CN103054867B

CN103054867B - 一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用

Info

Publication number: CN103054867B
Application number: CN201110317934.4A
Authority: CN
Inventors: 陈绪林; 万志涛
Original assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Current assignee: Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date: 2011-10-19
Filing date: 2011-10-19
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2031-10-19
Also published as: CN103054867A

Abstract

本发明公开了一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。防己诺林碱在体外条件下可以剂量依赖地抑制HIV-1在细胞中的复制，在对细胞无毒的浓度下可以97%以上地抑制HIV-1复制。防己诺林碱作用于病毒复制周期中的晚期，且作用机制有别于所有市售抗病毒药物，作用靶点新颖。防己诺林碱作为防己等中药材中的有效成分，来源广泛，安全低毒，具有开发成抗HIV-1药物的广阔前景。

Description

一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用

技术领域

本发明涉及属于医药技术领域，更具体涉及一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。

背景技术

艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，是一种由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病。2007年，全球共有3300万人携带HIV，新增感染者270万，200万人死于艾滋病相关疾病。我国艾滋病呈加速流行趋势，HIV正在向普通人群传播，2009年存活的HIV感染者和艾滋病患者达74万人。艾滋病的流行严重威胁着人类健康和全球经济的发展。

HIV为RNA病毒，属于反转录病毒科，慢病毒属。在HIV的感染过程中，HIV-1外膜糖蛋白gp120与T4淋巴细胞表面的CD4受体特异性结合而吸附于细胞。在辅助性受体CCR5或CXCR4的协助下，HIV-1外膜糖蛋白gp41与宿主细胞膜融合而使病毒粒进入细胞内，并继而脱去衣壳裸露出核酸。在病毒逆转录酶和核糖核酸酶H的催化下，HIV-1单股RNA逆转录成单股DNA，并进而在细胞核内由细胞多聚酶催化成双股DNA。HIV-1的整合酶使双股DNA原病毒整合于宿主细胞的染色体内，形成HIV-1的潜伏感染。以整合的病毒DNA为模板而合成的病毒的mRNA翻译出大的融合聚蛋白，进而在病毒蛋白酶作用下，这些聚蛋白被剪接及加工，形成成熟的病毒结构蛋白。最后，病毒核酸与结构蛋白结合，装配出新的病毒颗粒，并以出芽的方式释放到细胞外。

从齐多夫定(AZT)于1987年首次用于HIV-1感染的临床治疗，至今共有25种药物被批准临床使用，其中包括8种核苷和核苷酸类逆转录酶抑制剂，4种非核苷类逆转录酶抑制，10种蛋白酶抑制剂，2种病毒进入抑制剂和1种整合酶抑制剂。针对HIV易对单一抗病毒药物产生耐药性，高效抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy，HAART))成为目前临床广泛使用的治疗艾滋病的方法。但此种疗法价格昂贵，毒副作用大，不能彻底清除人体内的HIV，而且易引起病毒产生变异性和耐药性。因此，寻找具有新的作用靶点、抗耐药、且价格低、疗效佳、毒性小的新型药物已成为目前抗HIV药物研究的趋势。

传统中药和药用植物来源的天然化合物具有结构多样性、毒性较低、来源广泛等特点，因而在防治艾滋病方面有着独特的优势和巨大的潜力。研究者已经对天然化合物抗HIV作用进行了大量研究，并发现了一些生物碱、香豆素、木脂素、黄酮类、萜类、鞣质类、多糖类、蛋白质和多肽类等天然化合物具有抗HIV的活性。防己诺林碱(Fangchinoline)为生物碱，广泛存在于防己科植物粉防己(Stephania tetrandra S.Moore)灼根，盾状轮环藤(Cycleapeltata Diels)的根，唐松草人字果的根和根茎中的，具有抗炎、镇痛、降压以及抗血小板聚集等作用。目前还没有出现防己诺林碱在抗HIV-1方面的报道。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。防己诺林碱在体外条件下可以剂量依赖地抑制HIV-1在细胞中的复制，在对细胞无毒的浓度下可以97％以上抑制HIV-1复制。防己诺林碱作用于病毒复制周期中的晚期，且作用机制有别于所有市售抗病毒药物，作用靶点新颖。防己诺林碱为防己等中药材中的有效成分，来源广泛，安全低毒。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种防己诺林碱从临床上制备治疗或预艾滋病毒感染提供一种安全有效毒副作用小的天然药物。根据报道，防己诺林碱的化学结构式为：

