JPH05500824A - Ｈｉｖ関連疾病の処置での漢方薬草抽出物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＨＩＶ関連疾病の処置での漢方薬草抽出物本出願は１９９０年６月１９日出願さ れた係属中の米国出願筒５４０．１５８号の部分継続出願である。

工　技術分野 本発明は医薬及び薬理学の分野にある。特に、本発明は、後天性免疫不全症候群 （ＡＩＤＳ）及びＡＩＤＳ関連複合体（ＡＲＣ）の病因剤に対するインビボ及び ／又はエクスビホ活性を示す１０の商業的に入手可能な漢方薬草抽出物（ＣＨＥ Ｓ）を特徴づける。

■　背景技術 後天性免疫不全症候群は生命を日和見感染及び悪性に脅かすことになる汎発流行 免疫抑制病である。ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ−ＩＣＨＴＬＶ−ＩＩＩ　 ＬＡＶＩ）と名付けられるレトロウィルスは、本疾患の病因剤として分離され同 定された。このウィルスはＴヘルパーリンパ球及び単核球−マクロファージによ り宿されることが示され、それは全血液、血漿、リンパ球、血清、精液、唾液及 び中枢神経系組織で検出可能である。

ホ等、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メディシン、３２１：１６２ １−１６２５（１９８９）。単核球−マクロファージ系統の細胞はＨＩＶ感染の 重要な保有者として役立つけれども、血液中のほとんどの細胞結合ウィルスはＣ Ｄ４＋Ｔ細胞内に含まれる。

さらに特徴的に、ＡＩＤＳは、Ｔ細胞、特に０ＫＴ４表面マーカーを生じるヘル パーインジューサーサブセットの進行性消耗と結合する。

幾つかの剤がインビトロでヒト免疫不全の成長を抑制すると報告されて来た。イ ンビトロで抗ＨＩＶ活性を示す剤のうち、幾つかは、臨床使用で新しく、リバビ リン、シトプリン（ＡＺＴ）、２’、３’−ジデオキシヌクレオサイズ（ＤＤＩ 及びＤＤＣ）、ガンシクロビア、α−インターフェロン、インターロイキン−２ 、アンブリケン及びイソプリンシンを含む。アナンド等、ランセットｉ、９７− ９８（１９８６）；バルザリニ等、インターナショナル・ジャーナル・オブ・キ ャンサー３７：４５１−４５７（１９８６）；ホ等、ランセット１．６０２−６ ０４（１９８５）；マツクコ−ミック等、ランセットｉｉ。

１３６７−１３６９（１９８４）；ミソチェル等、ランセットｉ、８９０−８９ ２（１９８７）＋　ミツヤ等、プロシーンインゲス・オブ・ナショナル・アカデ ミイ・オブ・サイエンス・ニーニスエイ８３：１９１１−１９１５及び８２ニア ０９６−７１００（１９８５，１９８６）：ミツヤ等、サイエンス２２６：１７ ２−１７４（１９８４）：バート等、プロシーンインゲス・オブ・ナショナル・ アカデミイ・オブ・サイエンス、ニーニスエイ８３：９２５４−９２５８（１９ ８６）：ビジ等、ヒユーマン・バイオロシイ２２：１５１−１９０（１９５０） ；ローゼンバウム等、ランセット１．４５０−４５１（１９８５）；サンドスト ロム等、ランセットｌ、１４８０−１４８２（１９８６）：ヴエノ及びキノ、ラ ンセットｉ：１３７９（１９８７）：ヤマモト等、インターフェロン・リサーチ ６：１４３−１５２（１９８６）及びアンチバイラル・リサーチ７：１２７−１ ３７（１９８７）。しかしながら、データまでの治療でＡＩＤＳを治すことは知 られていない。

上記で引用したものを含むＨＩＶに対する使用に試験された化合物の多くは、長 期使用で非常に毒性であるか、ヒト宿主からのＨＩＶ感染を完全に排除する能力 がない。ブランチ等、ランセットｉ、８６３（１９８６）：デ・クラーク等、１ ５７５−５８０（１９８６）；ウェッターバーブ等、ランセットｉ、１５９（１ ９８７）。ＡＩＤＳ状況の過酷さ及びこれまで試験された化合物の毒性と限られ た臨床効果を考慮し、本発明の化学書違は中国の薬草からの抽出物の抗ＨＩＶ活 性を研究し始めた。チャン及びユエン、アンチハイラル・リサーチ９：１６３− １７６（１９８８）；チャン等、アンチバイラル・リサーチ１１；２６３−７３ （１９８９）。漢方薬草におけるこの興味は、中国民間伝承により促がされ、こ こで多くのこれらの薬草が抗感染活性を有し、ヒトによりよく耐えられるとみな されて来た。

これらの薬草のサブセットも抗ＨＩＶ活性を示すようであり、本明細書で開示さ れる。

しかし、なから、中国民間薬は過去何千年にわたる逸話の観察に多く基づく。従 って民間薬開業者により用いられる薬草の効果は多くの部分が科学的方法により 立証されていない。科学的証明の欠除にもかかわらず、幾らかの薬草医薬品が特 異的治療作用を有することは、抗マラリャ、キングハオス（ｑｉｎｇｈａｏｓｕ ）及び多分抗ＨＩＶ活性さえ伴う場合があることが証明されたように、大いにあ りうる。クレイマン、サイエンス、２２８：１０４９−１０５５（１９８５）。

