KR100346609B1 - 금은화로부터세코노가노사이드를추출하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 금은화로부터 세코노가노사이드를 추출하는 방법에 관한 것으로, 금은화를 수성용매로 추출하여 얻어진 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 세코노가노사이드는 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

금은화로부터 세코노가노사이드를 추출하는 방법

본 발명은 금은화로부터 세코노가노사이드를 추출하는 방법에 관한 것으로,보다 상세하게는 금은화를 수성 용매로 추출, 정제하여 B형 간염 치료제로 유효한 세코노가노사이드를 얻는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 세계적으로 약 2억 5천 만명의 인구가 HBV에 감염되어 있다. B형 간염 바이러스는 전 세계적으로 다양하게 분포하나 국가별 발병율은 큰차이를 보이는데, 미국은 0.5%, 일본은 1.5%, 유럽은 1% 등으로 낮고 한국은 8%, 중국은 15%, 아프리카는 7% 정도의 높은 발병율을 보인다. 현재까지 한국 국민의 B형 간염 바이러스 보유율은 8% 정도인데, 이중 15 내지 20% 가 간경변증까지 진행되고 간경변증 환자의 20% 정도에서 간암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 추후 더 이상의 보균자가 발생하지 않더라도 70 만명의 간경변증 환자와 14 만명의 간암 환자가 발생할 것으로 추정된다(I. H. Hu et al.,월간약국 4월호, PP 54-59(1992)).

B형 간염 바이러스의 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95%는 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA 가 사람 간세포의 게놈 DNA 에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경병증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV 에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에 까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다(Don Ganem et al.,Ann, Rev, Biochem. 56, 651(1987); R.P. Beasley et at.,Lancet 2, 1129(1981); D. A. Shafritz et al.,New England J. Med. 305, 1067(1981); S.N. Zaman et al.,Lancet 1, 1357 (1985)).

지금까지 HBV 감염을 예방하기 위한 합은 백신들이 개발되었다. 이들 백신들은 면역원(Immunogen)으로서 B형 표면항원(HBs Ag)을 이용하는데, B형 표면항원은 B형 간염 바이러스에 감염된 보균자의 혈장으로부터 또는 유전공학 기법을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 표면 항원계 백신은 개체 감염을 방지하는데는 일반적으로 효과적이라 할 수 있지만 백신이 투여된 모든 개체에서 보호 수준의 항체가 형성되는 것은 아니다. 이들 항체의 형성정도는 투여되는 을의 연령 및 면역 시스템의 억제정도는 물론, 주사부위와 같은 요인들에 의해서 영향을 받으며, 또한 백신이 투여된 모든 사람은 과민반응을 일으킬 다소의 위험도 갖고 있다.

일단 HBV 에 감염된 환자의 경우는 적절한 치료제의 공급이 요구된다. 현재까지 B형 간염 치료제로서 몇가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없다. Ara-A가 지금까지 미국 FDA로 부터 승인받은 유일한 약으로, 임상시험에서는 유의할 만한 결과를 보여 주었으나 약물 자체가 갖는 독성 때문에 사용이 극히 제한적이며 인터페론과 병용치료하는 방법으로 사용된다. Ara-A의 부작용으로는 오심, 식욕부진, 설사, 구토 및 혈소판 감소등에 의한 가역적 골수억제 등이 알려져 있다(J. A. Payne et al.,Disease a Month, March, pp. 117-159(1988)). 한편, 아사이콜로비르(Acyclovir; 9-(2-히드록시 구아닌)나 인터페론의 경우, 투여시에는 B형 간염에 대해 다소의 치료효과를 보이기는 하지만 투여를 중지하면 투여전 상태로 다시 복귀하기 때문에 장기 투여를 하여야 하며, 이로 인해 심한 부작용을 초래한다는 문제점이 있다. 한편, 이외에도 포스포노포르메이트 (Phosponoformate: Foscarnet), 수라민(Suramin), 프로스타글란딘(Prostaglandin), 2-CDG(carbocyclic analogue of 2-deoxyguanosine), 팜사이크로비르(Famciclovir)등이 유망하다고 알려져 있기는 하지만 아직 많은 검증이 필요하다. 최근에 개발된 약제 가운데 약효 및 독성면에서 가장 유망하다고 알려진 FIAU(Fialuridine)의 경우 임상 Ⅱ 단계에서 예상치 못한 사망으로 인해 임상시험이 중단된 예도 있다.

