JP2725813B2

JP2725813B2 - 芳香族多環式ジオンを含有する抗ウイルス性薬剤及びレトロウイルス感染治療方法

Info

Publication number: JP2725813B2
Application number: JP63507109A
Authority: JP
Inventors: ラビー，デビッド; メリュエロ，ダニエル; ラビー，ガッド; レイベル，ミッチェル; ベルデ，ヴィンセントバンデ; ロットマン，ダリア
Original assignee: IEDA RISAACHI ANDO DEV CO Ltd; NYUUYOOKU UNIV
Current assignee: IEDA RISAACHI ANDO DEV CO Ltd; NYUUYOOKU UNIV
Priority date: 1987-08-10
Filing date: 1988-08-03
Publication date: 1998-03-11
Anticipated expiration: 2013-03-11
Also published as: ATE90558T1; DE3881864D1; JPH02501220A; DE3881864T2; EP0332679A4; WO1989001329A1; AU631525B2; ZA885838B; FI891665A; CA1329133C; AU2301288A; DK167489D0; EP0332679A1; DK167489A; NZ225724A; DE332679T1; FI891665A0; EP0332679B1

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は抗ウイルス性芳香族ジオン化合物を含む薬剤
及びそれを使用した方法に関する。

背景技術多年にわたり抗ウイルス性療法の分野では宿主細胞に
は何ら損傷を与えずにその宿主細胞内に侵入したウイル
スがそのなかで増殖することを阻害してしまう作用を持
つ薬が求められてきた。ウイルスの子孫に遺伝させるた
め細胞の生化学的機作を占有し、細胞を身体的に侵害す
るウイルスの能力はそのようなウイルスの選択的な抑制
の根據を形成できるような独特な生化学的な態様を示す
のは僅かである。その僅かの化合物のみ選択性の抗ウイ
ルス性活性を持つことが知られていて、特にアジドチミ
ジン（AZT），ジデオキシシチジン，アシクロビア，リ
バビリン及びビハラジンのような抗ウイルス性治療薬剤
の広汎な種類があり、ウイルスが細胞機能を阻害できる
よりも薬剤がさらに有効にウイルスの機能を阻害できる
という事実は薬剤の選択的な毒性に負っている。一般的
にこれらの薬剤はウイルス性のポリメラーゼ，ホスホリ
ラーゼ，及びヌクレオチドキナーゼを目標にしている。
これらの薬剤の使用はウイルス性活性の範囲が狭いため
に、長時間にわたって宿主有機体に対し系統的に投与さ
れるときには副作用の毒性のために限定されている。

インタフェロンは抗ウイルス性ポリペプチドであり、
最近ヒトに対して治療に実験的に使用されているが、し
かしながら現状では治療的価値は限定されているように
思われる。ヒトのインタフェロンの精製と純化にはうん
ざりするほどの過程が必要とされ、利用できる量は限定
され、細胞毒性が起こることも知られている。

最近、レトロウイルスに活性である薬剤を発見するこ
とは特に、ヒトの免疫欠損ウイルス（HIV）が後天性免
疫欠損症候群を引きおこすので非常に重要になってきて
いる。

それ故に、技術は定常的に新しい抗ウイルス性薬剤を
探究しつづけられ、レトロウイルスに対して有効な特殊
な薬剤が追求されている。それらの薬剤は低い細胞毒性
を有して高度のウイルス殺傷力を発揮し、多くの通常の
抗−ウイルス性製剤に対して抵抗性があることが証明さ
れている。

発明の目的本発明の目的は抗ウイルス性活性及び低細胞毒性を有
する治療薬剤を提供することである。

本発明の他の目的はレトロウイルスにより生じる病気
及びレトロウイルス感染に苦しむ哺乳類動物を治療する
ために抗ウイルス性薬剤を使用する方法を提供すること
である。