従って、漢方薬草抽出物の中の可能な抗ＨＩＶ活性に関し、１）有効な抗ＨＩＶ 薬草抽出物の同定、２）近代科学的方法による、ＨＩＶに対するこれらの薬草抽 出物の有効性の実質的記録及び３）現在入手可能な抗ＨＩＶ剤よりも毒性の少な い有効な抗ＨＩＶ漢方薬草抽出物の同定について早急に必要である。本発明はこ の必要を満たし、又、関連する利益をもたらす。

この出願を通じて記載した文献は引用して明細書記載の一部とする。

■　発明の開示。

全部で５６の薬草抽出物、その幾らかは抗感染性質を有し、中国での臨床使用で 無毒であることが知られている、をインビトロ技術を用いてそれらの抗ＨＩＶ活 性をスクリーンした。これら５６薬草抽出物の１０は、インビトに実験で有効な 抗ＨＩＶ活性を有することを示し、これら１０の２は、又、エキソビボ実験て抗 ＨＩＶ活性を示した。

これら１０は抽出形を含む試料＃１−コプテイス・キネウシス、これは中国西部 、南部及び中央部に生息できる。試料＃８−リグステイウム・ワリチイ、これは 中国北部及び南西部に見出すことができる。及びサルビア・ミルチオリザ、これ は、中国のほとんどの地域に生息できる。試料＃２１−イリジウム・ランセオラ ツム、これは中国の東部及び南部に生育てきる。試料＃３０−イサティス・テイ ンクトリア、これは中国中央部に見出すことができる。ロニセラ・ジャポニカ、 これは中国のほとんどの地域に生息できる。及びポυゴヌム・ビストルク、これ は中国北部、東部及び南西部に生息できる。試料＃３２−サルヒア・ミルティオ ルヒザ、これは中国のほとんどの地域に生息できる。

試料＃３５−エリシベ・オブツシフォリア、これは南中国、台湾、日本、インド ネシア及び化オーストラリアに見出すことができる。

試料＃３９−アカンソパナクス・グラシリアティルスーこれは中央及び南西中国 並びにフィリピンに生育できる。試料＃６１−ボスタウルス・ドメスティクス、 これは中国のほとんどの地域及び南アフリカに見出すことができる。そしてスフ テラリア・パイ力しウシス、これは中国北部、西部及び中央部ならびに南アスリ 力に生息できる。

試料＃４４−イヌラ・ヘレニウム、これは中国北部のほとんどの地域に生息でき る。及びサルビア・ミルティオルヒザ、これは中国のほとんどの地域に生息でき る。及び試料＃４９−ロニセラ・ジャポニカ、これは中国のほとんどの地域に生 息できる。及びスフテラリア・パイ力しウシス、これは中国南部、西部及び中央 部並びに南アフリカに生息できる。この情報は以下の表工に再度示され、これは 、又、主題の薬草を確認するため別名を提供する。

タ　や タ　タ　タ 本明細書の文脈では、ＣＨＥは、成分、成分の組合せ、生物学的メタポライド、 その誘導体又は上記の組合せである、インビボ及び／又はエクスビポ抗ＨＩＶ活 性を示す、上で述べられた全ての薬草の全ての種を引用するのに用いられる。Ｃ ＨＥ類の正確な化学組成及び薬理学的機構のまだ明らかにされていないので、抗 ＨＩＶ活性は単−ＣＨＥ成分、ＣＨＥ成分の組合せ、或いはその生物学的メタポ ライド又は誘導体による可能性がある。

用語ｒＨＩＶＪ及びｒＡＩＤＳ−関連ウィルス」は、明細書の一部となった引例 に記載されるように以前ＨＴＬＶ、ＬＡＶ及びＡＲＶと呼ばれた一般に指摘され るＨＩＶ系列（ヒト免疫不全ウィルス）及びその種を意味する。

同様に用語ｒＨＩＶ関連疾患」及びｒＡＩＤＳ関連疾患」は、その起源が真菌類 、ウィルス及び／又は細菌である感染を含むこれらに限られないＨｒＶ又はＡＩ ＤＳ関連ウィルスにより直接又は間接に起こる全ての疾患又は症候群を引用する 。

従ってＨＩＶで感染した宿主に治療剤としてＣＨＥ類を適用することが本発明の 目的である。各ＣＨＥのために評価された治療インデックス（ＴＩ）を含む、イ ンビボ研究、エクスビボ研究は、これらのＣＨＥ類がインビボ抗ＨＩＶ剤として 薬理学的製剤に有用であることを示唆する。薬理学的製剤は、薬理学的活性成分 のみ又は適当な賦形剤又は担体と混合して含み得、又、腸管経由、例えば経口又 は直腸、及び非経口、例えば腹腔内、筋肉内、静脈内又は皮下投与経路によりＨ ＩＶ感染宿主に投与される。薬理学的試薬は又、追加の抗ウィルス剤、免疫修飾 物質、全ての他の化学療法剤、抗体又はその組合せと組合せて投与しうる。加え て本発明による薬理学的製剤は、例えば用量単位形、例えばタブレット、カプセ ル、座薬又はアンプルでありうる。

本発明の他の目的は、ＣＨＥ成分、又はＣＨＥ成分の組合せ、生物学的メタポラ イド、その誘導体又は上記の組合せの、感染宿主におけるＨＩＶ関連疾患の処置 のための薬理学的製剤における使用である。

さらに本発明の目的は、ＣＨＥ、その活性成分又は成分、生物学的メタホライト 、その誘導体、又は上記の組合せの、単独又は標識と接合して、ＨＩＶ関連疾患 の診断のための診断試験での使用である。かかる試験は、ＨＩＶ感染Ｔ細胞又は ＣＨＥから誘導された抗イデイオタイプ抗体に結合するＣＨＥの能力に基づく、 免疫蛍光テストである。

