KR100339163B1 - 생강으로부터나트륨치환트립토판을추출하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 생강으로부터 나트륨 치환형태의 트립토판을 추출하는 방법에 관한 것으로, 생강를 수성용매로 추출하고, 이어서 수집용 역상 고압액체크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 수집한 나트륨 치환 트립토판은 B형 간염 표면 항원 생성에 대할 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생강으로부터 나트륨 치환 트립토판을 추출하는 방법

본 발명은 생강으로부터 나트륨 치환 트립토판을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 생강을 수성 용매로 추출하고 정제하여 B형 간염 치료제로서 유용한 나트륨 치환형태의 트립판을 얻는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대(Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 세계적으로 약 2억5천 만명의 인구가 HBV에 감염되어 있다. B형 간염 바이러스는 전세계적으로 다양하게 분포하나 국가별 발병율은 큰차이를 보이는데, 미국은 0.5%, 일본은 1.5%, 유럽은 1% 등으로 낮고 한국은 8%, 중국은 15%, 아프리카는 7% 정도의 높은 발병율을 보인다. 현재까지 한국 국민의 B형 간염 바이러스 보유율은 8% 정도인데, 이중 15 내지 20% 가 간경변증까지 진행되고 간경변증 환자의 20% 정도에서 간암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 추후 더 이상의 보균자가 발생하지 않더라도 70만명의 간경변증 환자와 14 만명의 간암 환자가 발생할 것으로 추정된다(I. H. Hu et al.,월간약국4월호, PP 54-59(1992)).

B형 간염 바이러스의 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90내지 95%는 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA 가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경병증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에 까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다(Don Ganem et al.,Ann. Rev. Biochem. 56, 651(1987); R.P. Beasley et al.,Lancet 2, 1129(1981); D, A. Shafritz et al.,New England J. Med. 305,1067(1981); S.N. Zaman et al.,Lancet 1,1357(1985)),

지금까지 HBV 감염을 예방하기 위한 많은 백신들이 개발되었다. 이들 백신들은 면역원(Immunogen)으로서 B형 표면항원(HBs Ag)을 이용하는데, B형 표면항원은B형 간염 바이러스에 감염된 보균자의 혈장으로부터 또는 유전공학 기법을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 표면 항원계 백신은 개체 감염을 방지하는데는 일반적으로 효과적이라 할 수 있지만 백신이 투여된 모든 개체에서 보호 수준의 항체가 형성되는 것은 아니다. 이들 항체의 형성정도는 주여되는 을의 연령 및 면역 시스템의 억제정도는 물론, 주사부위와 같은 요인들에 의해서 영향을 받으며, 또한 백신이 투여된 모든 사람은 과민반응을 일으킬 다소의 위험도 갖고 있다.

일단 HBV 에 감염된 환자의 경우는 적절한 치료제의 공급이 요구된다. 현재까지 B형 간염 치료제로서 몇가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없다. Ara-A가 지금까지 미국 FDA 로 부터 승인받은 유일한 약으로, 임상시험에서는 유의할 만한 결과를 보여 주었으나 약물 자체가 갖는 독성 때문에 사용이 극히 제한적이며 인터페론과 병용치료하는 방법으로 사용된다. Ara-A의 부작용으로는 오심, 식욕부진, 설사, 구토 및 혈소판 감소등에 의한 가역적 골수억제 등이 알려져 있다(J. A. Payne et al.,Disease a Month,March, pp. 117-159(1988)). 한편, 아사이클로비르(Acyclovir; 9-(2-히드록시 구아닌)나 인터페론의 경우, 투여시에는 B형 간염에 대해 다소의 치료효과를 보이기는 하지만 투여를 중지하면 투여전 상태로 다시 복귀 하기 때문에 장기 투여를 하여야 하며, 이로 인해 심한 부작용을 초래한다는 문제점이 있다. 한편, 이외에도 포스포노포르메이트(Phosphono-formate; Foscarnet), 수라민 (Suramin), 프로스타글란딘(Prostaglandin), 2-CDG(carbocyclic analogue of 2-deoxyguanosine), 팜사이크로비르 (Famciclovir) 등이 유망하다고 알려져 있기는 하지만 아직 많은 검증이 필요하다. 최근에 개발된 약제 가운데 약효 및 독성면에서 가장 유망하다고 알려진 FIAU(Fialuridine)의 경우 임상 II 단계에서 예상치 못한 사망으로 인해 임상시험이 중단된 예도 있다.