本発明のさらに他の目的はレトロウイルス感染に苦し
む哺乳類動物を治療するための薬剤を提供するものであ
る。

発明の要約或る芳香族多環式ジオン化合物，ヒペリシン及びプソ
イドヒペリシンにより例証され、家族性ヒペリシウム
（Family Hypericum St.Johnswort）の植物に存在し、
植物のオトギリソウ科の薬草Hypericum triquetrifoliu
mから遊離されてきた芳香族多環式ジオン化合物は、例
えばブレンド白血病ウイルス（Friend Leukemia Virus
（FV）），放射線白血病ウイルス（Radiation Leukemia
Virus（RadLV）及びヒト免疫欠損ウイルス（human imm
unodeficiency Virus（HIV.またはHTLV IIIとして公知
である））を含むレトロウイルスに対して有効であるこ
とは思いがけない発見であった。

本発明はヒペリシン，プソイドヒペリシンまたはその
混合物によるそのようなウイルスを抑制するのに有効な
量を含むレトロウイルスにより生じた病気で苦しむ哺乳
類動物を治療する薬剤を提供するものである。その製剤
はまた生理学的に受け入れられる担体及び塩類を含有で
きる。別の観点として本発明ははヒペリシン，プソイド
ヒペリシンまたはその混合物によるレトロウイルス治療
のための有効量をレトロウイルス感染で苦しむ哺乳類動
物に投与することからなり、レトロウイルスにより生じ
る病気で苦しむ哺乳類動物の治療方法を提供するもので
ある。

本発明は当業者にとって詳細な説明、請求の範囲及び
図面に照らして明白になるであろう。

図面の簡単な説明第１図はヒペリシンの化学構造を示す図である。

第２図はプソイドヒペリシンの化学構造を示す図であ
る。

第３図はプソイドヒペリシンで治療した後放射性白血
病ウイルス感染マウス細胞の逆転写酵素活性の抑制を説
明する棒グラフである。

発明の詳細な説明ヒペリシン及びプソイドヒペリシンを含む或る芳香族
多環式ジオンは抗ウイルス性薬剤であり、レトロウイル
スに対して活性が高い。、抗−レトロウイルス薬剤は多
年性植物のHypericum triquetrifoliumから遊離されて
きた。

ここで使用されるレトロウイルスなる述語はRNAゲノ
ム及びRNA−従属DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）酵素活
性を含むウイルスに参照させられる。すべてのレトロウ
イルスは単一ウイルス家族のなかに含まれ、形態学的，
生化学的及び物理的性質を持っている。これらのパラメ
ータを表Ａに以下集約する。

すべてのレトロウイルスは同様な包括的な科学的組成
を持っている。一般に、レトロウイルスは約60-70％の
タンパク質,30-40％の脂質,2〜４％の炭水化物及び約１
％のRNAから成っている。レトロウイルス粒子の被膜は
細胞−表面膜から誘導され、ウイルス粒子における脂質
の大部分はビリオンの単位薄膜皮膜のために位置してい
る。レトロウイルスの非制限的例にはフレンド白血病ウ
イルス（FV），放射線白血病ウイルス（RadLV）及びヒ
トの免疫欠損ウイルス（HIV）がある。

本発明の芳香族多環式ジオン化合物がフレンド白血病
ウイルスや放射線白血病ウイルスの複製をマウスについ
て生体内，試験管内の両方で抑制することは以外な発見
であった。さらに驚くべきことは抑制が以下の実施例に
示すように哺乳類動物の受容に対して重要な毒性なしに
起こるということである。そこでは酵素レベルのような
ラクテートデハイドロゲナーゼ（LDH）及び血清グル
タミルアミノトランスフェラーゼ（SGOT）及びこれら
のビリルピン（胆汁）のような肝臓機能検査はフレンド
白血病ウイルス感染により増殖し、（及びこのウイルス
の病原性作用と会合しているが）本発明の抗ウイルス性
化合物の投与の後には正規値に近づき戻っている。