さらに別の本発明の目的は、ＣＨＥＸＣＨＥ成分、ＣＨＥ成分の組合せ、生物学 的メタポライド、その誘導体又はワクチンを生成するための上記の組合せを使用 することである。一度ＣＨＥの「活性部位」が決定されると、最近の免疫技術が かかるワクチンを生成するのをあてにできる。

これらの及び他の目的は、以下の記述及び付加された請求項から当業者にとって 容易に明らかになるであろう。

■　図面の簡単な説明 本発明は添付図面と関連して記載される。

図１は、ｌａｂ分離物Ｉ［［Ｂに対する１０のＣＨＥの各々についての中和アッ セー結果を描（複合グラフである。

図２は、実験室分離物ＨＩＶ−ＩＡＣに対する１０のＣＨＥの活性を描く複合グ ラフである。

図３は、ｌａｂ分離物ＨＩＶ−２に対する１０のＣＨＥの各々についての中和ア ッセー結果を描く複合グラフである。

図４は、ウィルスの７分離、臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃１のパーセン １−ＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図５はウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃８のパーセントＨ ＩＶ中和を示し、又、比較する。

図６は、ウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃２１のパーセン トＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図７はウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃３０のパーセント ＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図８は、ウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃３２のパーセン トＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図９は、ウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃３５のパーセン トＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図１０は、ウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃３９のパーセ ントＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図１１はウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ　＃４１のパーセ ントＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図１２はウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃４４のパーセン トＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図１３はウィルスの７分離臨床分離物の各々についてのＣＨＥ＃４９のパーセン トＨＩＶ中和を示し、又、比較する。

図１４はＣＨＥ＃３２により示されるＨＩＶ複製抑制の程度を描（複合グラフで ある。

図１５は慢性的に感染したＨ９／１１１　Ｂ細胞におけるＣＨＥ＃２１、＃３２ 及び＃４９の抗ＨＩＶ活性を示し、又、比較する。

図１６は、ＨＩＶＩＩ［Ｂ逆転写酵素の各ＣＨＥのパーセント中和を描く複合グ ラフである。

図１７は、３人の患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮｓ）及び血漿におけるＣＨＥ ＃３２のエクスビホ抗ＨＩＶ活性を示し、又、比較する。

図１８は３人の患者のＰＢＭＮｓ及び血漿におけるＣＨＥ＃４９のエクスビポ抗 ＨＩＶ活性を示し又比較する。

■　詳細な説明 以下の詳細な説明及び手順は、本発明の原理を示すのに提供される。これらは、 しかしながら、発明を限定することを意図するものではなく、それは添付の請求 の範囲の全範囲に拡がる。

Ａ、抽出物の調製 ５６対象薬草は、中国から、非経口用途用にアンプルに詰められた抽出形で得た 。しカルながら本発明の抽出物は、以下に述べる方法又はいかなる有機抽出方法 を用いることにより課題薬草から調製できる。

乾燥薬草の１ｋｇを小片にカットする。カットした薬草片を８１の水に室温で６ −８時間浸漬し、次いで１時間還流下に煮沸する。抽出液をデカントし、０．４ ５μｍ膜フィルターを通過させて１１に濃縮する。

濃縮抽出物に３１の１００％エタノールを加えて混合物を室温で４８時間保つ。

抽出物をデカント、濾過、上記のようにＩＩに濃縮する。このエタノール沈澱を ２回繰り返す。

０３％チャーコールを濃縮抽出物に加え、チャーコール−抽出物混合物を５分間 煮沸する。抽出物を再び濾過する。

濾過抽出物に、１０％水酸化ナトリウムをｐＨまで加える。これらの手段を用い て得られた最終抽出物濃度は１ｇ薬草／ｍｉであるべきである。

Ｂ、薬草抽出物の面前性濃度の測定 ５６ＣＨＥの抗ＨＩＶ活性を評価する前に、毒性研究を、観察した活性がＣＨＥ により宿主リンパ球の無差別の破壊に帰さないことを確実にするまで実施した。

これらの研究のため、Ｔ細胞毒性試験のための標準実験室方法は以下の通りであ った。チャン等、アンチバイラル・リサーテ、９：１６３−１７６（１９８８） 、マーチヤント等、バンドブック・オブ・セル・アンド・オーガン・カルチャー 、バーゲス・パブリッシング・カンパニー、ミネアポリス、ミネソタ（１９６０ ）。

大略述べると、試験すべきＣＨＥ抽出物をメディウムに順次に２倍希釈した。希 釈抽出物の０．２１Ａ’に、Ｑ、８ｍ７の新しく調製したＨ９細胞懸濁液を加え た。（Ｈ９細胞はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ、　Ｔ、 　Ｃ，Ｃ，）から得た。）これを２回行ない、メディウム調節は各アッセーに含 めた。このメディウム調節は０゜２ｍｌのメディウムに添加された領８Ｉ７＋の 同じＨ９細胞懸濁液からなり、調節は、４回行なった。インキュベーションの４ 日後、各培地中の生存細胞の数を色素排除により血球計算盤で数えた。抽出処理 培養の生存数がメディウム調節の平均以下２　Ｓ、　Ｄ、のとき、抽出処理培養 は、殺細胞作用の証拠を示すと考えた。殺細胞作用の証拠を示さない抽出物の最 高濃度を面前性（ｓｕｂｔｏｘｉｃ）１１度又は最大許容用量（ｔｏｌｅｒａｔ ｅｄ　ｄｏｓｅＸＭＴＤ）として取った。抗ＨＩＶ活性を示す１０ＣＨＥについ てのＭ　（Ｄは以下の表ｎに開示する。

