KR100346614B1 - 나트륨치환트립토판을포함하는비형간염치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나트륨 치환 트립토판을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물에 관한 것으로, 나트륨 치환 트립토판은 B형 간염 표면항원 생성에 대하여 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나트륨 치환 트립토판을 포함하는 B형 간염 치료제

본 발명은 나트륨 치환 트립토판을 포함하는 B형 간염 치료제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생강을 수성 용매로 추출하고 정제하여 얻은 나트륨 치환형태의 트립토판을 포함하는 B형 간염 치료제에 관한 것이다. B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 세계적으로 약 2억 5천 만명 의 인구가 HBV에 감염되어 있다. B형 간염 바이러스는 전 세계적으로 다양하게 분포하나 국가별 발병율은 큰차이를 보이는데, 미국은 0.5%, 일본은 1.5%, 유럽은 1% 등으로 낮고 한국은 8%, 중국은 15%, 아프리카는 7% 정도의 높은 발병율을 보인다. 현재까지 한국 국민의 B형 간염 바이러스 보유율은 8% 정도인데, 이 중 15 내지 20%가 간경변증까지 진행되고 간경변증 환자의 20% 정도에서 간암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 추후 더 이상의 보균자가 발생하지 않더라도 70만명의 간경변증 환자와 14 만명의 간암 환자가 발생할 것으로 추정된다(I. H. Hu et al.,월간약국 4월호, PP 54-59(1992)).

B형 간염 바이러스의 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95%는 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA 가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경병증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성 간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에 까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다(Don Ganem et al.,Ann. Rev. Biochem. 56, 651(1987); R.P. Beasley et at.,Lancet 2,1129(1981); D. A Shafritz el al.,New England J. Med. 305,1067(1981); S.N. Zaman et al.,Lancet 1, 1357(1985)).

지금까지 HBV 감염을 예방하기 위한 많은 백신들이 개발되었다. 이들 백신들은 면역원(Immunogen)으로서 B형 표면항원(HBs Ag)을 이용하는데, B형 표면항원은 B형 간염 바이러스에 감염된 보균자의 혈장으로부터 또는 유전공학 기법을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 표면 항원계 백신은 개체 감염을 방지하는데는 일반적으로 효과적이라 할 수 있지만 백신이 투여된 모든 개체에서 보호 수준의 항체가 형성되는 것은 아니다. 이들 항체의 형성정도는 투여되는 을의 연령 및 면역 시스템의 억제정도는 물론, 주사부위와 같은 요인들에 의해서 영향을 받으며, 또한 백신이 투여된 모든 사람은 과민반응을 일으킬 다소의 위험도 갖고 있다.

일반 HBV에 감염된 환자의 경우는 적절한 치료제의 공급이 요구된다. 현재까지 B형 간염 치료제로서 몇가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없다. Ara-A가 지금까지 미국 FDA로 부터 승인받은 유일한 약으로, 임상시험에서는 유의할 만한 결과를 보여 주었으나 약물 자체가 갖는 독성 때문에사용이 극히 제한적이며 인터페론과 병용치료하는 방법으로 사용된다. Ara-A의 부작용으로는 오심, 식욕부진, 설사, 구토 및 혈소판 감소등에 의한 가역적 골수억제 등이 알려져 있다(J. A. Payne et al.,Disease a Month, March, pp. 117-159(1988)). 한편, 아사이클로비르(Acyclovir; 9-(2-히드록시 구아닌)나 인터페론의 경우, 투여시에는 B형 간염에 대해 다소의 치료효과를 보이기는 하지만 투여를 중지하면 투여전 상태로 다시 복귀하기 때문에 장기 투여를 하여야 하며, 이로 인해 심한 부작용을 초래한다는 문제점이 있다. 한편, 이외에도 포스포노포르메이트(Phosphonoformate; Foscarnet), 수라민(Suramin), 프로스타글란딘(Prostaglandin), 2-CDG(carbocyclic analogue of 2-deoxyguanosine), 팜사이크로비르(Famciclovir)등이 유망하다고 알려져 있기는 하지만 아직 많은 검증이 필요하다. 최근에 개발된 약제 가운데 약효 및 독성면에서 가장 유망하다고 알려진 FIAU(Fialuridine)의 경우 임상 II 단계에서 예상치 못한 사망으로 인해 임상시험이 중단된 예도 있다.

