JP3249136B2 - フィラントゥス ウスリエンシスおよび／またはフィラントゥス ウリナリアの抽出物を含むｂ型肝炎治療用医薬組成物 - Google Patents
フィラントゥス ウスリエンシスおよび／またはフィラントゥス ウリナリアの抽出物を含むｂ型肝炎治療用医薬組成物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、Ｂ型肝炎に対して治療効果を示すフィラン
トゥス ウスリエンシスおよび／またはフィラントゥス
ウリナリアの抽出物ならびにそれを含むＢ型肝炎治療
用医薬組成物に関する。
トゥス ウスリエンシスおよび／またはフィラントゥス
ウリナリアの抽出物ならびにそれを含むＢ型肝炎治療
用医薬組成物に関する。
発明の背景 Ｂ型肝炎ウイルス（“HBV"）は人体に感染するヘパド
ナビリデ（Hepadnaviridae）の一種である。HBVに感染
したヒトは60〜110日の潜伏期を経て種々の程度の症状
を示す。感染者の90〜95％は完全に回復し得るが、一部
は慢性活動性肝炎、肝硬変または肺癌に発展することが
ある。慢性Ｂ型肝炎は、しばしば慢性ウイス肝炎症、リ
ンパ腫および／または慢性腎臓障害を引き起して患者を
死亡に至らしめる。
ナビリデ（Hepadnaviridae）の一種である。HBVに感染
したヒトは60〜110日の潜伏期を経て種々の程度の症状
を示す。感染者の90〜95％は完全に回復し得るが、一部
は慢性活動性肝炎、肝硬変または肺癌に発展することが
ある。慢性Ｂ型肝炎は、しばしば慢性ウイス肝炎症、リ
ンパ腫および／または慢性腎臓障害を引き起して患者を
死亡に至らしめる。
現在、全世界に約２億名のHBV保菌者がいると報告さ
れており、世界規模の深刻な衛生学的問題を起こす可能
性がある。
れており、世界規模の深刻な衛生学的問題を起こす可能
性がある。
1981年にHBVワクチンが開発されて以降、新生児を含
めて感染しやすいヒトにHBV予防接種を実施したが、HBV
保菌者の数は実質的には減少しなかった。これは、母体
から胎児へのHBVの垂直形感染がHBV保菌者となる主要径
路であるためである（Chung,D.K.et al.,J.Catholic Me
d.Coll.,27:256は267（1976）;Chung,W.K.et al.,J.Inf
ec.Dis.,151:280は286（1985））。Ｂ型肝炎ｅ抗原（HB
eAg）−陽性保菌者から生まれる赤ん坊は胎盤を通じて
はほとんど感染しないが、出産途中または損傷した胎盤
を通じてHBVに暴露されるか、胎盤を通じてHBeAgに感作
する場合、HBVに対して免疫学的欠陥を示し、慢性HBV保
菌者になり得る。
めて感染しやすいヒトにHBV予防接種を実施したが、HBV
保菌者の数は実質的には減少しなかった。これは、母体
から胎児へのHBVの垂直形感染がHBV保菌者となる主要径
路であるためである（Chung,D.K.et al.,J.Catholic Me
d.Coll.,27:256は267（1976）;Chung,W.K.et al.,J.Inf
ec.Dis.,151:280は286（1985））。Ｂ型肝炎ｅ抗原（HB
eAg）−陽性保菌者から生まれる赤ん坊は胎盤を通じて
はほとんど感染しないが、出産途中または損傷した胎盤
を通じてHBVに暴露されるか、胎盤を通じてHBeAgに感作
する場合、HBVに対して免疫学的欠陥を示し、慢性HBV保
菌者になり得る。
最近、PCR（polymerase chain reaction）技術を用い
てHBV保菌者の血液に存在するHBV DNAを検出することが
できるようになり、したがって、HBeAgを唯一のHBV指標
として用いる方法は旧式になった。HBV保菌者の数を減
らすためには、新生児用の効果的な抗−HBVワクチンを
開発し、また、保菌者、特に妊娠した女性において、血
中HBeAg濃度を下げるよりは、血中HBV DNAの量を効果的
に減らす方法を開発することが必須である。
てHBV保菌者の血液に存在するHBV DNAを検出することが
できるようになり、したがって、HBeAgを唯一のHBV指標
として用いる方法は旧式になった。HBV保菌者の数を減
らすためには、新生児用の効果的な抗−HBVワクチンを
開発し、また、保菌者、特に妊娠した女性において、血
中HBeAg濃度を下げるよりは、血中HBV DNAの量を効果的
に減らす方法を開発することが必須である。
これまで種々のHBV治療剤が開発されたが、あまり成
功していない。さらに、アラーエー（Ara−A,Parke,Dav
is,U.S.A.）およびアシクロビル（Acyclovir,Wellcome
Foundation,England）のような現在用いられている薬剤
は毒性が強いという問題がある。ホスホノホーメート
（Phosphonoformate;Foscarnet;Astra,U.S.A.）、スラ
ミン（Suramin;Bayer,Germany）、およびファムシクロ
ビル（Famciclovir;Smith−Kline Beecham,England）な
どの効能のあるHBV治療剤であるといわれているが、こ
れらの有効性を検証するためには追加的な試験が必要で
ある。
功していない。さらに、アラーエー（Ara−A,Parke,Dav
is,U.S.A.）およびアシクロビル（Acyclovir,Wellcome
Foundation,England）のような現在用いられている薬剤
は毒性が強いという問題がある。ホスホノホーメート
（Phosphonoformate;Foscarnet;Astra,U.S.A.）、スラ
ミン（Suramin;Bayer,Germany）、およびファムシクロ
ビル（Famciclovir;Smith−Kline Beecham,England）な
どの効能のあるHBV治療剤であるといわれているが、こ
れらの有効性を検証するためには追加的な試験が必要で
ある。
ベンカテスワランら（Venkateswaran et al.,Proc.Na
tl.Acad.Sci.,U.S.A.,84,274（1987））、ブルムバーグ
ら（Blumberg et al.,Cancer Detection and Preventio
n,14,195（1989））、およびヤナギら（Yanagi et al.,
Abstracts of Papers Presented at the 1989 Meeting
on Hepatitis B Virus、September 25,1989）はインド
で民間薬として用いられていたフィラントゥス属（Phyl
lanthus）（Euphorbiaceae;タカトウダイグサ科）植物
を用いてＢ型肝炎を治療しようと試みた。
tl.Acad.Sci.,U.S.A.,84,274（1987））、ブルムバーグ
ら（Blumberg et al.,Cancer Detection and Preventio
n,14,195（1989））、およびヤナギら（Yanagi et al.,
Abstracts of Papers Presented at the 1989 Meeting
on Hepatitis B Virus、September 25,1989）はインド
で民間薬として用いられていたフィラントゥス属（Phyl
lanthus）（Euphorbiaceae;タカトウダイグサ科）植物
を用いてＢ型肝炎を治療しようと試みた。
フィラントゥス属植物の世界中の用途および生化学的
分析結果を網羅するウナンダーらの包括的な総説（Unan
der,D.W.et al.,Journal of Ethnopharmacology,34,97
−133（1991））によれば、フィラントゥスの550種中７
種、すなわち、フィラントゥス ニリル（P.niruri）、
フィラントゥス アイリーシャウイ（P.airyshawii）、
フィラントゥス アマルス（P.amarus）、フィラントゥ
ス フラターナス ウェブスター（P.fraternus Webste
r）、フィラントゥス ウリナリア（P.urinaria）、フ
ィラントゥス ガストロエミ（P.gasstroemi）Muell−A
rgおよびフィラントゥス チモイデス（P.thymoides）
が黄疸または肝炎の治療に用いられてきた。P.アマルス
（P.amarus）およびP.ニルリ（P.niruri）はウッドチャ
ックＢ型肝炎（Venkateswaran,P.S.et al,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.84,274（1987））およびカモＢ型肝炎（Nis.,
J.,et al.,J.of Med.Virol.,32,212−218（1990））に
対して薬効を有すると報告された。しかし、これらは臨
床的適用においては薬効を示さなかったと報告された
（Leelarasamee,A.,et al.,Lancet,1,335（1990））。
分析結果を網羅するウナンダーらの包括的な総説（Unan
der,D.W.et al.,Journal of Ethnopharmacology,34,97
−133（1991））によれば、フィラントゥスの550種中７
種、すなわち、フィラントゥス ニリル（P.niruri）、
フィラントゥス アイリーシャウイ（P.airyshawii）、
フィラントゥス アマルス（P.amarus）、フィラントゥ
ス フラターナス ウェブスター（P.fraternus Webste
r）、フィラントゥス ウリナリア（P.urinaria）、フ
ィラントゥス ガストロエミ（P.gasstroemi）Muell−A
rgおよびフィラントゥス チモイデス（P.thymoides）
が黄疸または肝炎の治療に用いられてきた。P.アマルス
（P.amarus）およびP.ニルリ（P.niruri）はウッドチャ
ックＢ型肝炎（Venkateswaran,P.S.et al,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.84,274（1987））およびカモＢ型肝炎（Nis.,
J.,et al.,J.of Med.Virol.,32,212−218（1990））に
対して薬効を有すると報告された。しかし、これらは臨
床的適用においては薬効を示さなかったと報告された