지금까지 B형 간염 치료제로는 뉴클레오사이드 유사체들에 대한 연구가 주종을 이루었으나, 이들의 경우는 심한 부작용이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 한편, 뉴클레오사이드 유사체가 아닌 천연약재로부터 B형 간염 치료제를 개발하고자 하는 연구도 보고되어 었다. 인디안의 황달 치료제로 널리 알려진 필란써스 니루리 (Phyllanthys niruri)와 필란써스 아마루스(Phyllanthus amarus)라는 약용식물의 추출물이 동물실험에서 B형 간염 바이러스의 억제에 매우 효과적인 것으로 보고되었으며 현재 유효성분 분석과 임상시험중에 있다(P.S. Venkateswaren et al.,Proc. Natl, Acad. Sci, 84, 274(1987); Blumberg et at.,Vaccine 8, 274(1990)).

한편, 금은화는 인동화, 은화 또는 이화 등의 여러가지로 호칭되기도 하는데, 인동과에 속하며 학명은 루니세라 자포니아 썬베르그(Lunicera japonia Thunberg)로 알려져 있다. 금은화는 오래전부터 민간요법이나 한방에서 청열해독약으로 널리 사용되어 왔으며, 이의 추출물 및 일부 유효성분들은 항인플루엔자 바이러스작용, 항균작용, 항진균작용, 항염 작용 및 해열작용 등의 여러가지 약리작용을 지니고 있어 각종 질병의 치료에 다양하게 응용되고 있다(한국 유용식물자원 연구 총람, 한국화학연구소, pp 201-204(1988);한방 임상응용, 성보사, pp 140-142(1982)). 물론, 상기의 여러가지 보고들에 있어서도 금은화와 B형 간염 바이러스와의 직접적인 관련성에 대해서는 지금까지 전혀 연구된 바 없다.

이에 본 발명자들은, 천연 약재로부터 B형 간염 치료제를 찾고자 노력하던 중 금은화의 수성 추출물 및 그로부터 분리된 단일성분 화합물인 하기 구조식의 세코노가노사이드(seconoganoside)가 유효 활성 성분임을 확인하게 되었다.

세코노가노사이드(seconoganoside)는 세코이리도이드 글루코사이드 (secoiridoid glucoside) 계통의 물질로서, 루니세라 페리클리메눔(Lunicera periclymenum) 이나 루니세라 에트루스카(Lunicera etrusca) 등 루니세라 속의 식물로부터 분리, 정제되어 그 구조가 확인되었는데, 혈압강하작용, 진정작용, 해열작용, 강장작용 등 여러가지 약리활성을 나타내며, 또한 알칼로이드의 생합성에 관여하는 것으로 보고되었다 (I. Calis et al.,Phytochemistry,23, 2539(1984); A Basaran et al.,Fitoterapia,LIX: 389-392(1988)). 그러나, 금은화속에 이러한 물질이 존재한다거나 또는 이러한 물질과 B형 간염 바이러스의 관련성에 대해서는 전혀 연구된 바 없다.

본 발명의 목적은, 금은화로부터 B형 간염 치료에 유효한 세코노가노사이드를 추출 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은, 금은화를 수성용매로 추출하여 얻어진 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 세코노가노사이드에 해방하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(1) 금은화 추출물의 제조

금은화 10 내지 40g에 증류수 100㎖를 넣고 약 60 내지 90℃ 에서 12 내지 48 시간 중탕하여 금은화 수성 추출액을 얻는다. 바람직하게는 80℃ 에서 24 시간 동안 유지한다. 얻어진 수성 추출액은 단일성분을 분리하기 위한 다음 공정에 들어가기전에 원심분리 등의 공지의 방법으로 여러 불순물을 제거하는 것이 필요하다.