最大許容用量（ＭＴＤ） ＣＨＥ　ＭＴＤ（μｉ） ＃１５ それらのＭＴＤを測定して、５６ＣＨＥを次いでＨ９細胞におけるＨＩＶ−１１ １Ｂに対するそれらの抑制活性についてスクリーンした。（ＨＩＶ−ｍＢは、ボ ポヴイック及びガロ博士から得た。）アッセーが文献に記載されている、標準中 和アッセーを用いてＨＩＶ発現を培養上清液中のＰ２４生成により検出した。ポ 等、サイエンス２３９：１０２１−１０２３（１９８８）：及びホ等、ジャーナ ル・オブ・ヴアイロクレイ６１：２０２４（ｉ９８７）。

特に、ＨＩＶ−ｍＢ分離物についてのＴＣＩ　Ｄｓｏ（５０％組織培養感染用量 ）はｌＸｌ０’ヒトＴリンパ球との接触に置かれ、１時間後、研究下のＣＨＥを 異なる用量で加えた。この培養は、次いで７日間続けてＨＩＶコア蛋白Ｐ２４の 生成により測定し、生存発現の印を観察した。特別のＣＨＥは、対照培養に比べ て９０％の生存複製がブロックされない限り抗ＨＩＶ活性を有するとは思われな い。

ＩＤ５ｏ及びＩＤＧＯ（それぞれ生存複製の５０％及び９０％を抑制するに必要 なＣＨＥの量）は、又、抗ＨＩＶ活性を示したｌ０ＣＨＥの各々について、計算 した。加えて、ＩＤ５゜にょってＭＴＤを割ることによって、治療インデックス を得た。一般に、治療インデックス（Ｔ、１．）は、薬物効力と安全の調査であ り、高治療インデックスが望ましい。

図１はｌａｂ分離分離物ｍ対するｌ０ＣＨＥの各々の抗ＨＩＶ活性を示す。要す るに１０課題ＣＨＥについてのＩＤ５ｏは０．１５μβから１．８０μｌに及び 、一方ＩＤ、、は領３８μｌから２．７０　ｕｌに及んだ。これら同じ１０につ いてのＴ、１．は２２から１７３に及んだ。

これらの値は全て以下の表■に示される。

表■ Ｈ９細胞のＨＴＬＶ−Ｉ［［Ｂ感染に対する陽性活性を伴うｌ０ＣＨＥ ＣＨＥ　ＭＴＤ（、ｃｚｌ）　抗−ＨＴＬＶ−ｍＢ活性ＩＤ５ｏ（μＡ’）　Ｉ Ｄ、ｏ（μＡ’）　Ｔ、　Ｉ　。

＃１　０５’　０．１５　０．８４　３３．３３＃８　０５　０．１４　０．３ ８　３５．７１＃２１　４０　１．８０　２．３０　２２．２２＄３０　２０　 ０．２６　１．７０　７６．９２＃３２　２０　０．４５　０．６６　４４．４ ４＄３５　１０　０．４１　１．７０　２４．３９＃３９　８０　１．００　５ ．６０　８０．００＃４１　２０　０．３４　２．７０　５８．８２＃４４　４ ０　０．２３　０．６５　１７３．９１＃４９　２０　０．２４　０．５３　８ ３．３３同様の方法を用いて、ＣＨＥを次いで、７臨床分離物（Ｊ、ＡＰ。

Ｌ、Ｂ、Ｐ、Ｃ，Ｆ）及び２添加ＨＴＬＶ実験室分離物（ＡＣ及びＨＩＶ２）に 対して、正常刺激ＰＢＭＮにおいて、試験した。（臨床分離物及びＡＣ実験室分 離物は、カリホルニア、ロスアンゼルスにおけるセダースーケイナイ・メディカ ル・センターで処置されたＡＩＤＳ患者から得た。ＨＩＶ−２（ＬＡＶ−２ＲＯ Ｄ）はフランスノ、インスティチ二−ト・パスツールにおけるルり・センタニア から得た。）ＩＯＣＨＥは、はとんどの臨床分離物に対して抗ＨＩＶ活性を示し たが、効力は異なった。同様に、図２において、全１０ＣＨＥは、ＡＣ実験室分 離物に対して活性を示したが、図３において、１０ＣＨＥ（７）わずかに２つ（ ＃４１及び＃４９）がＨＩＶ２分離物に対してかなりの抑制活性を示した。この 方法の結果は以下により詳細に討論される： 図４に示されるように、ＣＨＥ＃は、０．２０μｌから３．５μｌに及びＩＤ５ ｏで７−次分離物の６について、９０％抑制より大を示した。