（Leelarasamee,A.,et al.,Lancet,1,335（1990））。
また、シードらは、P.チモイデスが試験管中でフィラ
ントゥス属の種々の植物中最も高いHBsAgへの結合力を
示すと報告した。しかし、HBsAgと結合することはP.チ
モイデスでなく特定なレクチン（lectin）であり、P.チ
モイデスは生体内（in vivo）試験においてカモＢ型肝
炎に対して抗ウイルス活性を示さなかったことが後に報
告された（Shead,A.et al.,“Neutralization but not
Cure of Duct Hepatitis B by Australian Phyllanthus
Extracts",Abstract 602,In:Scientific Program and
Abstracts Volume,the 1990 International Symposium
on Viral Hepatitis and Liver Disease,April 4−8,19
90,Houston,Texas,U.S.A.）。
ントゥス属の種々の植物中最も高いHBsAgへの結合力を
示すと報告した。しかし、HBsAgと結合することはP.チ
モイデスでなく特定なレクチン（lectin）であり、P.チ
モイデスは生体内（in vivo）試験においてカモＢ型肝
炎に対して抗ウイルス活性を示さなかったことが後に報
告された（Shead,A.et al.,“Neutralization but not
Cure of Duct Hepatitis B by Australian Phyllanthus
Extracts",Abstract 602,In:Scientific Program and
Abstracts Volume,the 1990 International Symposium
on Viral Hepatitis and Liver Disease,April 4−8,19
90,Houston,Texas,U.S.A.）。
前述のように、たとえば、P.アマルス、P.ニルリのよ
うなフィラントゥス属の数種は民間療法において黄疸ま
たは肝炎の治療のため用いられ、いくつの試験管中実験
に基づいてＢ型肝炎に対して薬効があると主張されてき
た。しかし、このような進展にもかかわらず、ヒトＢ型
肝炎の治療のための前記フィラントゥス属植物の効果は
十分に確立されておらず、ヒト、特に妊婦および子供に
投与したとき安全かつ毒性が少なく、副作用を示さない
Ｂ型肝炎治療剤の開発が求められている。
うなフィラントゥス属の数種は民間療法において黄疸ま
たは肝炎の治療のため用いられ、いくつの試験管中実験
に基づいてＢ型肝炎に対して薬効があると主張されてき
た。しかし、このような進展にもかかわらず、ヒトＢ型
肝炎の治療のための前記フィラントゥス属植物の効果は
十分に確立されておらず、ヒト、特に妊婦および子供に
投与したとき安全かつ毒性が少なく、副作用を示さない
Ｂ型肝炎治療剤の開発が求められている。
発明の要約 したがって、本発明の目的は、Ｂ型肝炎に対する治療
効果があり、臨床的に安全なフィラントゥス属（Phylla
nthus）植物の抽出物を提供することである。
効果があり、臨床的に安全なフィラントゥス属（Phylla
nthus）植物の抽出物を提供することである。
本発明の他の目的は、副作用なしにＢ型肝炎患者を治
療するための、前記抽出物を含む医薬組成物を提供する
ことである。
療するための、前記抽出物を含む医薬組成物を提供する
ことである。
本発明の一つの態様は、Ｂ型肝炎に対して効果的な治
療活性を示すフィラントゥス ウスリエンシス（Phylla
nthus ussuriensis）またはフィラントゥス ウリナリ
ア（Phyllanthus urinaria）の抽出物、およびその抽出
物と薬剤学的に許容可能な担体を含むＢ型肝炎治療用医
薬組成物である。
療活性を示すフィラントゥス ウスリエンシス（Phylla
nthus ussuriensis）またはフィラントゥス ウリナリ
ア（Phyllanthus urinaria）の抽出物、およびその抽出
物と薬剤学的に許容可能な担体を含むＢ型肝炎治療用医
薬組成物である。
図面の簡単な説明 本発明の前記およびその他の目的および特徴は、添付
の図面に関連させた本発明の下記説明から明らかにな
り、ここで 図１は、HBV DNAポリメラーゼの活性に対するフィラ
ントゥス ウスリエンシスおよびフィラントゥス ウリ
ナリア抽出物の生体内阻害効果を示す。
の図面に関連させた本発明の下記説明から明らかにな
り、ここで 図１は、HBV DNAポリメラーゼの活性に対するフィラ
ントゥス ウスリエンシスおよびフィラントゥス ウリ
ナリア抽出物の生体内阻害効果を示す。
図2Aおよび2Bは、P.ウリナリア抽出物の0.1％水溶液
の添加前と添加後に電子顕微鏡で観察したHBV粒子を示
す。
の添加前と添加後に電子顕微鏡で観察したHBV粒子を示
す。
発明の詳細な説明 本発明によって、フィラントゥス ウスリエンシスま
たはフィラントゥス ウリナリアの抽出物は、抗−HBsA
g抗体（HBsAb）−様の物質を含み、HBV DNAポリメラー
ゼの活性を阻害する能力を有し、哺乳動物に対する毒性
およびマイトジェン性をほとんど示さず、かつＢ型肝炎
ウイルス粒子の著しい変形を惹起することが判明した。
たはフィラントゥス ウリナリアの抽出物は、抗−HBsA
g抗体（HBsAb）−様の物質を含み、HBV DNAポリメラー
ゼの活性を阻害する能力を有し、哺乳動物に対する毒性
およびマイトジェン性をほとんど示さず、かつＢ型肝炎
ウイルス粒子の著しい変形を惹起することが判明した。
本発明に用いられるP.ウスリエンシスおよびP.ウリナ
リアはタカトウダイグサ科（Euphorbiaceae）のフィラ
ントゥス属に属する一年生草本であり、大韓民国の南部
に自生する。P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアの植
物学的特性および走査電子顕微鏡（SEM）で観察した外
見は次の通りである。
リアはタカトウダイグサ科（Euphorbiaceae）のフィラ
ントゥス属に属する一年生草本であり、大韓民国の南部
に自生する。P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアの植
物学的特性および走査電子顕微鏡（SEM）で観察した外
見は次の通りである。
表１からわかるように、P.ウリナリアは、比較的多量
の赤い色素を有し、種子に横皺が寄っているという特徴
がある。一方、P.ウスリエンシスは、縦シマを有する種
子を結び米国自生のP.アマルスと類似である。
の赤い色素を有し、種子に横皺が寄っているという特徴
がある。一方、P.ウスリエンシスは、縦シマを有する種
子を結び米国自生のP.アマルスと類似である。
P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物は下記
の好ましい態様によって製造し得る。
の好ましい態様によって製造し得る。
P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアを水で洗浄し、
室温で乾燥した後、細片に切り刻む。植物細片を25〜60
倍、好ましくは50倍容量の水と混合し、混合物を60〜90
℃、好ましくは80℃の温度で３〜５時間、好ましくは４
時間加熱して水性粗抽出物を得る。粗抽出物を遠心分離
し、濾過した後、冷凍乾燥して抽出物粉末を得る。この
粉末は、使用するまで４℃で保管する。
室温で乾燥した後、細片に切り刻む。植物細片を25〜60
倍、好ましくは50倍容量の水と混合し、混合物を60〜90
℃、好ましくは80℃の温度で３〜５時間、好ましくは４
時間加熱して水性粗抽出物を得る。粗抽出物を遠心分離
し、濾過した後、冷凍乾燥して抽出物粉末を得る。この
粉末は、使用するまで４℃で保管する。
また、P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの有機粗
抽出物は、25〜60倍、好ましくは50倍容量の有機溶媒を
用いて10〜40℃、好ましくは20〜30℃の温度で12〜48時
間、好ましくは24時間抽出する以外は、前記と同様の手
順に従って製造し得る。有機溶媒の例には、ジメチルス
ルホキシド（DMSO）、アセトン、メタノールおよびエタ
ノールを含む。次いで、前記と同様の手順に従って有機
粗抽出物から粉末状抽出物が得られる。
抽出物は、25〜60倍、好ましくは50倍容量の有機溶媒を
用いて10〜40℃、好ましくは20〜30℃の温度で12〜48時
間、好ましくは24時間抽出する以外は、前記と同様の手
順に従って製造し得る。有機溶媒の例には、ジメチルス
ルホキシド（DMSO）、アセトン、メタノールおよびエタ
ノールを含む。次いで、前記と同様の手順に従って有機
粗抽出物から粉末状抽出物が得られる。
本発明のP.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出
物は、血清またはＢ型肝炎ワクチン中のHBsAgに対して
高い結合能を有する。この抽出物は、1.25mg/ml以上の
濃度でHBsAgのHBsAbとの結合に対して拮抗的阻害効果を
示す。
物は、血清またはＢ型肝炎ワクチン中のHBsAgに対して
高い結合能を有する。この抽出物は、1.25mg/ml以上の
濃度でHBsAgのHBsAbとの結合に対して拮抗的阻害効果を
示す。
また、本発明の抽出物は、34μg/ml以上の濃度でHBV
DNAポリメラーゼの活性を阻害するが、阻害効果はその
濃度が増加するにつれて上昇する。特に、P.ウリナリア
の抽出物は0.1％の濃度でＢ型肝炎ウイルス粒子の著し
い変形を惹起する。
DNAポリメラーゼの活性を阻害するが、阻害効果はその
濃度が増加するにつれて上昇する。特に、P.ウリナリア
の抽出物は0.1％の濃度でＢ型肝炎ウイルス粒子の著し
い変形を惹起する。
さらに、本発明の抽出物は強い効能にもかかわらず、
マウスおよびイヌを用いた試験において毒性やマイトジ
ェン性をほとんど示さない。より具体的には、P.ウリナ
リアの抽出物は70mg/kgの投与量でマウスに腹腔内投与
するとき毒性を示さなかったが、これは体重50kgのヒト