本发明在体外条件下检测了防己诺林碱的细胞毒性及其对HIV-1复制的抑制作用。在MT-4T淋巴细胞中，2.5μM防己诺林碱对MT-4细胞的生长没有任何影响，其半数致死浓度(CC50)为7μM。通过HIV-1衣壳蛋白(p24)酶联免疫吸附试验(ELISA)，检测了该药物对HIV-1感染的MT-4细胞的衣壳蛋白p24抗原分泌的抑制作用。防己诺林碱可以剂量依赖得抑制病毒的复制，对毒株NL4.3的半数抑制浓度(EC50)为0.8μM，对毒株Lai的半数抑制浓度为1.3μM。该药物在最大无毒性浓度2.5μM时对两株病毒复制的抑制效果分别达到97％和99％。以上结果证明防己诺林碱可以特异性地抑制HIV-1的复制。

为确定防己诺林碱的抗HIV-1机制，本发明进行了进一步研究。利用MT-4细胞保护实验、TZM-b1报告细胞实验、感染性病毒粒子产生实验明确药物作用的病毒复制阶段。结果显示防己诺林碱对HIV-1感染的MT-4细胞具有保护作用，证明了防己诺林碱具有抗病毒作用。在TZM-b1报告细胞实验中，防己诺林碱对HIV复制周期中的早期事件，如进入，逆转录，整合，基因表达等阶段都没有影响，说明其在晚期发挥作用。感染性病毒粒子产生实验显示防己诺林碱并不影响被感染细胞的子代病毒的产生，但能够剂量依赖地减弱子代病毒的感染性。上述实验结果表明该药物抗病毒机制比较新颖，用药时病毒不易产生交叉耐药。综上所述，防己诺林碱具有开发成抗HIV-1药物的广阔前景。

防己诺林碱除了制成单剂用于抗病毒治疗，还可在联合治疗中与其它具有抗艾滋病毒活性的化合物同时给药或分开给药，或通过将各化合物组合成组合药来给药。以防己诺林碱为药物活性成分，可制成片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、注射剂等任何一种药剂学上可接受的制剂。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1.防己诺林碱剂量依赖地抑制HIV-1在MT-4细胞中的复制，在无毒浓度下可以97％以上抑制HIV-1复制。

2.防己诺林碱作用于病毒复制周期中的晚期，且作用机制有别于所有市售抗病毒药物，作用靶点新颖。

3.防己诺林碱为防己等中药材中的有效成分，来源广泛，安全低毒。

附图说明

图1A为一种防己诺林碱的细胞毒性示意图。

不同浓度药物与的MT-4细胞共培养72小时，使用CellTiter Glo试剂进行细胞活性检测。

图1B为一种防己诺林碱的抗HIV活性示意图。

不同浓度药物与HIV-1(毒株NL4.3)感染的MT-4细胞共培养72小时，ELISA检测上清中p24抗原含量。

图1C为一种防己诺林碱的抗HIV活性示意图。

不同浓度药物与HIV-1(毒株Lai)感染的MT-4细胞共培养72小时，ELISA检测上清中p24抗原含量。

图2A为一种防己诺林碱对感染性病毒颗粒产生的影响示意图。

pNL4.3转染293T细胞后，加入不同药物培养48小时后，检测细胞活性及上清中的p24含量，并使用TZM-b1细胞对子代病毒的感染性进行检测。

图2B为一种防己诺林碱对感染性病毒颗粒产生的影响示意图。

pNL4.3转染293T细胞后，加入不同浓度防己诺林碱培养48小时后，检测上清中的p24含量，并使用TZM-b1细胞对子代病毒的感染性进行检测。

具体实施方式

实施例1：防己诺林碱在MT-4细胞中的细胞毒性和抗艾滋病毒活性

在本实施例中，使用Cell TiterGlo(Promega公司产品)试剂来对细胞活性进行定量检测从而确定防己诺林碱的细胞毒性，使用p24 ELISA(该p24ELISA试剂盒购买中科院武汉病毒研究所)来检测被感染细胞上清中的病毒含量从而确定该药物的抗病毒活性。具体实验方法如下。