図５において、ＣＨＥ＃８は、０．３５μｍと５．００μｌに間に及ぶＩＤ、。

で、７−次分離物について９０％抑制に等しいかより大を有することが判った。

図６に示すように、ＣＨＥ＃２１は、１．７４μｌから７．６μｌに及ぶＩＤｇ ｏで、７−次分離物の１以外の全てについて、９０％抑制より大を示した。

図７において、ＣＨＥ＃３０は、０．５２μ！ないし８．３０μｌのＩＤ、。で 、７−次分離物の５に対して９０％活性より大を示した。

図８は、ＣＨＥ＃３２についての中和活性を示す。グラフが示すように、ＣＨＥ ＃３２は、０．５２ｉから７，００μｌに及ぶＩＤｅ。

で、７−次分離物の５に対してＩＤＱ。活性を示した。

図９において、ＣＨＥ＃３５は、０，６０μｌから８．２μｌに及ぶＩＤ、。で 、７−次分離物の６を抑制した。

図１０に示されるように、６−次分離物のわずか３が、２．２μｌから１０μｌ に及ぶＩＤ、。で、ＣＨＥ＃３９により９０％以上抑制した。

図１１において、−次分離物の一つ以外の全てが、１．１０μ！ないし５．００ の間のＩＤ９０でＣＨＥ＃４１により９０％より大を抑　。

制した。

ＣＨＥ＃４４は、１，００μｌから５．１０μ右こ及ぶＩＤ、。で、図１２にお ける６−次分離物の３に対して９０％抑制より大を示した。

図１３において、ＣＨＥ＃４９は、０．６２μｌないし２，０５μｌのＩＤＱ。

で、９０％より大で全ての７−次分離物を抑制した。

Ｄ、シンシチウム抑制 細胞死への進行と共にシンシチウムの形成は、ＨＩＶで感染したインビボ細胞培 養の特徴的特徴である。シンシチウム形成は、ＣＤ４分化抗原を担う隣細胞とＨ ＩＶ−発現細胞との相互反応に依存する。シンンチウム抑制研究は、従って、特 殊ＣＨＥがその一次効果をＨＩＶエンベロープグリコプロプロン上に有するか、 或いは感染していない標的細胞上に有するから決定することで達成された。文献 に記載された標準方法に続いて、２つの細胞培養Ｍｏ１ｔＤＩＢ及びＨＰ　Ｂ　 Ａ　Ｌ　Ｌは感染した及び感染していない細胞らの起源としてそれぞれ適用され た。リフソン等、サイエンス２３２・１１２３−７（１９８６）・ソトリスキ等 、ネイチャー３２２：４７０−４（１９８６）：及びリフソン等、ネイチャー３ ２３ニア２５−８（１９８６）。

１０ＣＨＥの各々の異なる量（０，３μｍ、１．０μｌ、３．０μｌ）を感染Ｍ ｏ１ｔＩ［ＩＢ又は感染していないＨＰＢＡＬＬ細胞で標準時間別々にブレイン キュベートした。次いで細胞を数回洗い、２つの細胞型を培地に混合した。次い で両方法のパーセントシンシチウム抑制を混合後１８時間、光学顕微鏡により全 ＣＨＥについて評価した。

表■は研究した各ＣＨＥにより下されるシンシチウム抑制活性の予備的結果を表 示する。

表■☆ Ａ、ＣＨＥは感染していない細胞（ＨＰＢ−ＡＬＬ）をブレインキュベートした ＃１　＃８１２１　＄３０　＄３２　＃３５　＃３９　＃４１　；４４　＄４９ 　ｒｓＴ４３ｐｌ　９６．２９８．１３．７７０，９９３，６９８．１６７．９ ７７．４５０，９８６．１３２．１（３μｌ）１μｌ　６２．３２６．４１．９ ６２．３７４．７８３．０１５．１５８．５３５．８６２．３３５．８（ｂｌ） ０．３μＩ２８．３１５．１０　２８．３３７，７５８．５０　１６．９１５， ５５０．９０　（０，３ａＡ）Ｂ、ＣＨＥは感染細胞（ＨｏｌｔＩ［［Ｂ　）と ブレインキュベートした。

８１　＃８　＃２１　＃３０　＃３２　＃３５　＃３９　＃４１　＃４４　＃４ ９　ｒｓＴ４３ｕｌ　０２０．８　７．６４７．２７３．６２６．４３９．６５ ０．６９２．５７３．６９２．５（３μｌ）１、ｕｌ　Ｏ２６，４１３，２３９ ，６３７，２２０，８１６，９５０，９８８，７４７，２６２，３（ｌμＩ）０ ．３ｕｌ　０　９．４　０　１６．９３３．９　０　１８．３４３．４７７．４ ３２．１３５．８（０，３μｆｆ１）☆　上で表にした結果は１列の実験から得 た。

これらの実験は、上記結果の再現可能性（ｒｅｐｒｏｄｕｃａｂｌｉｔｙ）を確 めるために繰り返さなかった。

簡単に言えば、表■のセクションＡにおいて上で表にしたように、１０ＣＨＥの ４（＃１、＃８、＃３２及び＃３５）は、ＣＨＥを感染しない細胞とブレインキ ュベートしたときシンシチウム形成の９０％抑制より大を示した。しかしながら 一つだけ（＃４４）はＣＨＥを感染細胞をブレインキュベートしたとき、シンシ チウム形成の９０％抑制より大を示した。

付加実験は、この抗ＨＩＶ活性が細胞内で起きたＣＨＥにより生成したかどうか を決定することを実施した。この実験で、細胞は、コントロールとして逆転写酵 素抑制因子ＡＺＴを用い、ＣＨＥ添加前１時間感染した。図１４において、１０ μｌのＣＨＥ＃３２は、ＨＴＬＶ−Ｉ［ＩＢの両用量（５０ＴＣＩＤ５０及び１ ００ＴＣＩＤｓｏ）で予感染した細胞でのＨＩＶ複製の１００％抑制を示した。

この結果は、この活性についての正確な機構はまだ研究されているが、観察した インビトロ抗ＨＩＶ活性が正に細胞内で起きることを示すことが明らかである。

Ｅ９終点希釈培養 文献に記載されるように、終点希釈培養法を細胞が慢性的に感染したＨ９／Ｉ［ ［Ｂ細胞で抗ＨＩＶ効果を示したかを決定するのに用いた。ホ等、ＮＥＪＭ３２ １：１６２１−１６２５（１９８９）。図１５に示したように、１０μｌのＣＨ Ｅ＃２１は、ウィルス力価、１０倍減小を生じたが１μｌのＣＨＥ＃２１は、ウ ィルス力価変化を生じなかった。さらに１μｌのＣＨＥ＃３２はウィルス力価、 ２倍減小を生じ、一方、１０μｌは１０倍減小を生じ、１μｌのＣＨＥ＃４９は 、ウィルス力価２倍を減じ、１０μｌは１００倍減小となった。