지금까지 B형 간염 치료제로는 뉴클레오사이드 유사체들에 대한 연구가 주종을 이루었으나, 이들의 경우는 심한 부작용이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 한편, 뉴클레오사이드 유사체가 아닌 천연약재로부터 B형 간염 치료제를 개발하고자 하는 연구도 보고되어 있다. 인디안의 황달 치료제로 널리 알려진 필란써스 니루리(Phyllanthus niruri)와 필란써스 아마루스(Phyllanthus amarus)라는 약용식물의 추출물이 동물실험에서 B형 간염 바이러스의 억제에 매우 효과적인 것으로 보고되었으며 현재 유효성분 분석과 임상시험중에 있다(P. S. Venkateswaren et al.,Proc. Natl. Acad Sci. 84,274(1987); Blumberg et al.,Vaccine 8,274(1990)).

본 발명자들은, 만성 간염의 70 % 이상이 B형 간염 바이러스에 기인한다는 사실에 기초하여 천연 약재로부터 B형 간염 치료제를 찾고자 노력하던 중, 약용 및 식용으로 널리 사용되는 생강의 수성 추출물이 B형 간염 바이러스의 생성을 강하게 억제한다는 사실을 발견하게 되었다. 이에 더 나아가 생강의 수성 추출물로부터 나트륨 치환 형태의 트립토판을 단일 성분 화합물로 분리하게 되었다.

생강과(Zingiberaceae)에 속하는 다년초인 생강(Zingibera officinaleRoscoe)의 뿌리줄기는, 오래전부터 고유한 민간 처방 및 한방에서 널리 사용되는 식용 약재로 그 용도가 매우 다양하다. 한방에서는 페경, 비경, 위경에 작용하는 것으로 알려져 있으며, 그의 즙은 건위작용을 나타내며 위점막을 자극하여 반사적으로 혈압을 높이고 항균작용을 나타낸다(천연약물 대사전 vol.2, pp 189-191). 근경에서 얻어진 유콘(UKON)이라는 추출물은 사염화탄소로 인한 간손상을 방지하며, 그 추출물을 분리, 정제하여 얻은 쿠르쿠미노이드(curcuminoid)는 항 간세포 독성(anti-hepatoxic)을 나타내며, 이의 대사산물은 페루릭산(fefulic acid), p-쿠마릭산(p-coumaric acid)과 함께 간손상의 회복에 효과적인 것으로 보고된 바 있다(Y. Kiso et al.,Planta Med. 49,185(1983)). 그러나, 상기의 여러 보고들은 한방치료적인 측면에서 생강이 간을 보호하는 효과가 있다는 사실을 규명했을 뿐, 유효성분 분석이라든가 B형 간염 바이러스와의 직접적인 관련성에 대해서는 지금까지 전혀 연구된 바 없다.

트립토판(tryptophan)은 필수 아미노산으로서, 영양제의 한 성분으로 많이사용되어 왔으나, 트립토판 자체가 약리 작용이 있는가의 여부에 대해서는 전혀 연구된 바 없다. 단지, 트립토판이 들어 있는 여러가지 아미노산 혼합물이 간염이나 간경화에 효과가 있다는 몇가지 보고가 있었다(H Dietl et al., Ger. Offen., 2,636,828(1978); 2,530,246(1977)). 그러나, 이러한 연구 결과는 아미노산 혼합물이 영양제로서 간기능을 활성화시킬 수 있다는 보고일 뿐이며, 특히 트립토판 자체와 B형 간염 바이러스와의 상관관계에 대해서는 전혀 연구된 바 없다. 즉, 트립토판이 필수 아미노산의 수준에서 영양제로서의 역할을 하는 것은 이미 많은 연구가 되어 있으나, 나트륨 치환 형태의 트립토판에 대해서는 잘 알려져 있지 않으며, 특히 B형 간염 바이러스의 관련성에 대해서는 전혀 연구된 바가 없는 것이다.

따라서, 본 발명에서는 생강의 수성 추출물로부터 분리된 나트륨 치환 트립토판이 B형 간염 바이러스의 생성에 대하여 강한 억제효과가 있음을 밝히고, 이를 포함하는 B형 간염 치료에 유용한 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 나트륨 치환 트립토판 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물이 제공된다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

나트륨 치환 트립토판을 B형 간염 바이러스를 생성하는 세포주에 적당량 처리하고 일정 시간 배양한 후 세포 배양액을 수집하여 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정 도를 분석 하면, 나트륨 치환 트립토판이 B형 간염 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다. 이 때 나트륨 치환 트립토판은 천연 약제에서 유래된 것이거나 또는 화학적 합성물도 사용될 수 있다.

표면항원에 대한 억제 정도는, 예를 들어 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbott lab., #1980-24)를 이용하여 정량적으로 분석할 수 있다.

상기 실험 결과, 나트륨 치환 트립토판이 B형 간염 표면항원에 대하여 강한 억제효과를 갖는다는 것이 밝혀져, 이를 B형 간염 치료제로서 효과적으로 사용할 수 있음을 확인할 수 있었다.