细胞毒性实验：MT-4细胞(来自美国国立过敏及感染性疾病研究所)于37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/mL的青霉素和链霉素的1640培养液培养，定时传代保证细胞密度为1×10⁵～1×10⁶/mL。在药物毒性检测实验中，将2倍梯度稀释的防己诺林碱(四川维克奇生物科技有限公司产品)加入96孔板，每孔50μL，每浓度3个重复，无药物对照孔不含任何药物。取对数生长期的MT-4细胞，调整密度至2×10⁵/mL，每孔中加入100μL细胞悬液。培养72小时后，每孔加入100uL细胞活性检测试剂CellTiter Glo，Envision2102(Perkin Elmer公司)多标记检测仪检测化学发光信号。根据化学发光数据计算细胞存活率，公式如下：

细胞存活率(％)＝(样品孔-空白对照)/(细胞对照-空白对照)×100％

抗病毒实验：将2倍梯度稀释的药物加入96孔板，每孔50uL，每浓度3个重复，无药物组不加任何药物。取对数生长期MT-4细胞，调整密度至1×10⁶/mL。加入HIV Lai(pLai转染293T获得，pLai来自美国国立过敏及感染性疾病研究所)和NL4.3(pNL4.3转染293T获得，pNL4.3来自美国国立过敏及感染性疾病研究所)病毒储存液进行感染，感染复数(MOI)为0.1。病毒感染1小时候，离心细胞，去除上清并用新鲜的培养液重悬细胞至2×10⁵/mL。将感染有HIV的细胞加入96孔板，每孔100μL细胞悬液。培养72小时后，每孔取上清50μL，加入50uL浓度为1％的TritonX-100，37度放置1小时裂解病毒。使用p24ELISA试剂盒检测样品中的p24抗原含量。根据ELISA数据计算细胞存活率，公式如下：

病毒复制(％)＝(样品组-未感染对照)/(无药物对照-未感染对照)×100％

如图1所示，2.5μM防己诺林碱对MT-4细胞的生长没有任何影响，其半数致死浓度(CC50)为7μM。在无毒浓度下，防己诺林碱可以剂量依赖得抑制病毒的复制，对毒株NL4.3的半数抑制浓度(EC50)为0.8μM，对毒株Lai的半数抑制浓度为1.3μM。药物浓度在2.5uM时对两株病毒复制的抑制效果都达到95％。综上所述，防己诺林碱在体外中显示明显的抗HIV作用。

实施例2：防己诺林碱对HIV-1复制周期中的早期阶段的影响

为研究防己诺林碱的抗病毒机制，本实施例运用MT-4细胞保护实验以及TZM-b1报告细胞实验同时检测药物的抗病毒活性，通过与对照药物(购自美国国立过敏及感染性疾病研究所)进行对比来确定防己诺林碱是否作用于HIV-1复制周期中的早期阶段。在MT-4保护实验中，HIV-1进行多轮复制并造成细胞病变，所有抗HIV-1药物都能在该实验中显示活性。TZM-b1细胞(来自美国国立过敏及感染性疾病研究所)稳定表达HIV受体CD4，共受体CXCR4以及CCR5，并且基因组中整合有受HIV-1启动子LTR控制的报告基因(萤火虫荧光素酶)，病毒感染之后Tat的表达可以促进报告基因的表达，所以，在该系统当中，只有作用于病毒复制早期阶段的抗病毒药物，才能够显示活性。

MT-4细胞保护实验：将3倍梯度稀释的药物加入96孔板，每孔50uL，每浓度3个重复，对照孔不加任何药物。取对数生长期MT-4细胞，调整密度至6×105/mL。加入HIVNL4.3病毒储存液进行感染，感染复数(MOI)为0.1。病毒与细胞孵育1小时后，加入新鲜的培养液调整细胞密度至1×105/mL。将感染有HIV的细胞加入96孔板，每孔100uL细胞悬液。细胞对照孔加入相同密度的未感染的MT-4细胞。培养5天后，每孔加入100uL细胞活性检测试剂CellTiter Glo，水平震荡10min后，Envision 2102多标记检测仪检测化学发光信号。MT-4细胞保护率计算公式如下：保护率(％)＝(样品-病毒感染对照)×100％/(未感染对照-病毒感染对照)。