従って、これらの結果は、図１４における予感染研究で得られた結果を増強する 、（細胞はＣＨＥ添加前１時間感染した）ここではＣＨＥの抗ＨＩＶ活性が正に 細胞内部で起きることが明らかであった。

しかしながら上で示したように、ＣＨＥ活性についての正確な機構はまだ研究中 である。

Ｆ、逆転写酵素アッセー ＨＩＶＩＩＩ−ＢＲＴ酵素は、既知の逆転写酵素（ＲＴ）生化学アッセーを用い て、分離し、異なる量の各ＣＨＥと混合した。ホ等、サイエンス２２６：４５１ −４５３（１９８４）；ポポヴイク等、プロシーディンゲス・ナショナル・アカ デミ−・オブ・サイエンス・ニーニス、エイ　７７：７４１５（１９８０）。

特に、ウィルス粒子は以下のように細胞フリー上清から沈澱した。

０．３肩ｌの４Ｍ塩化ナトリウムと３，６１Ａ’の３０％（重量部）ポリエチレ ングリコール（カーホワックス６０００）を８ｍＡ’の収集した培養液に加え、 懸濁液を一夜氷上に置いた。懸濁液を２０００回転／分で、４℃、３０分間遠心 分離した。沈澱を３００μｌの５０％（容量比）グリセロール（２５ｍＭトリス −ＨＣＬ　ｐＨ７，５，５ｍＭジチオスレイトール、１５ＱｍＭ塩化カリウム及 び０．０２５％トリトンＸ−１００）に再懸濁した。ウィルス粒子を１００μｌ の０．９％トリトンＸ−１００／１．５Ｍ塩化カリウム溶液の添加により分裂さ せた。

Ｈ９／ＨＩＶ１１１−Ｂの培養からの細胞フリーウィルス濃縮物を、０．１Ｍ塩 化ナトリウム及び１ｍＭＥＤＴＡ含有１０ｍＭ）リス−ＨＣＩＶ（ｐＨ７，４） 中の２０ないし６０％（重量比）ショ糖勾配上に重層した。Ｑ、７＋＋Ａ’のフ ラクションを勾配の底から集めた。４０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７，８）、４ ｍＭジチオスレイタール、４５ｍＭ塩化カリウム及び５０μｑの鋳型−プライマ ーポリ（Ａ）・ｄＴ、□−１８及びポリ（Ｃ）　・ｄＧ＋ｚ−＋ｓバーｍ１ＩＣ １０ｍＭ　Ｍｎ２　と共に）又は５０ｔ、ｔｌｌのポリ（ｄ、Ａ）　・ｄＴ＋ｚ −＋ａパーｌｌ（０、２５ｍＭ　Ｍｎ２　と共に）を含む１００μｌの最終容量 において、１０μｍ部分を３７℃で１時間ＲＴについてアッセーした。混合物は 、又、１５μＭの適当な標識化デオキシリボヌクレオチド三リン酸エステル、［ ３Ｈ］ｄＴＴＰ（１６Ｃｉ／田モル；ＩＣ１−３．７Ｘ１０”ベケレル（ｂｅｃ ｑｕｅｒｅｌ））又は［３Ｈ］ｄＧＴＰ（１２Ｃｉ／ｍモル）を含んだ。ＨＩＶ ｍ−ＢＲＴ活性の５０％及び９０％を抑制するのに必要な各ＣＨＥの量は、以下 の表Ｖ及び図１６に報告される。示されるように、結果は１０ＣＨＥの７が９０ ％ＲＴ抑制より大を示したことを示す。

表Ｖ ＣＨＥ　抗ＨＴＬＶ−Ｉ［［ＢＲＴ活性Ｉ　Ｄｓｏ（μｌ）　Ｉ　Ｄｏｏ（μｌ ）＃　１　０．５３　＞　１０．ＯＯ ＃８　２．４０　９．００ ３２１　３．７０　＞１０．００ ＃３０　１．６０　９．００ ＃３２　３．００　９．００ ＃３５　４．５０　＞１０．００ ８３９　３．３５　８．９０ ＃４１　１．２０　９．２０ ＃４４　１．９５　９．５０ ＃４９　１．１２　６．８０ Ｇ、ＣＨＥ＃３２及び＃４９を利用するエクスビボ実験、ベストモードＣＨＥ これらのインビボ抗ＨＩＶ活性を測定して、ＣＨＥのためのインビボ条件をでき るだけ密接に似ているように実験モデルを供給するためにエクスビボ実験を行な った。ホ等、ピー・エフ・エイ・ニス、８７・６５７４−６５７８（１９９０） 。これらの実験のために、ＣＨＥ＃３２及び＃４９を、これらが抗ＨＩＶ活性の ため１０ＣＨＨの中の主な候補者と考えられたので、利用した。これら２つの特 別、（ＣＨＥ）は実験データに基づいて選ばれた。しかしながら、ベストモード ＣＨＥとしてＣＨＥ：３２及び＃４９のこの選択は、将来の実験が１０ＣＨＥの 中に他のより有効な抗ＨＩＶ剤を認定しうるように、他の可能性を排除すること を意味しない。

血漿及びＰＢＭＮは３人の患者から得、以下のように示された。

Ａ、ＡＩＤＳの患者用、ＲＳ、ＡＲＣの患者用、モしてＨ１健康な患者用。

上で記載したように終点希釈培養法は、３人の患者のＰＭＢＮ及び血漿において ＨＩＶの系列定量に用いた。そして血清Ｐ２４コア抗原レベルは、ウィルス重荷 のマーカーとして測定した。図１７において、ＰＢＭＮにおけるＨＩＶ力価は最 上グラフ上に示され、血漿におけるＨＩＶ力価は最低グラフ上に示される。