생강은 예로부터 한방에서 탕제로 사용되어 왔을 뿐 아니라 동서양을 막론하고 식용으로 사용된다는 점으로 보아, 그 수성 추출물에 독성의 가능성은 없는 것으로 사료되며, 따라서 이로부터 분리 정제된 나트륨 치환 트립토판에 대해서도 독성의 가능성은 없을 것이다.

본 발명의 B형 간염 치료제 조성물은, 나트륨 치환 트립토판을 활성 성분으로서 포함하며, 그 밖에 담체, 희석제, 충전제, 응집 방지제, 윤활제, 향미제 등 약제학적으로 허용되는 통상의 부형제를 첨가하여 공지의 방법에 따라 경구제, 피하주사제, 정맥주사제 등의 약제학적 제제로 제조될 수 있다. 상기 B형 간염 치료제는 정맥 또는 근육 내 투여 할 수 있으며, 일일 투여량은 나트륨 치환 트립토판으로서 5 내지 15mg/체중kg, 바람직하게는 5 mg/체중kg의 양으로 사용할 수 있는데, 환자의 증상, 나이, 성별 등 여러가지 조건에 따라 조절 가능하다.

이하 본 발명을 실시예에 의거 하여 보다 상세하게 설명한다.

단, 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이로서 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 생강으로부터 추출 정제한나트륨 치환 트립토판을 사용하였다.

실시예

1. 세포 배양 및 나트륨 치환 트립토판의 처리

B형 간염 바이러스를 생성하는 세포주인 2. 2. 15(M. A. Shells et al.,Proc. Natl. Acad. Sci.,USA,841005(1987)) 세포를 T 75 플라스크에서 10 % FBS (Fetus Bovine Serum, GIBCO, # 16000-028), 1 %의 ABAM(Antibiotic-Antimycotic, GIBCO BRL, # 15240-013) 및 최종농도 400 ㎍/ml의 제네티신(Geneticin, Sigma # G-9516)을 첨가한 IMDM 배지(GIBCO, # 430-2200)로 5일 동안 배양한 후, 24공 마이크로 플레이트의 각 공에 1.0 내지 1.5 × 15⁵세포/ml 를 분주하여 5 % CO 배양기에서 1 내지 2 시간 정도 배양하였다. 세포가 바닥에 붙은 후에 표준품으로서 Ara-AMP, 대조군으로서 트립토판, 및 정제 샘플인 나트륨 치환 트립토판을 10ⁿ씩 연속 희석하여 각 공당 0.1 ml 씩 처리하였다. 각 검체당 3회의 반복수를 유지하여 실험 오차를 최대로 줄이고자 하였다. 처리후 6 내지 8 일째에 배양액을 수집하였다.

2. B형 간염 표면항원에 대한 억제정도 분석

상기로부터 얻은 세포 배양액을 가지고 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbott lab., # 1980-24)를 이용하여, 나트륨 치환 트립토판의 B형 표면항원 생성에 대한 억제정도를 정량적으로 분석하였다.

세포 배양액을 인산염 완충 생리 식염수(pH 7.0)로 최종 흡광도가 1.0 내지 1.5 범위에 들도록 희석(대략 20 내지 50배 희석)한 후, 희석액 0.2 ㎖과 샘플을처리하지 않은 대조군 용액 0.2㎖을 표면항원에 대한 1차 단일항체, HRP(Horse Radish Peroxidase)가 연결된 2차 단일 항체가 이미 결합되어 있는 비드와 40℃에서 2시간 동안 각각 반응시킨 후, 비드를 증류수로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에 과산화수소수가 함유된 0-페닐렌디아민(0-phenylenediamine) 용액 300㎕을 가하고 30분 배양한 후 0.1N HCl 을 가하여 반응을 중지 시켰다.

대조군과 실험군의 흡광도를 492 nm에서 측정하고, 하기 식을 이용하여 B형 간염 표면항원 생성 억제 정도를 계산하였다.

이 때, 대조군의 흡광도는 1.159 이었으며, 나트륨 치환 트립토판, 구입 트립토판 및 Ara-AMP의 농도에 따른 흡광도 및 그로부터 계산된 B형 간염 표면항원 생성 억제 정도를 아래 [표 1] 에 나타내었다.

상기 표에서 보듯이, 나트륨 치환 트립토판은 0.1mM의 농도에서 표준품인 Ara-AMP에 비하여 다소 떨어지기는 하지만, B형 간염 표면항원에 대하여 약 21 %의억제효과를 나타내는 것을 알 수 있다.

이에 비하여 구입 트립토판은 거의 억제효과를 나타내지 않았다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 나트륨 치환 트립토판은 B형 간염 표면항원의 생성을 강하게 억제하므로 B형 간염 치료제로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (1)

1. 나트륨 치환 트립토판 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 B형 간염 치료제 조성물.