に3,500mgの抽出物を腹腔内投与することに相当する。
また、P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を
正常のマウスに投与した場合、マウスのsGOT、sGPT、AL
P（アルカリ性ホスファターゼ）およびビリルビン濃度
が変化しない事実からみて、この抽出物は肝機能に副作
用を起こさないことがわかる。サルモネラタイピムリウ
ムTA100およびTA98を用いたAmes試験において、P.ウス
リエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物は陰性と判定さ
れるためマイトジェン性はない。
マウスおよびイヌを用いた試験において毒性やマイトジ
ェン性をほとんど示さない。より具体的には、P.ウリナ
リアの抽出物は70mg/kgの投与量でマウスに腹腔内投与
するとき毒性を示さなかったが、これは体重50kgのヒト
に3,500mgの抽出物を腹腔内投与することに相当する。
また、P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を
正常のマウスに投与した場合、マウスのsGOT、sGPT、AL
P（アルカリ性ホスファターゼ）およびビリルビン濃度
が変化しない事実からみて、この抽出物は肝機能に副作
用を起こさないことがわかる。サルモネラタイピムリウ
ムTA100およびTA98を用いたAmes試験において、P.ウス
リエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物は陰性と判定さ
れるためマイトジェン性はない。
なお、本発明の抽出物を120日間投与したイヌは肝機
能に異常を示さない。さらに、P.ウリナリアの抽出物を
イヌに投与したときHBsAb−陽性反応が観察されるが、
この結果はHBsAb−類似物質がイヌの血清中に形成され
ることを示す。
能に異常を示さない。さらに、P.ウリナリアの抽出物を
イヌに投与したときHBsAb−陽性反応が観察されるが、
この結果はHBsAb−類似物質がイヌの血清中に形成され
ることを示す。
一方、ヒトのHBVと似ているウッドチャック肝炎ウイ
ルス（Woodchuck hepatitis virus:WHV）が北米産ウッ
ドチャック（マルモタ モナックス;Marmota monax）か
ら発見され、ウッドチャックのWHVの感染がヒトと類似
する慢性肝炎を誘発し得ることが実験的に立証された
（Summers,J.,Smolec,J.M.and Snyder.R.,Proc,Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,75,4533−4537（1978））。本発明のP.
ウリナリア抽出物を感染ウッドチャックに投与すると、
ウッドチャックの血中WHV DNAの濃度が著しく減少す
る。
ルス（Woodchuck hepatitis virus:WHV）が北米産ウッ
ドチャック（マルモタ モナックス;Marmota monax）か
ら発見され、ウッドチャックのWHVの感染がヒトと類似
する慢性肝炎を誘発し得ることが実験的に立証された
（Summers,J.,Smolec,J.M.and Snyder.R.,Proc,Natl.Ac
ad.Sci.U.S.A.,75,4533−4537（1978））。本発明のP.
ウリナリア抽出物を感染ウッドチャックに投与すると、
ウッドチャックの血中WHV DNAの濃度が著しく減少す
る。
ヒトを用いた臨床試験においてもP.ウスリエンシスお
よびP.ウリナリアの抽出物は良い結果を示した。即ち、
P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を健康な
HBV保菌者、軽度の慢性肝炎と推定されるHBV保菌者およ
び肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者に50mg/kg
体重／日の量を実際に投与した結果、投与３ヶ月後には
HBV DNAがもはや検出されなかった。
よびP.ウリナリアの抽出物は良い結果を示した。即ち、
P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を健康な
HBV保菌者、軽度の慢性肝炎と推定されるHBV保菌者およ
び肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者に50mg/kg
体重／日の量を実際に投与した結果、投与３ヶ月後には
HBV DNAがもはや検出されなかった。
血清HBsAb検出試験の場合には、P.ウリナリアの抽出
物の投与３ヶ月後に陽性結果が得られたが、放射状同位
元素法では陰性と判定された。この結果は、P.ウリナリ
アの抽出物が生体内でHBsAgに特異的に結合する物質を
含むことを暗示する。また、P.ウリナリアの抽出物は投
与３ヶ月後に肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者
の血清GOTおよびGPT濃度を著しく改善した。
物の投与３ヶ月後に陽性結果が得られたが、放射状同位
元素法では陰性と判定された。この結果は、P.ウリナリ
アの抽出物が生体内でHBsAgに特異的に結合する物質を
含むことを暗示する。また、P.ウリナリアの抽出物は投
与３ヶ月後に肝硬変が併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者
の血清GOTおよびGPT濃度を著しく改善した。
前述の通り、P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの
抽出物は、毒性がほとんどなく、副作用を起こさない、
Ｂ型肝炎の治療のための効果的な薬剤として用いられ得
る。
抽出物は、毒性がほとんどなく、副作用を起こさない、
Ｂ型肝炎の治療のための効果的な薬剤として用いられ得
る。
したがって、本発明はさらに、活性成分としてP.ウス
リエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を薬剤学的に許
容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに配合して含
む、Ｂ型肝炎治療用医薬組成物を提供する。
リエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を薬剤学的に許
容可能な賦形剤、担体または希釈剤とともに配合して含
む、Ｂ型肝炎治療用医薬組成物を提供する。
医薬製剤はこの組成物を用いて任意の通常の手順に従
って製造することができる。製剤の製造においては、活
性成分を担体と混合するか、担体で希釈するか、カプセ
ル、サシェット（sachet）または他の容器である担体中
に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働く場
合、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒
体として作用する固体、半固体または液体物質であって
もよい。したがって、製剤は錠剤、丸剤、粉剤、サシェ
ット、エリキシル（elixir）、懸濁液、溶液、シロッ
プ、エーロゾル、軟質および硬質のゼラチンカプセル、
滅菌注射溶液、滅菌包装粉剤などの形であってもよい。
って製造することができる。製剤の製造においては、活
性成分を担体と混合するか、担体で希釈するか、カプセ
ル、サシェット（sachet）または他の容器である担体中
に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働く場
合、これは活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒
体として作用する固体、半固体または液体物質であって
もよい。したがって、製剤は錠剤、丸剤、粉剤、サシェ
ット、エリキシル（elixir）、懸濁液、溶液、シロッ
プ、エーロゾル、軟質および硬質のゼラチンカプセル、
滅菌注射溶液、滅菌包装粉剤などの形であってもよい。
適当な担体、賦形剤および希釈剤の例は、ラクトー
ス、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マン
ニトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチ
ン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロー
ス、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビ
ニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒド
ロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネ
シウムおよびミネラル油である。製剤は充填剤、凝集防
止剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などを
さらに含み得る。本発明の組成物は患者に投与された
後、活性成分は速放出、徐放出および遅延放出するよう
に当分野で公知の任意の方法を用いて製剤化し得る。
ス、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マン
ニトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチ
ン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロー
ス、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビ
ニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒド
ロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネ
シウムおよびミネラル油である。製剤は充填剤、凝集防
止剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などを