ＨＩＶ−１は、全ての３患者のＰＢＭＮから、１０から１，０００ＴＣＩＤ／１ ０’細胞に及ぶ力価と３７０ＴＣＩＤ／１０６細胞の平均力価で、回収した。し かしながら１μｌのＣＨＥ＃３２を加えたとき、ＨＩＶ−１は１０から１００Ｔ ＣＩＤ／１０６細胞に及ふ力価に、ウィルス力価で１０倍減少に検出された。１ ０μｌのＣＨＥ＃３２を加えたとき、全患者におけるウィルス力価は、ＩＴＣＩ Ｄ／１０’細胞に減じた。一方、ＣＨＨの添加前、血漿における総ＨＩＶ−１力 価は１以下から１ＱＴｃＩ［／肩ｌに及び３．３ＴＣＩＤ／ｍＡ！の平均値てあ った。しかしながら１μｌ又は１０μｌのＣＨＥ＃３２はウィルス力価１以下な いしＩ　ＴＣＩ　０７重１に減小した。

図１８に示すように、Ｑ、１ｍＡのＣＨＥ＃４９で処理したＰＢＭＮでは、ＨＩ Ｖ力価は３７０ＴＣＩＤ／１０６の平均力価から１０ＴＣＩＤ／１０’細胞に減 じた。１μｌのＣＨＥ＃４９の添加はウィルス力価をさらに０．６７ＴＣＩＤ／ １０’細胞に減じた。しかしながら血漿においては、１μｌではＨＩＶ力価を１ ０倍濾したが、０゜１μｌのＣＨＥ＃４９はＨＩＶ力価で何ら変化を生じなかっ た。

これらの実験及び結果のデータは、ＣＨＥが感染宿主において潜在的インビボ抗 ＨＩＶ治療に対する貴重な源でありうることを示す。

示されるように、試験した５６ＣＨＥの１０が用量依存抗ＨＩＶ活性インヒドロ を示すことが判った。これらのＣＨＥの５（＃１、＃８、＃３２、＃３５及び＃ ４４）も実質的ンンシチウム抑制活性を示し、一方７ＣＨＥ（３８、＃３０、＃ ３２、＃３９、＃４１．４４及び＃４９）が逆転写酵素に対して抑制活性を示し た。最後にＣＨＥ　＃　３２及び＃４９は、患者血漿及びＰＢＭＨにおいてエク スビホ用量依存抗ＨＩＶ活性を示した。

ＨＩＶ−２の％中和 ＩＩＩ−Ｂの％中和 冗中和 ％中和 も ％中和 宅 ％中和 ％中和 ％ ％中和 ％中和 も ％中和 ％中和 〜 ８呂Ｓ　ｇ　ｇ口 ％中和 抑制％ 町 逆転写酵素の％抑制 Ｎ 免 要　約　書 すぐれたインビトロ及びエクスヒポ抗ＨＩＶ活性を示す１０の漢方薬草薬からの 抽出物並びにそれらのＨＩＶ及びＨＩＶ関連疾患の診断及び処置への使用。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成４年２月　１８日り留