メルクインデクス（10版710頁）にはヒペリシンが
抗抑制剤であり、小量でもヒトの有機体に毒性及び精神
安定効果を持つらしいことが記載されている。さらに、
ヒペリシンは摂取により光感受性を生じると言われてい
る;Oxford,Raistick Biochem J.34.790（1940）．ヒペリシン及びプソイドヒペリシンはレトロウイルス
感染後のマウスに対する投与のときにいずれも抗ウイル
ス性活性を示す。以下の実施例IIに示すようにヒペリシ
ンはマウスにおけるRadLV感染を抑制するのに効果があ
ったし、プソイドヒペリシンはマウスにおけるFV感染に
対する抑制活性を示した。さらに、ヒペリシンとプソイ
ドヒペリシンの50:50の混合物は以下実施例（２）に示
されるように培養においてRadLV−感染マウス細胞の逆
転写酵素の酵素活性の完全抑制を導いた。同一レベルの
抑制はヒペリシンまたはプソイドヒペリシン単独のいず
れでも投与により達成できる。

芳香族多環式ジオンはヒトに対して精神安定剤として
以前投与されてきたので血液−脳障害に交差する可能性
があると思われる。このことはHIVの場合において、脳
及び中央神経系統の感染が個人感染で観察されてきたた
めに重要である。またHIVが脳及び中央神経系統の細胞
を感染できることはよく知られている。事実、最近、gp
120はウイルス的に記号化したポリペプチドであり、直
接ニューロン有機体の細胞に対して細胞毒性があること
が知られている。それ故にこれらのウイルス薬剤により
生じる病気で苦しむ哺乳類動物の治療は本発明の最も重
要な応用である。

ヒペリシン及びプソイドヒペリシンは芳香族多環式ジ
オンであり、レトロウイルスにより生じた感染により苦
しむ哺乳類動物の治療に用いることができる。これらの
抗ウイルス性ジオン化合物は以下実施例Ｉで詳しく示さ
れるようにオトギリソウ科の薬草でヒペリシンを含有す
るHypericumの植物から抽出によって得られる。またはB
rockmann.M.et al,U.S.特許No.2,707,704 1955年５月３
日発行及びBrockmann,H.et al Tetrahedron Letters
23:1991-1994.1974,の方法を使用することにより化学的
に合成することができる。これらの文献を引例としてこ
こに挿入する。世界全土でのSt.Johnswort植物の有効性
と広汎な分布のために、比較的に便利で高価でない方法
が以下実施例Ｉで本発明の化合物の抽出及び純化が詳し
く説明される。抽出方法は小量（例えばグラム）が望ま
れるときに好ましく、大量生産の製造に対して（キログ
ラム及びそれ以上）は化学合成が望ましい。

Hypericumは家族型Guttifereaeから１つの属である。
それはまた家族型Hypericaceae及びClusiaceaeに関係し
ているとされてきた。その属は地理的にはるかに広汎に
分布し、エーテル含有油として知られ、赤い蛍光色素の
小腺の産出が知られている。植物のHypericum属は非常
に広汎な面積において中央及び東ヨーロッパ，アジヤ，
北及び南アフリカに成長することが報告されている。さ
らにアメリカ大陸，オーストラリヤ，ニュージーランド
の或る部分にもその産出が報告されている。植物は「ア
メリカ野生花に対するAudubon Society Field GuidのEa
ster Region」pg.558.Chanticleer Press,Inc.NY.のな
かに索引されている。この文献を引例としてここに挿入
する。

芳香族多環式ジオンは後天性免疫欠損症候群（AIDS）
で苦しむ哺乳類動物の治療に用いることができる。その
効力及び細胞毒性が無いために芳香族多環式ジオンはこ
れらの病気に対して特異的な抗ウイルス性治療薬剤とし
て使用されるであろう。これらレトロウイルス感染を治
療するために併発的な細胞毒性のない、利用できる、広
汎な範囲を有する薬剤は存在していない。

本発明はさらに抗ウイルス活性を有するヒペリシン及
びプソイドヒペリシンの塩類または他の誘導体を包含し
ている。塩基がアルカリまたはアミンである塩類は本発
明の範囲のなかに特に含まれている。