지금까지 B형 간염 치료제로는 뉴클레오사이드 유사체들에 대한 연구가 주종을 이루었으나, 이들의 경우는 심한 부작용이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 한편, 뉴클레오사이드 유사체가 아닌 천연약재로부터 B형 간염 치료제를 개발하고자 하는 연구도 보고되어 있다. 인디안의 황달 치료제로 널리 알려진 필란써스 니루리(Phyllanthus niruri)와 필란써스 아마루스(Phyllanthus amarus)라는 약용식물의 추출물이 동물실험에서 B형 간염 바이러스의 억제에 매우 효과적인 것으로 보고되었으며 현재 유효성분 분석과 임상시험중에 있다(P. S. Venkateswaren et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 84,274(1987); Blumberg et al.,Vaccine 8,274(1990)).

한편, 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 다년초인 생강(Zingibera officinaleRoscoe)의 뿌리줄기는, 오래전부터 고유한 민간 처방 및 한방에서 널리 사용되는 식용 약재로 그 용도가 매우 다양하다. 한방에서는 페경, 비경, 위경에 작용하는 것으로 알려져 있으며, 그의 즙은 건위작용을 나타내며 위점막을 자극하여 반사적으로 혈압을 높이고 항균작용을 나타낸다 (천연약물 대사전 vo1.2, pp 189-191). 근경에서 얻어진 유콘(UKON)이라는 추출물은 사염화탄소로 인한 간손상을 방지하며, 그 추출물을 분리, 정제하여 얻은 쿠르쿠미노이드(curcuminoid)는 항 간세포독성(anthi-hepatoxic)을 나타내며, 이의 대사산물은 페루릭산(ferulic acid), p-쿠마릭산(p-cumaric acid)과 함께 간손상의 회복에 효과적인 것으로 보고된 바 있다(Y. Kiso et at.,Planta Med. 49.185(1983)). 그러나, 상기의 여러 보고들은 한방치료적인 측면에서 생강이 간을 보호하는 효과가 있다는 사실을 규명했을 뿐, 유효성분 분석 이라든가 B형 간염 바이러스와의 직접적인 관련성에 대해서는 지금까지 전혀 연구된 바 없다.

이에 본 발명자들은, 만성 간염의 70 % 이상이 B형 간염 바이러스에 기인한다는 사실에 기초하여, 천연 약재로부터 B형 간염 치료제를 찾고자 노력하던 중 생강의 수성 추출물 및 그로부터 분리된 단일성분 화합물인 나트륨 치환형태의 트립토판(tryptophan)이 B형 간염 표면항원을 강하게 억제하는 유효 활성성분임을 확인하게 되었다. 트립토판이 필수 아미노산의 수준에서 영양제로서의 역할을 하는 것은 이미 많은 연구가 되어 있으나, 나트륨 치환 형태의 트립토판에 대해서는 전혀 연구된 바가 없다.

본 발명의 목적은, 생강으로부터 B형 간염 치료에 유효한 나트륨 치환형태의 트립토핀을 추출 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은, 생강을 수성용매로 추출하고, 이어서 수집용 역상 고압액체크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 나트륨 치환형태의 트립토판에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(1) 생강 추출물의 제조

생강에 증류수를 넣고 물중탕하여 생강의 수성 추출물을 얻는다. 이 때, 증류수 약 100 ml 에 대하여 생강 약 10 내지 50 g의 비율로 하고, 물중탕 온도 약60내지 90℃에서 1 내지 3 시간 유지하여 생강의 수용성 성분을 추출한다. 바람직하게는 80℃ 에서 2 시간 동안 유지한다. 얻어진 수성 추출액은 단일성분을 분리하기 위한 다음 공정에 들어가기 전에 원심분리 및 여과 등 공지의 방법으로 불용성물질을 제거하는 것이 필요하다.

