

所需要的各引物序列信息如下：

HSV-1 gD基因：

上游引物: AGCAGGGGTTAGGGAGTTG;

下游引物: CCATCTTGAGAGAGGCATC)

HSV-2 gD基因：

上游引物: CCAAATACGCCTTAGCAGACC;

下游引物: CACAGTGATCGGGATGCTGG)

内参基因GAPDH ：上游引物: TGCACCACCAACTGCTTAGC;

下游引物: GGCATGGACTGTGGTCATGAG)。

结果如图3所示，汉黄芩素能有效降低gD-1/2的表达，该作用呈现一定的剂量依赖性，浓度为25μM时对gD-1/2的表达已呈现出较明显的抑制作用，在100μM时抑制效果显著，该结果与图2噬斑实验的结果基本一致。

实施例4：汉黄芩素在蛋白水平上抑制单纯疱疹病的复制试验

将HEC-1-A或Vero细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞汇合后，分别加入梯度稀释的不同浓度汉黄芩素溶液，37℃孵育30 min，而后分别加入HSV-1（HF）或HSV-2 (G)，感染滴度为moi=1。24 hrs后，弃去培养基，将细胞置于冰上，用PBS洗涤后用刮刀挂下细胞转移至1.5mL离心管中；4℃，400g离心5 min，弃去上清；使用一定体积的RIPA裂解液，于冰上裂解30min；4℃，12000 g离心10 min，收集上清；按照BCA蛋白定量试剂盒说明书进行操作，测定上清中的总蛋白量；调整蛋白总量，加入5×Loading Buffer，95℃加热5 min；上样，利用SDS-PAGE电泳使蛋白分离后，将蛋白条带转印至0.45 μm PVDF膜上，膜在使用前先用100%甲醇预处理约10 sec，使膜活化；使用Odyssey Blocking Buffer将该膜浸润1 hr，室温；用含对应蛋白抗体及GAPDH蛋白抗体（1:1000）的Odyssey Blocking Buffer于室温孵育2 hr或4℃过夜；PBST缓冲液洗涤5次，5 min/次；再用加入稀释10000倍的红外荧光标记IRDye 680goat-anti-rabbit及IRDye 800 goat-anti-mouse抗体的Odyssey Blocking Buffer，室温孵育1 hr；PBST缓冲液洗涤5次，5 min/次；使用LI-COR Odyssey系统进行条带扫描，并处理；选用内参蛋白为GAPDH。

结果（图4）显示汉黄芩素能够有效降低HSV gD-1/2蛋白水平的表达，该作用呈现一定的剂量依赖性，在HEC-1-A（图4.A）以及Vero（图4.B）细胞中抑制效果均表现一致。

实施例5：黄芩素对Vero和HEC-1-A的细胞毒性

向90%以上汇合率的96孔细胞中分别加入梯度稀释的不同浓度汉黄芩素溶液100μL，每个浓度设置三个复孔，培养箱中培养24 hr；按照CCK-8试剂盒使用说明书进行操作。每孔中加入10μl CCK-8工作液，37℃孵育3 hr；使用TECAN酶标仪检测450nm的吸光值，细胞活度利用处理细胞吸光度与未处理细胞吸光度的比值得到。

结果（图5）显示，汉黄芩素针对HEC-1-A与Vero细胞的半数细胞毒性浓度（Halfmaximal cytotoxic concentration，CC50）在200μM以上，而汉黄芩素在50-100μM浓度范围内即能有效抑制病毒复制，说明汉黄芩素的抗病毒作用并不是由其细胞毒性所引起。

Claims (10)

1.汉黄芩素在制备抗单纯疱疹病毒感染药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为治疗或预防单纯疱疹病毒感染。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为抑制单纯疱疹病毒复制。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型及2型。

5.一种抗单纯疱疹病毒感染药物，其特征在于，所述药物包含有效成分汉黄芩素。

6.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述的单纯疱疹病毒为单纯疱疹病毒1型及2型。

7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物为治疗或预防单纯疱疹病毒感染的药物。

8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物为抑制单纯疱疹病毒复制的药物。

9.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物还包括药学上允许的任意一种辅料或其它与汉黄芩素无拮抗作用的抗单纯疱疹病毒药物。

10.根据权利要求5所述的药物，其特征在于，所述药物是药学上允许的任意一种剂型，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂，脂质体等。