本発明によればレトロウイルスにより生じる感染で苦
しむ哺乳類動物を治療するときに、感染に感応する特殊
なレトロウイルスの治療のために最も有効な化合物（ま
たはその混合物）の投与は以下実施例IVで記載されてい
るようにヒトの免疫欠損ウイルスまたは実施例IIではFV
及びRadLVについて実験動物において記載したように日
常的実験法によって確認することができた。

レトロウイルスにより引きおこされるviremia（血の
流れのなかのウイルス）またはsepsis（体の液体のウイ
ルス汚染）のような先天性免疫欠損症候群（AIDS）の治
療に使用される時には本発明の芳香族多環式ジオン化合
物は口経的、局所的、または好ましくは非口経的に、最
も好ましくは静脈注射により投与され、その服用量は、
好ましくは治療当たり体重kg当たり約400と約4000マイ
クログラムの間であり、治療当たり体重kg当たり約200
マイクログラムと約12000マイクログラムの間で投与さ
れる。患者の病気を制御するのに必要とされる治療また
は服用量の回数及びその接続期間は患者の条件及び病気
の段階及び苛酷さに依存し、個人個人で変化するであろ
う。代表的な治療は本発明の化合物の１つまたはそれ以
上を体重1kg当たり約1000と約3000マイクログラムの静
脈注射の投与からなる。各治療に必要な全服用量は分割
して投与することもまた一回の投与で行うこともでき
る。抗ウイルス治療は１週に１回また２回、またはそれ
以上、患者の病気の段階及び患者の条件によって決めら
れ投与される。

本発明の芳香族多環式ジオン化合物は便宜的には固体
及び液体の薬剤（タブレット，カプセル，キャプレット
及び注射可能な及び口経的に投与できる液体）に混合さ
れ、膜ウイルス感染で苦しむ哺乳類動物を治療するのに
使用される。本発明の薬剤はすくなくとも活性成分の１
つとして上述した芳香族多環式ジオンまたはその混合物
の有効な抗ウイルス量を含んでいる。全服用量が１つま
たは複数のカプセル，タブレット，注射液またはその組
み合わせの投与により達成できるために各カプセル，タ
ブレットまたは注射液によって供給される有効服用量は
相対的には重要でない。そのような薬剤は薬学的に受け
入れられる担体，稀釈剤，充填剤，塩類及び使用される
服用量の形に依存して公知技術の他の材料を包含する不
活性な要素から成るものである。カプセルが用いられる
ときにはゼラチンまたは繊維素誘導体のような薬学的に
受け入れられる材料から構成できる。タブレットは公知
技術により固体の担体を使用する通常の方法で製剤する
ことができる。固体の担体としては例えば澱粉，糖，ベ
ントナイトまたは他の通常使用される担体が使用でき
る。例えば好ましい非口経服用量の形式は体重1kg当た
り0.2ミリグラム（200マイクログラム）と体重1kg当た
り約12ミリグラム（12000マイクログラム）との間の範
囲の芳香族多環式ジオンまたはその混合物を１つまたは
それ以上を含む無菌の等滲透圧的な生理食塩溶液から成
っている。プロピレングリコール，ベンジルアルコー
ル，エタノールまたは他の生理学的に受け入れられる有
機溶剤が稀釈剤，担体または溶媒として本発明の抗ウイ
ルス性化合物を含む固体及び液体の薬剤の調製に使用で
きる。ヒペリシン及びプソイドヒペリシンは別々にまた
は単一の服用量の形式で混合（組み合わせ）して投与で
き、または同時に共投与できる。使用される特別な製剤
の選択は特別な患者に最高に効く抗ウイルス性化合物ま
たは混合物を確認することにより決定されるであろう。

本発明の芳香族多環式ジオンは免疫系細胞,T−細胞ま
たはインタロイキン−2,細胞毒性薬剤のような因子，イ
ンタフェロンのようなリンパ循環または同類物であり、
レトロウイルスに対して有効性を持つことが知られてい
るものと共投与して完璧に適合できる。