さらに含み得る。本発明の組成物は患者に投与された
後、活性成分は速放出、徐放出および遅延放出するよう
に当分野で公知の任意の方法を用いて製剤化し得る。
医薬製剤は、経口、経皮、皮下、静脈内および筋肉内
注射を含む種々の経路を通じて投与され得る。活性成分
の通常の一日投与量は約20〜100mg/kg体重、好ましくは
40〜80mg/kg体重の範囲であり得、単一投与量または分
割投与量で投与することができる。しかし、実際に投与
される活性成分の量は、治療する疾患、選択された投与
経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の程度を
含む種々の関連因子を考慮して決定されものであり、し
たがって、前記投与量は本発明の範囲を制限しない。
注射を含む種々の経路を通じて投与され得る。活性成分
の通常の一日投与量は約20〜100mg/kg体重、好ましくは
40〜80mg/kg体重の範囲であり得、単一投与量または分
割投与量で投与することができる。しかし、実際に投与
される活性成分の量は、治療する疾患、選択された投与
経路、患者の年齢、性別および体重および疾患の程度を
含む種々の関連因子を考慮して決定されものであり、し
たがって、前記投与量は本発明の範囲を制限しない。
下記製造例および試験例は本発明の範囲を制限するも
のではなく、これをさらに詳細に説明するためのもので
ある。
のではなく、これをさらに詳細に説明するためのもので
ある。
また、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液
体中の固体に対して下記に与えられた百分率は特に指示
しない限り、各々wt/wt、vol/volおよびwt/volに基づ
く。
体中の固体に対して下記に与えられた百分率は特に指示
しない限り、各々wt/wt、vol/volおよびwt/volに基づ
く。
製造例:P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の
製造 P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアを韓国慶尚北道
達城郡玉浦面および韓国済州道の野原で各々採集し、水
で洗浄し、室温で通風乾燥した後、細かい断片に切り刻
んだ。P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの断片に植
物20g当り1,000mlの量で蒸留水を加え、混合物を80℃で
４時間加熱して抽出物を得た。抽出物を3,000rpmで30分
間遠心分離し、上澄液をワットマンNo.2濾紙を通して濾
過した後、0.45μm Seitz−型濾紙（Amicon,U.S.A.）で
濾過した。濾液を冷凍乾燥して粉末状抽出物1.6g（収率
８％）を得、これを４℃にて保管した。
製造 P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアを韓国慶尚北道
達城郡玉浦面および韓国済州道の野原で各々採集し、水
で洗浄し、室温で通風乾燥した後、細かい断片に切り刻
んだ。P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの断片に植
物20g当り1,000mlの量で蒸留水を加え、混合物を80℃で
４時間加熱して抽出物を得た。抽出物を3,000rpmで30分
間遠心分離し、上澄液をワットマンNo.2濾紙を通して濾
過した後、0.45μm Seitz−型濾紙（Amicon,U.S.A.）で
濾過した。濾液を冷凍乾燥して粉末状抽出物1.6g（収率
８％）を得、これを４℃にて保管した。
また、表２に記載した種々の有機溶媒を用いてP.ウス
リエンシスまたはP.ウリナリアの有機抽出物を製造し、
これから前記と同様の手順に従って粉末状抽出物を製造
した。この抽出条件および収率を表２に示す。
リエンシスまたはP.ウリナリアの有機抽出物を製造し、
これから前記と同様の手順に従って粉末状抽出物を製造
した。この抽出条件および収率を表２に示す。
前記粉末状抽出物は水によく溶けるため（25℃で20％
以上）、これをヒトに１日２回または３回投与したと
き、体重kg当り40mgの一日投与量を２または３個の分画
に分けた後、各分画を蒸留水50〜100mlに溶かして単位
投与量とした。動物試験における１日投与量は通常ヒト
投与量の約３倍であり、適正量は動物の種類、大きさお
よび体重によって決定した。
以上）、これをヒトに１日２回または３回投与したと
き、体重kg当り40mgの一日投与量を２または３個の分画
に分けた後、各分画を蒸留水50〜100mlに溶かして単位
投与量とした。動物試験における１日投与量は通常ヒト
投与量の約３倍であり、適正量は動物の種類、大きさお
よび体重によって決定した。
試験例1:HBsAg−陽性血清とP.ウスリエンシスまたはP.
ウリナリア抽出物の沈降反応 HBsAg−陽性血清（Liver Reserch Institute,School
of Medicine,Kyungpook National University,Korea）
0.5mlずつを5ml容量の試験管に入れ、P.ウスリエンシス
およびP.ウリナリアの２％水性抽出物を徐々に加えて血
清試料上に層を形成し、沈降環の形成を観察した。P.ウ
スリエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物のいずれも白
色沈降環の形成を誘導したため、これらがHBsAg−陽性
血清試料と反応したことがわかる。
ウリナリア抽出物の沈降反応 HBsAg−陽性血清（Liver Reserch Institute,School
of Medicine,Kyungpook National University,Korea）
0.5mlずつを5ml容量の試験管に入れ、P.ウスリエンシス
およびP.ウリナリアの２％水性抽出物を徐々に加えて血
清試料上に層を形成し、沈降環の形成を観察した。P.ウ
スリエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物のいずれも白
色沈降環の形成を誘導したため、これらがHBsAg−陽性
血清試料と反応したことがわかる。
試験例2:HBsAgに対するP.ウスリエンシスまたはP.ウリ
ナリア抽出物の結合親和度 （１）HBsAg力価の測定 HBsAgに対するP.ウスリエンシスまたはP.ウリナリア
抽出物の結合親和力はHBsAgのHBsAbとの結合に対する抽
出物の阻害活性を測定することによって決定し、HBsAg
力価はELISAキット（EnzygnostR HBsAg monoclonal I
I、Behring社）を用いて製造者のプロトコルに従って測
定した。
ナリア抽出物の結合親和度 （１）HBsAg力価の測定 HBsAgに対するP.ウスリエンシスまたはP.ウリナリア
抽出物の結合親和力はHBsAgのHBsAbとの結合に対する抽
出物の阻害活性を測定することによって決定し、HBsAg
力価はELISAキット（EnzygnostR HBsAg monoclonal I
I、Behring社）を用いて製造者のプロトコルに従って測
定した。
（２）HBsAg−陽性血清を用いた親和度検査 製造例で製造したP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリ
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々1
0、５、2.5、1.25および0.63mg/mlに調整した。生成し
た溶液400μｌずつをＢ型肝炎患者から得られたHBsAg−
陽性血清400μｌと混合し、この混合物を20℃で１時間
反応させた。反応物を3,000rpmで15分間遠心分離して上
澄液を得た。上澄液中のHBsAgの力価は前記（１）と同
様の方法に従って測定し、これからHBsAg力価の減少を
決定した。血清HBsAgとHBsAbの結合の阻害においてP.ウ
スリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の活性は抽出物
を用いなかったコントロールの値を基準とする百分率を
もって示した。その結果を表３に示す。
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々1
0、５、2.5、1.25および0.63mg/mlに調整した。生成し
た溶液400μｌずつをＢ型肝炎患者から得られたHBsAg−
陽性血清400μｌと混合し、この混合物を20℃で１時間
反応させた。反応物を3,000rpmで15分間遠心分離して上
澄液を得た。上澄液中のHBsAgの力価は前記（１）と同
様の方法に従って測定し、これからHBsAg力価の減少を
決定した。血清HBsAgとHBsAbの結合の阻害においてP.ウ
スリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の活性は抽出物
を用いなかったコントロールの値を基準とする百分率を
もって示した。その結果を表３に示す。
（３）Ｂ型肝炎ワクチン中のHBsAgを用いた親和度検査 製造例で製造したP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリ
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々0.
63、0.31および0.16mg/mlに調整した。得られた溶液各4
00μｌを、ヘパバックス（HepavaxR;20μg;Korea Green
Cross Corp.,Korea）を50倍容量の蒸留水で希釈して製
造したHBsAg溶液400μｌと混合し、この混合物を20℃で
１時間反応させた。得られた混合物中のHBsAgの力価は
前記（１）と同様の方法に従って測定し、これからHBsA
g力価の減少を決定した。Ｂ型肝炎ワクチン中のHBsAgと
HBsAbの結合阻害においてP.ウスリエンシスおよびP.ウ
リナリア抽出物の活性は抽出物を用いなかったコントロ
ールの値を基準とする百分率をもって示した。その結果
を表４に示す。
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々0.