불용성 물질이 제거된 수용성 생강 추출액을 동결건조로 농축시킨다.

(2) 생강 추출물의 분리 및 정제

상기 (1)에서 얻은 생강의 농축 분말을 물에 녹여 수집용 역상 고압액체크로마토그래피를 수행한다. C18 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.05 % 트리플루오로아세트산이 들어 있는 물과, 0.05 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 80 % 아세토니트릴을 사용하여 용출시켜 분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발 건조시켜 단일 성분으로 수득한다. 총 5개 분획에 대하여 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 평가한 결과, 수집용 역상 HPLC 에서 24 분대에 있는 F3 분획이 B형 간염 표면항원 생성에 대하여 강한 억제효과를 나타내었다.

F3 분획으로부터 유효성분을 찾아내기 위하여 음이온 교환 액체 크로마토그래피를 수행한다. DEAE 컬럼을 사용하고, 완충용액은 20 내지 50 mM 트리스 (pH 7.0 내지 7.5)를 사용하여 3개의 피크를 분리한다.

3개의 피크 성분을 수집용 역상 HPLC로 염을 제거한 후, 각각 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 평가한 결과, P3피크가 가장 강한 억제효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이 성분은 NMR 및 MASS 구조분석 결과 나트륨 치환형태의 트립토판임이 확인되었고 B형 간염에 대한 효과도 입증되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이로서 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 생강으로부터 추출 정제된 성분의 B형 간염 표면 항원에 대한 억제 정도는 다음 방법에 의해 평가한다.

B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도 분석

생강 추출물로부터 얻은 샘플이 처리된 세포 배양액을 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbott lab., #1980-24)를 이용하여 B형 표면항원 생성에 대한 억제정도를 정량적으로 분석한다.

세포 배양액을 인산염 완충 생리 식염수(pH 7.0)로 최종 흡광도가 1.0 내지 1.5 범위에 들도록 희석(대략 20 내지 50배 희석)한 후, 희석액 0.2 ㎖와 샘플을 처리하지 않은 대조용액 0.2㎖를 표면항원에 대한 1차 단일항체, HRP(Horse Radish Peroxidase)가 연결된 2차 단일항체가 이미 결합되어 있는 비드와 40℃에서 2시간 동안 각각 반응시킨후, 비드를 증류수로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에는 키트에 과산화수소수가 함유된 0-페닐렌디아민(0-phenylenediamine) 용액 300 ㎕을 가하고 30분 배양한 후, 0.1N HCl 을 가하여 반응을 중지시켰다. 대조군과 실험군의 흡광도를 492 nm에서 측정하고, 하기 식을 이용하여 B형 간염 표면항원 생성 억제 정도를 계산한다.

실시예

단계 1: 생강 추출물의 제조

한약재인 생강 50g에 증류수 100㎖을 넣고 교반시키면서 80℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 이렇게 얻은 생강 추출액을 13,000rpm 에서 10분간 원심분리하여 불용성 침전은 제거하고 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 한외 여과막(whatman, #1)으로 여과하여 잔여 불용성 물질이 완전히 제거된 생강의 수성 추출물을 얻었다.

상기 생강 추출물을 여러가지 농도로 만들어 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 조사하여 그결과를 아래해 [표 1]에 나타내었다.

(대조군의 흡광도는 0.873 임)

[표 1]에서 보면, 생강 추출물은 90 mg/㎖ 의 농도에서 92 %의 높은 억제효과를 나타냄을 알 수 있다다.

단계 2. 수집용 역상 고압액체 크로마토그래피

수집용 역상 HPLC 수행시, μ-BondaPack C18 컬럼 (7.8 mm x 300 mm, Waters, U.S.A.)을 사용하여 다음 프로그램으로 선형 농도로 용출하여 각 피크들을분리, 수집한다. 이 때의 용출 조건은 다음과 같다.