本発明は特別な製造実施例を以下説明するがこれによ
って本発明の範囲が限定されるものではない。

実施例Ｉ ST.JOHNSWORTからのヒペリシン及びプソイドヒペリシン
の抽出ヒペリシン，（Ｃ₃₀Ｈ₁₆Ｏ₈，分子量504.43）はここ
はHyと略称し、プソイドヒペリシン（Ｃ₃₀Ｈ₁₆Ｏ₉，分
子量520.43）はPsとここに略称する。ヒペリシン及びプ
ソイドヒペリシンは次のようにして得られた。

全ST.JOHNSWORTの植物の薬草の開花時、東半球では７
月から10月にわたる間に刈り取られ、55℃で乾燥され、
切断され、粉砕された。そこでkg当たり約５−10lのア
セトンにより抽出された。材料1kgがソックスレー抽出
器（キーマックス．ニュージャージー州ニューブルンス
ビック，フィッシャサイエンティフィクから入手可
能）内に置かれ、約５から10時間、溶剤が無色になるま
で抽出された。芳香族多環式ジオンが含有する溶液は赤
色の蛍光を有し、引例としてここに挿入される２つの文
献Scheibe Schenlog．Ber.75:2019 1942,Brockmann,M.N
aturwiss 38:47,1951,に記載されているような吸収スペ
クトル及び蛍光スペクトルを持っている。

芳香族多環式ジオンを含有する溶剤は減圧下で蒸発
し、完全に残渣を乾燥し、残渣を95g得た。この残渣は
さらにシリカゲル60（0.06-0.20mm,イリノイ州マックガ
ウパークアメリカンサイエンティフィクプロダ
ックトマリンロード）を充填したクロマトグラフカラ
ムで分別した。乾式クロマトグラフィ法は上述のように
得られた残渣25grをアセトンの約500mlに溶解し、等量
のシリカゲル60に加えられ使用された。回転蒸発器rota
vapor（ブッチアメリカンサイエンティフィクプ
ロダクツ）により混合物が均一になるまで渦巻させなが
ら蒸発させ、乾燥した。シリカゲル60の1kgを含むカラ
ムの頂上にその混合物を置き、クロロホルムにより溶剤
がカラムの底に達すまで溶離させた。つづいてクロロホ
ルム−アセトン−メタノール,75:15:10（Vol/Vol/Vol）
の比からなる混合溶剤をもってそのカラムを洗浄した。
赤色が最初の強度の1/5になった時にクロロホルムの濃
度を下げ、カラムをクロロホルム−アセトン−メタノー
ル55:15:10（Vol/Vol/Vol）をもって溶離し、250mlの画
分が集められた。各画分は薄層クロマトプレート（VWR.
サンフランシスコカルフォルニア州）の上で検出さ
れ、254nmでの紫外線の下で２つの主な赤色の蛍光斑点
のRfが決定された。現像混合溶媒はクロロホルム−アセ
トン−メタノール,55:15:10であった。クロマトグラフ
は約２日で完結した。

さらに２つの主成分の精製及び分離は0.04-0.06メッ
シュのシリカゲル60を使用してガスクロマトグラフィに
記載された圧力でフラッシクロマトグラフの２つのラ
ウンドにより得られた。（ガスクロマトグラフィ．原
理、技術及び応用A.B.Littlewood.ed.Academic Press.N
ew York.1970.）このものを引例として挿入する。

２つの主成分のヒペリシン（Hy）はRfが0.45,0.19gの
収量であり、プソイドヒペリシン（Ps）はRfが0.35,0.7
3gの収量であった。この２成分のNMRスペクトルの分析
はこれまでに報告されたものと同一であった。（Brockm
ann,H,en al,Tetrahedron Letters 1:37,1975.文献は引
例として挿入される）。その化合物は使用するまで暗所
の無水エタノールのなかで４℃にて貯蔵された。

実施例II:哺乳類における抗ウイルス性活性レトロウイルスのフレンド白血病ウイルス（FV）及び
放射線白血病ウイルス（RadLV）による哺乳類動物の感
染に及ぼす本発明の化合物の効果は次のようにして試験
された。