63、0.31および0.16mg/mlに調整した。得られた溶液各4
00μｌを、ヘパバックス（HepavaxR;20μg;Korea Green
Cross Corp.,Korea）を50倍容量の蒸留水で希釈して製
造したHBsAg溶液400μｌと混合し、この混合物を20℃で
１時間反応させた。得られた混合物中のHBsAgの力価は
前記（１）と同様の方法に従って測定し、これからHBsA
g力価の減少を決定した。Ｂ型肝炎ワクチン中のHBsAgと
HBsAbの結合阻害においてP.ウスリエンシスおよびP.ウ
リナリア抽出物の活性は抽出物を用いなかったコントロ
ールの値を基準とする百分率をもって示した。その結果
を表４に示す。
（４）HBsAgに対する結合におけるP.ウスリエンシスま
たはP.ウリナリアの抽出物とHBeAbの間の拮抗的関係 HBsAgに対する結合において、P.ウスリエンシスまた
はP.ウリナリアの抽出物とHBsAbの拮抗的関係は下記手
順に従って調査した。
たはP.ウリナリアの抽出物とHBeAbの間の拮抗的関係 HBsAgに対する結合において、P.ウスリエンシスまた
はP.ウリナリアの抽出物とHBsAbの拮抗的関係は下記手
順に従って調査した。
製造例で製造したP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリ
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々1
0、５、2.5および1.25mg/mlに調整した。得られた溶液4
00μｌずつをHBsAb−陽性血清400μｌと混合し、生成し
た混合物中のHBsAbの力価はEnzygnostR Anti−HBsマイ
クロキット（Behring Co.,U.S.A.）を用いて製造者のプ
ロトコルに従って測定した。HBsAgとHBsAbの結合を阻害
においてP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の
拮抗的阻害活性は抽出物を用いなかったコントロールの
値を基準とする百分率をもって示した。その結果を表５
に示す。
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々1
0、５、2.5および1.25mg/mlに調整した。得られた溶液4
00μｌずつをHBsAb−陽性血清400μｌと混合し、生成し
た混合物中のHBsAbの力価はEnzygnostR Anti−HBsマイ
クロキット（Behring Co.,U.S.A.）を用いて製造者のプ
ロトコルに従って測定した。HBsAgとHBsAbの結合を阻害
においてP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の
拮抗的阻害活性は抽出物を用いなかったコントロールの
値を基準とする百分率をもって示した。その結果を表５
に示す。
前記表５からわかるように、P.ウスリエンシスおよび
P.ウリナリアの抽出物は1.25mg/mlの濃度でかなりの拮
抗的活性を示した。
P.ウリナリアの抽出物は1.25mg/mlの濃度でかなりの拮
抗的活性を示した。
試験例3:HBV DNAポリメラーゼの活性に対するP.ウスリ
エンシスおよびP.ウリナリア抽出物の阻害活性 製造例で製造したP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリ
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々34
0.6、68.1、34.1および6.8mg/mlに調整し、生成した溶
液をHBV粒子（Dane patricle）と反応させた後、DNAポ
リメラーゼの阻害程度を次のように測定した。
エンシスおよびP.ウリナリア抽出物の阻害活性 製造例で製造したP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリ
アの粉末状抽出物を蒸留水に溶かして最終濃度を各々34
0.6、68.1、34.1および6.8mg/mlに調整し、生成した溶
液をHBV粒子（Dane patricle）と反応させた後、DNAポ
リメラーゼの阻害程度を次のように測定した。
HBV粒子を含有する血清0.2mlを2.3mlの溶液（0.01Mト
リス−HCL（pH7.4）、0.15M NaCl）と混合した後、４℃
で10,000rpmで10分間遠心分離した。生成した上澄液を
2.5mlの溶液２（30％（w/v）スクロース、0.01Mトリス
−HCl（pH7.4）、0.15M NaCl、0.001M EDTA、0.1％２−
メルカプトエタノール、1mgウシ血清アルブミン（BS
A））上に置いた後、４℃で50,000rpmで４時間遠心分離
した。生成したペレットを25μｌの溶液３（0.01Mトリ
ス−HCL（pH7.4）、0.15M NaCl、１％NP−40、0.1％２
−メルカプトエタノール）に懸濁した。前記懸濁液に前
記で製造した各々の抽出物溶液25μｌとポリメラーゼ混
合液［0.2Mトリス−HCL（pH7.4）、0.08M MgCl2、0.24M
NH4Cl、1mM dATP、1mM dTTP、0.0025nM3 H−dGTP（二
つとも不活性であり、21Ci/mMである）］25μｌを加え
た。混合液を37℃で３時間反応させた後、ワットマン3m
m濾紙に点滴した。濾紙を15％トリクロロ酢酸と90％エ
タノールで洗浄した後、空気中で乾燥した。
リス−HCL（pH7.4）、0.15M NaCl）と混合した後、４℃
で10,000rpmで10分間遠心分離した。生成した上澄液を
2.5mlの溶液２（30％（w/v）スクロース、0.01Mトリス
−HCl（pH7.4）、0.15M NaCl、0.001M EDTA、0.1％２−
メルカプトエタノール、1mgウシ血清アルブミン（BS
A））上に置いた後、４℃で50,000rpmで４時間遠心分離
した。生成したペレットを25μｌの溶液３（0.01Mトリ
ス−HCL（pH7.4）、0.15M NaCl、１％NP−40、0.1％２
−メルカプトエタノール）に懸濁した。前記懸濁液に前
記で製造した各々の抽出物溶液25μｌとポリメラーゼ混
合液［0.2Mトリス−HCL（pH7.4）、0.08M MgCl2、0.24M
NH4Cl、1mM dATP、1mM dTTP、0.0025nM3 H−dGTP（二
つとも不活性であり、21Ci/mMである）］25μｌを加え
た。混合液を37℃で３時間反応させた後、ワットマン3m
m濾紙に点滴した。濾紙を15％トリクロロ酢酸と90％エ
タノールで洗浄した後、空気中で乾燥した。
各点の放射能はデンシトメーター（Densitometer,Bio
med.Instrument Inc.U.S.A.）を用いて測定し、DNAポリ
メラーゼ活性の阻害程度（％）はP.ウスリエンシスおよ
びP.ウリナリア抽出物の不存在下で測定されたDNAポリ
メラーゼの活性を100％として決定した。その結果を図
１に示すが、ここでHBV DNAポリメラーゼの活性は34.1
μg/ml以上で抽出物の濃度の増加に比例して減少するこ
とが観察された。
med.Instrument Inc.U.S.A.）を用いて測定し、DNAポリ
メラーゼ活性の阻害程度（％）はP.ウスリエンシスおよ
びP.ウリナリア抽出物の不存在下で測定されたDNAポリ
メラーゼの活性を100％として決定した。その結果を図
１に示すが、ここでHBV DNAポリメラーゼの活性は34.1
μg/ml以上で抽出物の濃度の増加に比例して減少するこ
とが観察された。
試験例4:P.ウスリエンシス抽出物のHBV粒子に対する影
響 HBsAgおよびHBeAg−陽性患者から得られた血清を20％
スクロースクッション上に重層し、超遠心分離機（Sorv
allR）を用いて４℃、100,000xgで４時間遠心分離してH
BV粒子を得た後、ペレット化されたHBV粒子を20倍体積
のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）に懸濁させた。
響 HBsAgおよびHBeAg−陽性患者から得られた血清を20％
スクロースクッション上に重層し、超遠心分離機（Sorv
allR）を用いて４℃、100,000xgで４時間遠心分離してH
BV粒子を得た後、ペレット化されたHBV粒子を20倍体積
のリン酸塩緩衝食塩水（PBS）に懸濁させた。
一方、P.ウリナリア抽出物の２％水溶液を蒸留水で希
釈して最終濃度が各々0.2％および0.1％になるように調
整した。各々の生成した溶液を前記で製造したHBV粒子
懸濁液の同量と混合し、混合液を室温で30分間放置し
た。生成した混合物をグリッド上に一滴落とし、１％リ
ンタングステン酸でネガティブ染色した。グリッドをPB
Sで２回洗浄し、グリッド上に残った水分をワットマンN
o.1濾紙で完全に除去した。その後グリッドを電子顕微
鏡（Zeiss）で観察し、写真撮影した。
釈して最終濃度が各々0.2％および0.1％になるように調
整した。各々の生成した溶液を前記で製造したHBV粒子
懸濁液の同量と混合し、混合液を室温で30分間放置し
た。生成した混合物をグリッド上に一滴落とし、１％リ
ンタングステン酸でネガティブ染色した。グリッドをPB
Sで２回洗浄し、グリッド上に残った水分をワットマンN
o.1濾紙で完全に除去した。その後グリッドを電子顕微
鏡（Zeiss）で観察し、写真撮影した。
HBV粒子に対するP.ウリナリア抽出物の影響を観察
し、抽出物希釈液の代わりに蒸留水を用いたコントロー
ルのものと比べた。
し、抽出物希釈液の代わりに蒸留水を用いたコントロー
ルのものと比べた。
図2Aおよび2BはP.ウリナリア抽出物の0.1％水溶液を
加える前と後に電子顕微鏡で観察したHBV粒子を示す。
図2Aおよび2Bからわかるように、P.ウリナリア抽出物は
0.1％濃度でHBV粒子の著しい変形を惹起する。
加える前と後に電子顕微鏡で観察したHBV粒子を示す。
図2Aおよび2Bからわかるように、P.ウリナリア抽出物は
0.1％濃度でHBV粒子の著しい変形を惹起する。
試験例5:マウスに対するP.ウリナリア抽出物の急性毒性 一群当り10匹（雄５匹および雌５匹）からなる５群の
マウスにP.ウリナリア抽出物を各々70、84、100、120お
よび144mg/kg体重の量で腹腔内投与した。投与７日後に
マウスの致死および内部臓器の異常の可否を観察した。
その結果を表６に示す。
マウスにP.ウリナリア抽出物を各々70、84、100、120お
よび144mg/kg体重の量で腹腔内投与した。投与７日後に
マウスの致死および内部臓器の異常の可否を観察した。
その結果を表６に示す。
表６からわかるように、P.ウリナリア抽出物は70mg/k
g体重の量で腹腔内投与したとき毒性を示さなかった
が、これは体重50kgであるヒトに抽出物3,500mgを腹腔
内投与したことに該当する。
g体重の量で腹腔内投与したとき毒性を示さなかった
が、これは体重50kgであるヒトに抽出物3,500mgを腹腔
内投与したことに該当する。
試験例6:P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物が
正常のマウスの肝機能に及ぼす影響 体重約200gのマウス３匹にP.ウスリエンシスおよびP.