(2) 금은화 추출물의 분리 및 정제

불순물이 제거된 금은화의 수성 추출액을 소수성 페닐 세파로즈 크로마토그래피를 수행하여 먼저 3개의 그룹으로 나눈다. 이 때 소수성 페닐 세파로즈 컬럼의 용출속도는 5 ml/분으로 하고 용출액은 0.1 % 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴:증류수 (10:90) (v/v) 을 사용한다.

상기 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피의 결과로 얻은 제 1 그룹을 수집용 역상 고압액체크로마토그래피를 수행하면 약 15개 정도의 피크로 분리된다. C18 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물 (9:91)(v/v) 을 사용하여 등용매 용출시킨 후, 각각의 피크별로 분획을 모아서 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 조사한다. 그 결과, 54 분대 피크가 B형 간염 표면항원 생성에 강한 억제효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌는데, 이 성분은 NMR 및 MASS 구조분석 결과 세코노가노사이드임이 확인되었고 B형 간염에 대한 효과도 입증되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이로서 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 금은화로부터 추출 정제한 성분의 B형 간염 표면 항원에 대한 억제 정도는 다음 방법에 의해 평가한다.

B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도 분석

금은화 추출물로부터 얻은 샘플이 처리된 세포 배양액을 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbott lab., #1980-24)를 이용하여 B형 표면항원 생성에 대한 억제정도를 정량적으로 분석한다.

세포 배양액을 인산염 완충 생리 식염수(pH 7.0)로 최종 흡광도가 1.0 내지 1.5 범위에 들도록 희석 (대략 20 내지 50배 희석 )한 후, 희석액 0.2㎖과 대조용액 0.2㎖을 표면항원에 대한 1차 단일항체, HRP(Horse Radish Peroxidase)가 연결된 2차 단일항체가 이미 결합되어 있는 비드와 40℃에서 2시간 동안 각각 반응시킨 후, 비드를 증류수로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에 과산화수소수가 함유된 0-페닐렌디아민(0-phenylenediamine) 용액 300 ㎕을 가하고 30분 배양한 후 0.1N HCl 을 가하여 반응을 중지시켰다. 대조군과 실험군의 흡광도를 492 nm에서 측정하고, 하기 식을 이용하여 B형 간염 표면 항원 생성 억제 정도를 계산한다.

실시예

단계 1: 금은화 추출물의 제조

힌약재인 금은화 120g에 증류수 600㎖을 넣고 교반시키면서 80 ℃에서 24 시간 동안 가열하였다. 이렇게 얻은 금은화 추출액을 8,500 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전은 제거하고 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 한외 여과막(whatman, #1)으로 여과하여 잔여 불용성 물질이 완전히 제거된 금은화의 수성 추출물을 얻었다. 이것을 감압하 70 ℃ 에서 증발시켜 금은화 추출물 19 g을 수득하였다.

단계 2. 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피

상기 단계 1에서 얻은 금은화 추출물 2 g을 증류수 100 ml에 녹인 후, 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴;증류수(10:90) (v/v)로 미리 평형을 맞춘 소수성 페닐세파로즈 컬럼(5 cm ×3O cm, Pharmacia, U. S. A.)에 흡착시킨 다음, 동일한 용출액을 사용하여 5 ml/분의 속도로 용출시켰다. 용출개시부터 16개의 분획 (180 ml)을 모아 제 1 그룹으로, 17번부터 22번까지의 분획 (30 ml)을 모아 제 2 그룹으로 분류한 후, 각 그룹을 감압하에 증발시켜 각각 1.3 g 및 0.1 g을 얻었다.

이렇게 하여 얻은 제 1 및 2 그룹을 1.0 mg/ml 의 농도로 만들어 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 조사하여 그 결과를 아래 [표 1] 에 나타내었다.

[표 1]에서 보듯이, 금은화의 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피 결과 분리된 제 1 그룹이 억제효과가 좋았기 때문에 제 1 그룹을 우선적으로 선택하였다.