TZM-b1报告细胞实验：胰蛋白酶消化对数生长期TZM-b1细胞，调整细胞密度至1×10⁵/mL，每孔100μL细胞悬液加入96孔板。第二天，加入3倍梯度稀释的药物50μL，每浓度3个重复，对照组不加任何药物。再加入适当稀释的NL4.3病毒储存液50μL，保证感染复数为1，未感染对照组不加病毒。培养板置培养箱48h后，每孔弃100μL上清，并加入荧光素酶活性检测试剂SteadyGlo(Promega公司产品)100μL，水平震荡10min后，Envision 2102多标记检测仪检测化学发光信号。抑制率计算方法为：

抑制率(％)＝(病毒感染-对照样品)×100％/(病毒感染对照-未感染对照)

如表1所示，在MT-4细胞保护实验中，HIV病毒进行多轮感染，所有阳性药物以及防己诺林碱对显示了明显的抗病毒活性。而在TZM-b1报告细胞实验当中，阳性药物中进入抑制剂硫酸葡聚糖(分子量5000)、逆转录酶抑制剂(齐多夫定)、整合酶抑制剂(INI 118-D-24)、转录抑制剂(弗拉平度)都显示了抗病毒作用，而作用于病毒复制周期晚期的蛋白酶抑制剂茚地那韦却不能抑制病毒蛋白的表达。防己诺林碱在MT-4细胞中具有抗病毒作用，但在TZM-b1细胞中却不能抑制病毒蛋白的表达，说明其与蛋白酶抑制剂类似，作用于病毒复制周期中的晚期阶段。

表1

药物	MT-4实验EC50	TZM-b1实验EC50	作用阶段
				硫酸葡聚糖	57.4nM	20.9nM	病毒进入
齐多夫定	5.7nM	4.9nM	逆转录
				INI 118-D-24	13.6μM	4.0μM	整合
弗拉平度	2.1nM	2.6nM	基因表达
				茚地那韦	5.3nM	＞5μM	蛋白剪切
防己诺林碱	0.7μM	＞5μM

实施例3：防己诺林碱对感染性病毒颗粒产生的影响

在该实验系统中，HIV基因组被直接转染入细胞中，从而HIV的生活周期只包括基因表达，病毒颗粒包装、分泌和成熟。通过该实验可验证药物是否对HIV生活周期中的晚期事件发挥作用。取对数生长期293T细胞(购自美国典型培养物保藏中心)，以每孔5×10⁴/孔铺于24孔板备用。第二天，脂质体法(Lipofactamine 2000，Invitrogen公司)转染质粒pNL4.3，3小时候后更换含有药物的新鲜培养液。转染48h后，Cell TiterGlo检测细胞活性；p24ELISA检测病毒颗粒的产生；TZM-b1报告细胞检测子代病毒感染性。p24抗原检测方法为：每孔取上清50μL，加入50μL浓度为1％的TritonX-100，37度放置1小时裂解病毒后，使用p24ELISA试剂盒检测其抗原含量；子代病毒感染性实验方法为：每孔取上清20μL，加入提前一天铺板的TZM-b1细胞中(铺板密度1×10⁴/孔，每孔含培养液130μL)，培养两天两天后，加入萤火虫荧光素酶检测试剂Steady Glo 100μL，水平震荡10min后，Envision 2102多标记检测仪检测化学发光信号。

结果显示，阴性对照药物齐多夫定(AZT)对细胞活性，子代病毒的产生和感染性没有明显影响；阳性药物茚地那韦(IDV)在500nM浓度下可以明显抑制子代病毒的分泌，抑制率为84％，而且子代病毒感染性与不加药物的对照组相比为0％。说明在该实验下，只有作用于病毒复制周期晚期的药物才能够抗病毒活性。防己诺林碱在10μM浓度下对293T细胞没有明显毒性，而且对病毒颗粒的分泌没有作用，但是，其分泌的子代病毒的活性只有无药物对照的4％。在0.6μM至10μM的浓度范围内，防己诺林碱可以剂量依赖得抑制子代病毒的感染性，但对病毒颗粒的产生没有作用。以上数据显示，防己诺林碱与蛋白酶抑制剂同样作用于病毒复制的晚期阶段(整合后)，但是其作用机制可能并不相同。

Claims

1.一种防己诺林碱在制备治疗或预防艾滋病毒药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的防己诺林碱为药物活性成分，制成任何一种药剂学上可接受的剂型。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或注射剂。