ウリナリア抽出物の２％水溶液を２日間飲料水の代わり
に経口投与した後、血液試料を採取した。その後、sGOT
（serum glutamic oxaloacetic transaminase）、sGPT
（serum glutamic pyruvic transaminase）、血清アル
カリ性ホスファターゼ（ALP）および血清ビリルビン活
性をAST/GOT、ALT/GPT、ALPおよび血清ビリルビン診断
キット（Sigma Chemicals Co.,U.S.A.）を用いて製造者
のプロトコールに従って測定した。
正常のマウスの肝機能に及ぼす影響 体重約200gのマウス３匹にP.ウスリエンシスおよびP.
ウリナリア抽出物の２％水溶液を２日間飲料水の代わり
に経口投与した後、血液試料を採取した。その後、sGOT
（serum glutamic oxaloacetic transaminase）、sGPT
（serum glutamic pyruvic transaminase）、血清アル
カリ性ホスファターゼ（ALP）および血清ビリルビン活
性をAST/GOT、ALT/GPT、ALPおよび血清ビリルビン診断
キット（Sigma Chemicals Co.,U.S.A.）を用いて製造者
のプロトコールに従って測定した。
前記試験結果を下記表７に示す。
前記表７からわかるように、P.ウスリエンシスおよび
P.ウリナリアの抽出物は肝機能の指標であるsGOT、sGP
T、ALTおよびビリルビン濃度を変更しなかったため、正
常のマウスの肝機能に悪影響を与えないことが確認され
た。
P.ウリナリアの抽出物は肝機能の指標であるsGOT、sGP
T、ALTおよびビリルビン濃度を変更しなかったため、正
常のマウスの肝機能に悪影響を与えないことが確認され
た。
試験例7:P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の
変異原性（Ames試験） P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の変異原
性はエームス（Ames,B.n.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.
U.S.A.,72,2433−2427（1975））およびナガオら（Naga
o,M.,et al.,Ann.Rev.Genet.,12,117−159（1978））の
方法に従って測定した。
変異原性（Ames試験） P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の変異原
性はエームス（Ames,B.n.,et al.,Proc.Nat.Acad.Sci.
U.S.A.,72,2433−2427（1975））およびナガオら（Naga
o,M.,et al.,Ann.Rev.Genet.,12,117−159（1978））の
方法に従って測定した。
サルモネラタイヒムリウム（Salmolella typhimuriu
m）TA100とTA98はエームスらによって開発されたヒスチ
ジン栄養要求性変異株であるが、環境性マイトジェンま
たは発癌物質と接触してヒスチジン非要求株に変るた
め、マイトジェンの調査に用いられる。
m）TA100とTA98はエームスらによって開発されたヒスチ
ジン栄養要求性変異株であるが、環境性マイトジェンま
たは発癌物質と接触してヒスチジン非要求株に変るた
め、マイトジェンの調査に用いられる。
P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリア抽出物を2000mg
/100mlの濃度で蒸留水に溶かした後、各々５、10、50お
よび100μｌずつをジメチルスルホキシド（DMSO）と混
合して最終容量を100μｌにした。
/100mlの濃度で蒸留水に溶かした後、各々５、10、50お
よび100μｌずつをジメチルスルホキシド（DMSO）と混
合して最終容量を100μｌにした。
マウスの肝100gに0.15M KCL 10mlを加え、Potter−El
vejhem型ホモギナイザーを用いて均質化した。均質液を
9000xgで10分間遠心分離して微粒子分画を得、これをS9
分画と命名した。S9分画をマイトジェンまたは発癌性物
質の活性化のために用い、そのタンパク質量を4mg％に
調節した。
vejhem型ホモギナイザーを用いて均質化した。均質液を
9000xgで10分間遠心分離して微粒子分画を得、これをS9
分画と命名した。S9分画をマイトジェンまたは発癌性物
質の活性化のために用い、そのタンパク質量を4mg％に
調節した。
前記で製造した抽出物溶液を各々二つの試験管に0.5m
lずつ入れた。試験管を二つの群に分けた後、一群の試
験管にはS9分画0.5mlおよび50μmolリン酸塩緩衝液（pH
7.4）0.5mlを加え、一方、他群の試験管には何も加えな
かった。各試験管に２μM NADH、２μmol NADPH、2.5μ
mo1グルコース−６−ホスフェート、0.25単位グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、４μM MgCl2
および16.5μM KClを含む0.5mlのリン酸塩緩衝液（pH7.
4）を加えて微生物活性化溶液1mlを調製した。
lずつ入れた。試験管を二つの群に分けた後、一群の試
験管にはS9分画0.5mlおよび50μmolリン酸塩緩衝液（pH
7.4）0.5mlを加え、一方、他群の試験管には何も加えな
かった。各試験管に２μM NADH、２μmol NADPH、2.5μ
mo1グルコース−６−ホスフェート、0.25単位グルコー
ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、４μM MgCl2
および16.5μM KClを含む0.5mlのリン酸塩緩衝液（pH7.