상기 단계 1 및 2에서 얻은 각 샘플을 μ-Bondapack Cl8 컬럼 (3.9 mm ×390 mm, Waters, U. S. A.)을 사용하여 분석용 역상 고압액체 크로마토그래피를 실시하였다. 평형완충용액은 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (10:90) (v/v)를 사용하였으며 20분 동안 상기 아세토니트릴:증류수 (70:30) (v/v)로 선형구배를 만들어 1.2 ml/분의 속도로 용출시킨다. 시간에 따른 완충용액의 조성은 다음과 같다. A 및 B는 각각 HPLC의 A 및 B 펌프를 가리킨다.

제 1도는 상기 단계 1에서 얻은 샘플을 분석용 역상 HPLC 로 분석한 결과로, 여기에서 보면, 금은화의 수성 추출물은 역상 HPLC 상에서 약 25개 정도의 피크로 분리됨을 알 수 있다.

제 2 도는 상기 단계 2에서 얻은 제 1 그룹을 분석용 역상 HPLC로 분석한 결과로, 여기에서 보면, 금은화의 수성 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피로 분리한 제 1 그룹은 역상 HPLC 상에서 약 10분 대까지의 피크를 모은 것임을 알 수 있다.

이와 같이, 역상 HPLC 상에서 각 피크들이 서로 잘 분리되므로 다음 단계인 수집용 역상 HPLC 를 실시한다.

단계 3. 수집용 역상 고압액체 크로마토그래피

상기 단계 2 에서 얻은 제 1 그룹을 가지고 수집용 역상 HPLC를 수행하였는데, μ-BondaPack C18 컬럼 (30 mm ×300 mm, Waters, U. S. A.)을 사용하여 다음 프로그램에서 등용매 용출하여 각 피크들을 분리, 수집하였다. 이 때의 등용매 용출액으로는 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (9:91) (v/v)를 사용하였고, 용출 속도는 18 ㎖/min, 흡광도는 254 nm에서 측정하였다.

제 3 도는 단계 2에서 얻은 제 1 그룹의 수집용 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발시켜 건조시킨 후, 0.9 mg/㎖의 농도에서 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 분석하여 [표 2] 에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, 수집용 역상 HPLC를 수행시 1, 3 및 7번 피크의 성분에서 B형 간염 표면항원 생성에 대한 억제효과가 높은것을 알 수 있다. 그러나 1번 성분은 강한 세포독성 때문에 제외하고 7번 피크의 성분을 수집하여 NMR 및 MASS를 이용한 구조분석을 시행하였다.

NMR 및 FAB MASS 구조분석

수집용 역상 HPLC의 7번 피크의 성분을¹H NMR,¹³C NMR 및 FAB MASS 구조 분석한 결과, 상기 성분은 단일성분으로서 세코노가노사이드임이 확인 되었다.

제 4 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 5 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 6 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의 FAH MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

상기와 같이 금은화로부터 추출되어 단일 성분으로 분리, 정제되고 NMR 및MASS 구조분석으로 확인된 세코노가노사이드는 2 mM 농도에서 B형 간염 표면항원에 대하여 60 %의 억제효과를 나타내었다.

이상 설명한 바와 같이, 금은화로부터 수성 용매로 추출하고 소수성 페닐세파로즈 및 수집용 역상 HPLC로 분리 정제한 세코노가노 사이드는 B형 간염 표면항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

제 1 도는 금은화 수용성 추출물의 분석용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내며,

제 2 도는 금은화 수용성 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피로 분리한 제 1 그룹의 분석용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내고,

제 3도는 금은화 수용성 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그래피로 분리한 제 1 그룹의 수집용 역상 HPLC 분석결과를 나타내고,

제 4 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 5 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 6 도는 수집용 역상 HPLC 7번 피크 성분의 FAB MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

Claims (4)

1. 금은화를 물로 추출하여 얻어진 추출물을 소수성 페닐세파로즈 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그라피를 수행하여 세코노가노사이드에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 하는, 금은화로부터 세코노가노사이드를 추출하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 금은화 추출물이 금은화를 물로 60 내지 90 ℃에서 12 내지 48시간 동안 물중탕 추출하여 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   상기 소수성 페닐세파로즈 크로마토그라피 수행시, 10 %(v/v) 아세토니트릴로 용출하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   수집용 역상 크로마토그라피 수행시 Cl8 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물 (9:91)(v/v)을 사용하여 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.