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．宿主細胞を、サルビア・ミルティオルヒザからの抽出物を、ＨＩＶＰ２４抗 原の発現を抑制するのに有効である該抽出物の濃度で含む製薬製剤にさらすこと により、ＨＩＶで感染した宿主細胞におけるＨＩＶを抑制する方法。
2. ２．該抽出物が、活性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、その誘 導体及び上記の組合せからなる群から選択される請求項１の方法。
3. ３．宿主細胞をロニセラ・ジャポニカからの抽出物を、ＨＩＶ２４抗原の発現を 抑制するのに有効である該抽出物の濃度で含む製薬製剤にさらすことにより、Ｈ ＩＶで感染した宿主細胞におけるＨＩＶを抑制する方法。
4. ４．該抽出物が活性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、その誘導 体及び上記の組合せからなる群から選択される請求項３の方法。
5. ５．宿主細胞をスクテラリア・バイカレウシスからの抽出物をＨＩＶＰ２４抗原 の発現を抑制するのに有効である該抽出物の濃度で含む製薬製剤にさらすことに より、ＨＩＶで感染した宿主細胞におけるＨＩＶを抑制する方法。
6. ６．該抽出物が活性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、その誘導 体及び上記の組合せからなる群から選択される請求項５の方法。
7. ７．抽出物が、シンシティウム形成及び／又は逆転写酵素を抑制することにより 抗ＨＩＶ活性を示す漢方薬草医薬からの抽出物を、ＨＩＶを抑制するのに有効な 量、含む製薬製剤を宿主に投与することにより宿主におけるＨＩＶ及びＨＩＶ関 連疾患を処理する方法。
8. ８．該製薬製剤が許容されうる賦形剤と共に投与される請求項７の方法。
9. ９．該製薬製剤が非経口的に投与される請求項７の方法。
10. １０．該製薬製剤が静脈内に投与される請求項９の方法。
11. １１．該製薬製剤が筋肉内に投与される請求項９の方法。
12. １２．該製薬製剤が腹腔内に投与される請求項９の方法。
13. １３．該製薬製剤が皮下に投与される請求項９の方法。
14. １４．該製薬製剤が腸管経由で投与される請求項７の方法。
15. １５．該製薬製剤が経口的に投与される請求項１４の方法。
16. １６．該製薬製剤が直腸に投与される請求項１４の方法。
17. １７．該製薬製剤が付加的抗ウイルス剤、免疫修飾物質、化学療法剤、抗体又は その組合せの組合せで投与される請求項７の方法。
18. １８．該製薬製剤がコプティス・チネウシスの抽出物、又は活性成分、活性成分 の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を示す その組合せを含む請求項７の方法。
19. １９．該製薬製剤がリグステイタス・ワリチイの抽出物、又は活性成分、活性成 分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を示 すその組合せを含む請求項７の方法。
20. ２０．該製薬製剤がイリキウム・ランケオラツムの抽出物、又は活性成分、活性 成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を 示すその組合せを含む請求項７の方法。
21. ２１．該製薬製剤がイセティス・ティンクトリアの抽出物、又は活性成分、活性 成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を 示すその組合せを含む請求項７の方法。
22. ２２．該製薬製剤がサルビア・ミルティオルヒザの抽出物、又は活性成分、活性 成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を 示すその組合せを含む請求項７の方法。
23. ２３．該製薬製剤がエリシベ・オブツシフォリアの抽出物、又は活性成分、活性 成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を 示すその組合せを含む請求項７の方法。
24. ２４．該製薬製剤がアカントパナクス・グラシリアティクスの抽出物、又は活性 成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗Ｈ ＩＶ活性を示すその組合せを含む請求項７の方法。
25. ２５．該製薬製剤がボスタウルス・ ドメスティクスの抽出物、又は 活性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は 抗ＨＩＶ活性を示すその組合せを含む請求項７の方法。
26. ２６．該製薬製剤がイヌラ・ヘレニウムの抽出物、又は活性成分、活性成分の組 合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を示すその 組合せを含む請求項７の方法。
27. ２７．該製薬製剤がロニケラ・ジャポニカの抽出物、又は活性成分、活性成分の 組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を示すそ の組合せを含む請求項７の方法。
28. ２８．該製薬製剤がポリゴヌム・ビストルタの抽出物、又は活性成分、活性成分 の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性を示す その組合せを含む請求項７の方法。
29. ２９．該製薬製剤がスクテラリア・バイカレウシスの抽出物、又は活性成分、活 性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体、又は抗ＨＩＶ活性 を示すその組合せを含む請求項７の方法。
30. ３０．抗ＨＩＶ活性を有する漢方薬草医薬の抽出物を製薬上許容しうる賦形剤と 混合して含むメディウムを含む、宿主におけるＨＩＶ及びＨＩＶ関連疾患を予防 及び／又は処置するための注射目的用組成物。
31. ３１．該薬草抽出物がコプティス・キネウシスの抽出物、又は活性成分、活性成 分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含む請 求項３０の組成物。
32. ３２．該薬草抽出物がリグスティタス・ワリチイの抽出物、又は活性成分、活性 成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含む 請求項３０の組成物。
33. ３３．該薬草抽出物がイリキウム・ランケオラツムの抽出物、又は活性成分、活 性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含 む請求項３０の組成物。
34. ３４．該薬草抽出物がイサティス・ティンクトリアの抽出物、又は活性成分、活 性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含 む請求項３０の組成物。
35. ３５．該薬草抽出物がサルビア・ミルティオルヒザの抽出物、又は活性成分、活 性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含 む請求項３０の組成物。
36. ３６．該薬草抽出物がエリキベ・オブツシフォリアの抽出物、又は活性成分、活 性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含 む請求項３０の組成物。
37. ３７．該薬草抽出物がアカソソパナクス・グラシリアティクスの抽出物、又は活 性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその 組合せを含む請求項３０の組成物。
38. ３８．該薬草抽出物がボスタウルス・ドメスティクスの抽出物、又は活性成分、 活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを 含む請求項３０の組成物。
39. ３９．該薬草抽出物がイヌラ・ヘレニウムの抽出物、又は活性成分、活性成分の 組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含む請求項 ３０の組成物。
40. ４０．該薬草抽出物がロニケラ・ジャポニカの抽出物、又は活性成分、活性成分 の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含む請求 項３０の組成物。
41. ４１．該薬草抽出物がポリゴヌム・ビストルタの抽出物、又は活性成分、活性成 分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを含む請 求項３０の組成物。
42. ４２．該薬草抽出物がスクテラリア・バイカレウシスの抽出物、又は活性成分、 活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、該抽出物の誘導体又はその組合せを 含む請求項３０の組成物。
43. ４３．宿主におけるＨＩＶ関連感染の検出のためのアッセー方法であって、ＨＩ Ｖに感染の疑いのある宿主からの試験試料を漢方薬草医薬のみの又は標識に接合 した抽出物と接触させること試料中のＨＩＶの存在を測定することを含む。
44. ４４．試験試料が全血液、 リンパ液、血清、血漿、精液、唾液及び脳脊髄液からなる群から選択される請求 項４３のアッセー方法。
45. ４５．該抽出物がコプティス・キネウシス、リグスティウム・ワリチイ、イリキ ウム・ランケオラツム、イサティス・ティンクトリア、サルビア・ミルティオル ヒザ、エリキベ・オブツシフォリア、アカントパナクス・グラシリアティクス、 ボスタウルス・ドメスティクス、イヌラ・ヘレニウム、ロニケラ・ジャポニカ、 ポリゴヌム・ビストルタ及びスクテラリア・バイカレウシスの薬草の群から選択 される請求項４３のアッセー方法。
46. ４６．該抽出物が活性成分、活性成分の組合せ、生物学的メタボライト、その誘 導体、該抽出物の抗イデイオタイプ抗体及びその組合せからなる群からさらに選 択される請求項４３のアッセー方法。