4）を加えて微生物活性化溶液1mlを調製した。
各試験管中にTA100またはTA98菌株2x108細胞を含む培
養液0.1mlを加え、試験管を37℃で20分間放置した。各
試験管の内容物を45℃で2ml寒天溶液（0.7％寒天（aga
r）、0.6％NaCl）と混合し、混合物を直ちに寒天プレー
ト上に塗布した。プレートを37℃で二日間培養した後、
ヒスチジン非要求株の発生を検査した。
養液0.1mlを加え、試験管を37℃で20分間放置した。各
試験管の内容物を45℃で2ml寒天溶液（0.7％寒天（aga
r）、0.6％NaCl）と混合し、混合物を直ちに寒天プレー
ト上に塗布した。プレートを37℃で二日間培養した後、
ヒスチジン非要求株の発生を検査した。
比較試験として、抽出物溶液の代わりにDMSO中の２−
（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アク
リロアミド（“AF−2"）100μｌ（0.01μg/μｌ）を用
いて前記と同様の手順を繰り返した。AF−２は発癌性物
質として知られている（Sugimura,T.and Nagao,M.,Modi
fication of Mutagenic Activity,in:F.J.de Serres an
d A.Hollaender（Eds.）,Chemical Mutagens,Principle
s and Methods for their Protection,Vol.6,Plenum,Ne
w,York,pp41−60,1980）。また、抽出物またはAF−２を
使用せずに対照実験を行った。
（２−フリル）−３−（５−ニトロ−２−フリル）アク
リロアミド（“AF−2"）100μｌ（0.01μg/μｌ）を用
いて前記と同様の手順を繰り返した。AF−２は発癌性物
質として知られている（Sugimura,T.and Nagao,M.,Modi
fication of Mutagenic Activity,in:F.J.de Serres an
d A.Hollaender（Eds.）,Chemical Mutagens,Principle
s and Methods for their Protection,Vol.6,Plenum,Ne
w,York,pp41−60,1980）。また、抽出物またはAF−２を
使用せずに対照実験を行った。
抽出物は形成されたコロニーの数が対照群に比べて２
倍以上であるときマイトジェン性と判断した。
倍以上であるときマイトジェン性と判断した。
各実験は２回繰り返し、抽出物のマイトジェン性は二
つの試験の平均値に基づいて判定した。その結果を下記
表８に示す。
つの試験の平均値に基づいて判定した。その結果を下記
表８に示す。
表８からわかるように、P.ウスリエンシスおよびP.ウ
リナリアの抽出物はAmes試験で陰性結果を示したため、
この抽出物はマイトジェン性がないと決定した。
リナリアの抽出物はAmes試験で陰性結果を示したため、
この抽出物はマイトジェン性がないと決定した。
試験例8:イヌを用いたP.ウスリエンシスおよびP.ウリナ
リア抽出物の毒性試験 各々の体重が約12kgである雄１匹、雌１匹からなる韓
国産雑種犬の２群に製造例に従って製造したP.ウスリエ
ンシスおよびP.ウリナリア抽出物を毎日２回ずつ200mg/
kg体重の量で120日間経口投与した。その後、各イヌか
ら血液試料を採取し、Autochemical Analyzer（Dupont,
U.S.A.,Dimension 380）を用いて表９に記載した種々の
肝機能を検査した。２匹の平均値を表９に示す。
リア抽出物の毒性試験 各々の体重が約12kgである雄１匹、雌１匹からなる韓
国産雑種犬の２群に製造例に従って製造したP.ウスリエ
ンシスおよびP.ウリナリア抽出物を毎日２回ずつ200mg/
kg体重の量で120日間経口投与した。その後、各イヌか
ら血液試料を採取し、Autochemical Analyzer（Dupont,
U.S.A.,Dimension 380）を用いて表９に記載した種々の
肝機能を検査した。２匹の平均値を表９に示す。
前記表９からわかるように、P.ウスリエンシスおよび
P.ウリナリア抽出物は120日間これを投与したイヌの肝
機能に何ら異常を惹起しなかった。
P.ウリナリア抽出物は120日間これを投与したイヌの肝
機能に何ら異常を惹起しなかった。
また、イヌにP.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽
出物200mlを投与した後、30分、60分および120分後に血
液試料を採取し、HBsAb試験キット（Abbott,U.S.A.）で
HBsAbの出現可否を測定した。その結果を下記表10に示
す。
出物200mlを投与した後、30分、60分および120分後に血
液試料を採取し、HBsAb試験キット（Abbott,U.S.A.）で
HBsAbの出現可否を測定した。その結果を下記表10に示
す。
前記表10からわかるように、P.ウリナリア抽出物をイ
ヌに投与した場合にはHBsAb−陽性反応が観察された反
面、P.ウスリエンシス抽出物を投与した場合にはHBsAb
−陰性反応が観察された。また、イヌにP.ウスリエンシ
ス抽出物を投与した後P.ウリナリア抽出物を投与すると
HBsAb−陽性反応を示す反面、P.ウリナリア抽出物を投
与した後、P.ウスリエンシス抽出物を投与するとHBsAb
−陽性反応を示さなかった。したがって、P.ウリナリア
抽出物が生体内で血液中にHBsAb−様活性を示す成分を
含むという結論を下した。
ヌに投与した場合にはHBsAb−陽性反応が観察された反
面、P.ウスリエンシス抽出物を投与した場合にはHBsAb
−陰性反応が観察された。また、イヌにP.ウスリエンシ
ス抽出物を投与した後P.ウリナリア抽出物を投与すると
HBsAb−陽性反応を示す反面、P.ウリナリア抽出物を投
与した後、P.ウスリエンシス抽出物を投与するとHBsAb
−陽性反応を示さなかった。したがって、P.ウリナリア
抽出物が生体内で血液中にHBsAb−様活性を示す成分を
含むという結論を下した。
試験例9:ウッドチャック（wood chuck）モデルにおける
P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の活性 ヒトHBVと似ているWHV（woodchuck hepetitis viru
s）に感染したウッドチャック６匹にP.ウリナリア抽出
物を600mg/kg体重／日の容量で12週間投与し、所定の時
間に血清WHV DNA濃度（pg/ml）を測定した。投与前と投
与後のウッドチャックの血清WHV DNA濃度の変化を表11
に示す。
P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の活性 ヒトHBVと似ているWHV（woodchuck hepetitis viru
s）に感染したウッドチャック６匹にP.ウリナリア抽出
物を600mg/kg体重／日の容量で12週間投与し、所定の時
間に血清WHV DNA濃度（pg/ml）を測定した。投与前と投
与後のウッドチャックの血清WHV DNA濃度の変化を表11
に示す。
表11からわかるように、投与５週間前にウッドチャッ
クのWHV DNAの濃度は試験群8,200〜2,900pg/ml、対照群
12,000〜1,300pg/mlであり、投与直前には試験群9,100
〜2,200pg/ml、対照群13,000〜1,300pg/mlであった。し
かし、P.ウリナリア抽出物の投与12週間後対照群のWHV
DNA濃度は11,000〜1,300pg/mlと高いままであったが、
試験群のWHV DNA濃度は６つの試験群中４群において220
−7pg/mlと著しく低い値に減少した。
クのWHV DNAの濃度は試験群8,200〜2,900pg/ml、対照群
12,000〜1,300pg/mlであり、投与直前には試験群9,100
〜2,200pg/ml、対照群13,000〜1,300pg/mlであった。し
かし、P.ウリナリア抽出物の投与12週間後対照群のWHV
DNA濃度は11,000〜1,300pg/mlと高いままであったが、
試験群のWHV DNA濃度は６つの試験群中４群において220
−7pg/mlと著しく低い値に減少した。
試験例10:P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物
の臨床的効果 P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の臨床的
効果は健康なHBV保菌者、軽度の慢性肝炎を有すると推
定されるHBV保菌者および肝硬変が併発した慢性活動性
Ｂ型肝炎患者を試験対象として次のようにして調査し
た。
の臨床的効果 P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリア抽出物の臨床的
効果は健康なHBV保菌者、軽度の慢性肝炎を有すると推
定されるHBV保菌者および肝硬変が併発した慢性活動性
Ｂ型肝炎患者を試験対象として次のようにして調査し
た。
（１）健康なHBV保菌者 HBsAg（＋）HBsAb（−）HBeAg（＋）HBeAb（−）であ
る以外は肝機能試験で比較的正常の結果を示した健康な
HBV保菌者にP.ウリナリア抽出物を１日３回40mg/kg体重
／日の量で24ヶ月間投与した。各単位投与量、すなわ
ち、１日容量の３分の１を水50mlに溶かした後、食後１
時間に投与した。治療中血清学的指標の変化を表12に示
す。
る以外は肝機能試験で比較的正常の結果を示した健康な
HBV保菌者にP.ウリナリア抽出物を１日３回40mg/kg体重
／日の量で24ヶ月間投与した。各単位投与量、すなわ
ち、１日容量の３分の１を水50mlに溶かした後、食後１
時間に投与した。治療中血清学的指標の変化を表12に示
す。
表12からわかるように、治療を開始してから9.5ヶ月
以後にHBsAb−陽性反応が観察された反面、放射性同位
元素法キット（Sorin Biomedica Co.,Italy）を用いて
製造者のプロトコールに従って測定すると、血清はHBsA
b−陰性であった。また、HBeAbおよび血清HBV DNAは治
療2.5ヶ月後に各々陽性および陰性として検出された。
以後にHBsAb−陽性反応が観察された反面、放射性同位
元素法キット（Sorin Biomedica Co.,Italy）を用いて
製造者のプロトコールに従って測定すると、血清はHBsA
b−陰性であった。また、HBeAbおよび血清HBV DNAは治
療2.5ヶ月後に各々陽性および陰性として検出された。
（２）軽度の慢性肝炎が推定されるHBV保菌者 肝機能検査においてHBsAg（＋）HBsAb（−）HBeAg
（＋）HBeAb（−）anti−HBc（−）の結果に基づいて慢
性活動性肝炎を患っていると推定され、GOTが警戒領域
に属する23.9、GPTが警戒領域に属する63.0を示す患者
に、P.ウスリエンシス抽出物を11ヶ月間投与した後、P.
ウリナリア抽出液を17ヶ月間投与した。抽出物の容量お
よび投与方法は前記（１）と同じであった。
（＋）HBeAb（−）anti−HBc（−）の結果に基づいて慢
性活動性肝炎を患っていると推定され、GOTが警戒領域
に属する23.9、GPTが警戒領域に属する63.0を示す患者
に、P.ウスリエンシス抽出物を11ヶ月間投与した後、P.