A 용액: 0.05 % 트리플루오로아세트산 in 물

B 용액: 0.05 % TFA in 아세토니트릴/물=80:20 (v/v)

용출 속도: 1 ㎖/min

흡광도: 280 nm 에서 측정

단계 1에서 얻은 생강 수성 추출물을 감압하 건조시킨 후 물에 녹여 수집용 역상 HPLC를 수행한 결과를 제 1도에 나타내었다.

분리된 각 분획들에 있어서, B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 분석하여 [표 2] 에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, 수집용 역상 HPLC를 수행시 여러 분획에서 B형 간염 표면항원 생성에 대한 억제효과를 보였는데, 특히 F3 분획은 0.25 mg/ml이 농도에서 약 50 %의 억제효과를 나타내었다. 한편 F1 분획은 100 %의 억제효과를 나타내기는 하였으나, 여러 염의 효과로 인하여 세포 자체의 성장이 강한 억제를 보였기때문에 제외하였다.

단계 3. DEAE 음이온교환 고압액체크로마토그래피

상기 단계 2에서 수집용 역상 HPLC를 수행하여 억제 효과가 확인된 F3 분획으로부터 유효성분을 분리하기 위하여 DEAE 음이온교환 고압액체크로마토그래피를 수행하였다.

컬럼은 DEAE 음이온 고압액체수지(Bio-Rad)를 사용하였으며, 완충용액으로는 20-50 mM 트리스 (pH 7.0-7.5)를 다음 조건에서 용출속도 1 ml/분으로 수행하였다.

완충용액 A: 20 mM 트리스(pH 7.3), 10 mM NaCl,

완충용액 B: 2O mM 트리스(pH 7.3), 500 mM NaCl,

용출조건: 0 --- 100 % 완충용액 B (30분 이내)

제 2 도는 제 1 도에서 얻은 F3 분획을 DEAE 음이온 교환 HPLC를 수행한 결과를 나타낸다. 여기에서 P1, P2 및 P3의 3개의 주요 피크를 수집하여, 단계 2에서와 같은 수집용 역상 HPLC를 이용하여 염 등을 제거하고, B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 시험하였다.

제 3 도는 제 2 도에서 얻은 P3 피크 성분을 수집용 역상 HPLC 를 수행한 결과를 나타내고, [표 3]은 P1, P2 및 P3 성분의 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 나타낸 것이다.

상기 표 3 에서 보듯이, P3 성분은 0.1 mg/ml (0.43 mM)의 낮은 농도에서 약 36 %의 억제효과를 나타내었다. 이에 따라 P3 성분의 NMR 및 MASS 구조분석을 실시하였다.

NMR 및 MASS 구조분석

단계 3에서 얻은 P3 피크 성분에 대하여 NMR 및 MASS 구조 분석한 결과, 생강로부터 분리 정제된 성분은 트립토판의 나트륨 치환형태임이 확인되었다.

제 4 도는 P3 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 5 도는 P3 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 생강로부터 추출 정제된 나트륨 치환형태의 트립토판은 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

제 1 도는 생강 수성 추출물의 수집용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내며,

제 2 도는 제 1 도에서 얻은 F3 분획을 DEAE 음이온 교환 고압액체 크로마토그래피를 수행한 결과를 나타내고,

제 3 도는 제 2 도에서 얻은 P3 피크 성분을 수집용 역상 HPLC를 수행한 결과를 나타내고,

제 4 도는 P3 피크 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 5 도는 P3 피크 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

Claims (4)

1. 생강를 수성용매로 추출하고, 이어서 수집용 역상 고압액체크로마토그래피 및 이온교환 크로마토그래피를 수행하여 나트륨 치환형태의 트립토판에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 하는, 생강로부터 나트륨 치환 트립토판을 추출하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 수성용매가 물이고, 60 내지 90℃ 에서 1 내지 3 시간동안 물중탕 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피 수행시 C18 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.05 % 트리플루오로아세트산이 들어 있는 물과, 0.05 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 80 % 아세토니트릴을 사용하여 용출시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 음이온 교환 액체 크로마토그래피 수행시, DEAE 컬럼을 사용하고, 완충용액은 20 내지 50 mM 트리스(pH 7.0 내지 7.5)를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.