ウリナリア抽出液を17ヶ月間投与した。抽出物の容量お
よび投与方法は前記（１）と同じであった。
治療中血清学的指標の変化を表13に示す。
表13からわかるように、P.ウスリエンシス抽出物を投
与してから１ヶ月後にHBV感染指標はHBsAg（＋）HBsAb
（−）HBeAg（＋）HBeAb（−）およびHBV DNA（＋）の
状態を維持し、GOTおよびGPT値は警戒領域にとどまっ
た。しかし、P.ウスリエンシス抽出物を投与してから４
ヶ月後にはHBV DNAが検出されなくなり、他の指標は変
化しなかった。
与してから１ヶ月後にHBV感染指標はHBsAg（＋）HBsAb
（−）HBeAg（＋）HBeAb（−）およびHBV DNA（＋）の
状態を維持し、GOTおよびGPT値は警戒領域にとどまっ
た。しかし、P.ウスリエンシス抽出物を投与してから４
ヶ月後にはHBV DNAが検出されなくなり、他の指標は変
化しなかった。
P.ウリナリア抽出物を投与したとき、治療３ヶ月後に
HBsAb−陽性反応が観察されたが、放射性同位元素法を
用いると、HBsAb−陰性結果が得られた。この結果はP.
ウリナリア抽出物中にHBsAgに特異的に結合するHBsAb−
類似物質が存在することを示唆する。また、P.ウリナリ
ア抽出物を投与している間、HBsAbおよび血清中HBV DNA
は常に各々陽性および陰性が検出された。
HBsAb−陽性反応が観察されたが、放射性同位元素法を
用いると、HBsAb−陰性結果が得られた。この結果はP.
ウリナリア抽出物中にHBsAgに特異的に結合するHBsAb−
類似物質が存在することを示唆する。また、P.ウリナリ
ア抽出物を投与している間、HBsAbおよび血清中HBV DNA
は常に各々陽性および陰性が検出された。
（３）肝硬変を併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者 肝機能検査において、GOT/GPT＝129/184、HBsAg
（＋）HBeAg（＋）HBsAb（＋）HBeAb（−）を示す肝硬
変を併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者にP.ウリナリア抽
出物を（１）と同様の手順に従って３ヶ月間投与した。
治療中血清学的指標の変化を表14に示す。
（＋）HBeAg（＋）HBsAb（＋）HBeAb（−）を示す肝硬
変を併発した慢性活動性Ｂ型肝炎患者にP.ウリナリア抽
出物を（１）と同様の手順に従って３ヶ月間投与した。
治療中血清学的指標の変化を表14に示す。
表14からわかるように、P.ウリナリア抽出物を用いた
治療３ヶ月後にHBV DNA−陰性反応が観察され、トラン
スアミナーゼ値は非常によくなった。しかし、患者は肝
硬変を併発しているため継続的な観察が必要であった。
治療３ヶ月後にHBV DNA−陰性反応が観察され、トラン
スアミナーゼ値は非常によくなった。しかし、患者は肝
硬変を併発しているため継続的な観察が必要であった。
前記試験例の結果からわかるように、P.ウスリエンシ
スおよびP.ウリナリアの水性抽出物は毒性がほとんどな
く、副作用を惹起しない効果的なHBV治療剤として用い
られ得る。
スおよびP.ウリナリアの水性抽出物は毒性がほとんどな
く、副作用を惹起しない効果的なHBV治療剤として用い
られ得る。
製剤例:P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物
を含む医薬製剤 （１）P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を
含むカプセルの製造 下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した： 量 （mg/カプセル） 活性成分 800 （P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物） 乾燥澱粉 1100 ステアリン酸マグネシウム 100 総量 2000mg 前記成分を混合し、2000mg単位量で硬質ゼラチンカプ
セルに充填した。
を含む医薬製剤 （１）P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物を
含むカプセルの製造 下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した： 量 （mg/カプセル） 活性成分 800 （P.ウスリエンシスまたはP.ウリナリアの抽出物） 乾燥澱粉 1100 ステアリン酸マグネシウム 100 総量 2000mg 前記成分を混合し、2000mg単位量で硬質ゼラチンカプ
セルに充填した。
（２）P.ウスリエンシスおよびP.ウリナリアの抽出物を
含むカプセルの製造 下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した： 量 （mg/カプセル） 活性成分 P.ウスリエンシスの抽出物 200 P.ウリナリアの抽出物 600 乾燥澱粉 1100 ステアリン酸マグネシウム 100 総量 2000mg 前記成分を混合し、2000mg単位量で硬質ゼラチンカプ
セルに充填した。
含むカプセルの製造 下記成分を用いて硬質ゼラチンカプセルを製造した： 量 （mg/カプセル） 活性成分 P.ウスリエンシスの抽出物 200 P.ウリナリアの抽出物 600 乾燥澱粉 1100 ステアリン酸マグネシウム 100 総量 2000mg 前記成分を混合し、2000mg単位量で硬質ゼラチンカプ
セルに充填した。
本発明を前記具体的態様に関連させて記述したが、当
分野の熟練者によって本発明に対する多様の変形および
変化させるとができ、これらもまた添付の特許請求範囲
によって定義される本発明の範囲内に属する。
分野の熟練者によって本発明に対する多様の変形および
変化させるとができ、これらもまた添付の特許請求範囲
によって定義される本発明の範囲内に属する。
フロントページの続き (56)参考文献 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．126，ｎｏ. ４，ｐｐ．350−352 Ｓｅｕｏｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｓ，ｖｏｌ．20，ｎｏ．０，ｐｐ21−31 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A61K 35/78 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)
Claims (2)
- 【請求項１】Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）保菌者またはＢ
型肝炎患者の血液からHBVのDNAを除去する、韓国固有の
フィラントゥス ウスリエンシス（Phyllanthus ussuri
ensis）またはフィラントゥス ウリナリア（Phyllanth
us urinaria）の水性抽出物。 - 【請求項２】治療的有効量の韓国固有のフィラントゥス
ウスリエンシス（Phyllanthus ussuriensis）または
フィラントゥス ウリナリア（Phyllanthus urinaria）
の水性抽出物を含む、Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）保菌者
またはＢ型肝炎患者の血液からHBVのDNAを除去するため
の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PCT/KR1996/000135 WO1998007437A1 (en) | 1996-08-16 | 1996-08-16 | PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR THE TREATMENT OF HEPATITIS B COMPRISING EXTRACT OF PHYLLANTHUS USSURIENSIS AND/OR $i(PHYLLANTHUS URINARIA) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000511928A JP2000511928A (ja) | 2000-09-12 |
| JP3249136B2 true JP3249136B2 (ja) | 2002-01-21 |
Family
ID=19449053
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51060198A Expired - Fee Related JP3249136B2 (ja) | 1996-08-16 | 1996-08-16 | フィラントゥス ウスリエンシスおよび／またはフィラントゥス ウリナリアの抽出物を含むｂ型肝炎治療用医薬組成物 |
Country Status (3)
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|---|---|
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| GB (1) | GB2331460B (ja) |
| WO (1) | WO1998007437A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR200100642T2 (tr) | 1998-08-25 | 2001-07-23 | Yale University | Helioksantin ve analogları ile hepatit B virüsü ve flavivirüsün engellenmesi ve tedavisi. |
| WO2000027413A1 (en) * | 1998-11-11 | 2000-05-18 | Hepaguard Co., Ltd. | Pharmaceutical composition for the treatment of hepatitis b comprising corilagin or brevifolin carboxylic acid |
| AU6013400A (en) * | 2000-06-16 | 2001-12-24 | Balakrishnan Arun | Lignan compounds with antiproliferative properties |
| DE10120627A1 (de) * | 2001-04-26 | 2002-10-31 | Cmi Ag | Verwendung von Phyllanthusbestandteilen zur Behandlung oder Prophylaxe von Infekten durch Hepatitis B-Viren |
| KR101559301B1 (ko) | 2014-02-25 | 2015-10-12 | 강원대학교산학협력단 | 여우구슬 추출물 및 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 엔테로 바이러스 또는 콕사키 바이러스 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
| WO2019193381A1 (en) * | 2018-04-05 | 2019-10-10 | Thi Trieu NGUYEN | Composition for treating hepatitis b |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4673575A (en) * | 1985-04-26 | 1987-06-16 | Fox Chase Cancer Center | Composition, pharmaceutical preparation and method for treating viral hepatitus |
| US5529778A (en) * | 1994-09-13 | 1996-06-25 | Rohatgi; Surendra | Ayurvedic composition for the prophylaxis and treatment of AIDS, flu, TB and other immuno-deficiencies and the process for preparing the same |
-
1996
- 1996-08-16 WO PCT/KR1996/000135 patent/WO1998007437A1/en active Application Filing
- 1996-08-16 GB GB9903338A patent/GB2331460B/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-16 JP JP51060198A patent/JP3249136B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１２６，ｎｏ．４，ｐｐ．３５０−３５２ |
| Ｓｅｕｏｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｖｏｌ．２０，ｎｏ．０，ｐｐ２１−３１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2331460B (en) | 1999-12-22 |
| GB9903338D0 (en) | 1999-04-07 |
| GB2331460A (en) | 1999-05-26 |
| WO1998007437A1 (en) | 1998-02-26 |
| JP2000511928A (ja) | 2000-09-12 |
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