（１）フレンド白血病ウイルス感染フレンド白血病ウイルス（FV）の積極的なレトロウイ
ルスはBALB/c及びNIH SWISSマウスのようなマウスの感
受性株に敏感な赤白血病を誘発する。（Friend,C.J.Ex
p．Med．105:307-324,1957;Friend,C.et al Nat.Cancer
Inst.Monogr.22:505-522,1966;Friend,C.et al Proc.N
atl.Acad.Sci.U.S.A.68:378-383,1971.ここにおいてす
べて文献は引例して挿入される。）悪性な形質転換（tr
onsformation）は脾腫病巣形成ウイルス（Spleen focus
forming virus（SFFV））及びエコトロピックネズミ
フレンド白血病ヘルパーウイルス（ecotropic murine
Friend Leukemia helper virus（Ｆ−MuLv））の結合
活性の結果である。敏感な赤白血病は肝臓脾腫（脾臓及
び肝臓の大きさが著しく増大すること）及び激しい貧血
症に特徴がある。

フレンド白血病ウイルスはウイルス静脈注射の10日
後、FVで前もって感染したマウスの拡大した脾腫を均質
化して製造した。脾腫は遊離脾腫の重量の10倍に等しい
容積の燐酸塩緩衝液生理食塩溶液のなかで均質化した。

Hy及びPsのBALB/cマウス（Jackson Labs,Bar Habor,M
E）の脾臓の大きさ（脾腫）の増大に及ぼす効果が試験
された。この実験においてウイルス（10⁶focus foming
unit-FFU（病巣形成単位））は静脈注射で接種された。
この発明の抗ウイルス性化合物の表示された服用量は内
腹膜的に24時間おくれてBALB/cマウスに投与された。動
物はそこで10日後に犠牲になり、脾臓の重さが量られ
た。その結果は第１表に要約されている。

第１表のデータはひきつづきPsのマウス当たり80マイ
クログラムの１回注射を行った平均抑制値の93.8％をも
って脾腫の抑制を示している。脾臓拡大における89.6％
の平均抑制値はマウス当たり80マイクログラムのPsがマ
ウスに対して１回の注射で投与されたときに観察され
た。その注射は前もってウイルス薬剤（ウイルスの２×
10⁵FFUに相当する）の0.5mlを接種した。日２回の連続
したPsの注射がマウス当たり80マイクログラムの化合物
を各々含むように投与された時には脾腫の平均抑制値は
10⁶FFUを含むウイルス薬剤では90.7％であり、２×10⁵F
FUを含むウイルス薬剤では81.7％であった。（第１表）上の結果はPsの内腹膜的投与が注射の24時間後、フレ
ンド白血病ウイルスの悪性な形質変換能力（脾腫の減少
を測定する）の著しい減少を示した。

（２）フレンド白血病ウイルスによる共投与 FV複合体と共にPsの同時的な静脈注射による共投与を
含む別の実験計画が試験された。この場合、ウイルス薬
剤は種々の濃度でPsと混合され、混合物は最終容積0.5m
lでマウスの尾の静脈に注射された。マウスは10日後に
犠牲になった。脾腫の重量を測定し、脾腫の抑制の水準
を決定した。その結果を第２表に要約した。

第２表に示されるように脾腫の100％抑制はPsがマウ
ス当たり20マイクログラム及びマウス当たり50マイクロ
グラム（平均マウス重量は約150グラム）の濃度のウイ
ルス複合体を投与したときに見出され、平均抑制値の7
5.44％はマウス当たり５マイクログラムの時にウイルス
に共投与された。

これらの結果は本発明の化合物の有効性を示すもので
あり、マウス当たり５マイクログラムと同じ位のすくな
くてもこの積極的なRAN腫瘍ウイルスによりウイルス形
質転換を抑制することに有効であった。

（３） FV感染動物の肝臓機能に及ぼすPsの効果肝臓機能に及ぼすPsの存在及び不存在におけるPsの抗
ウイルス性活性,FV感染の効果の実例として肝臓−関連
するタンパク質のために感染マウスの血清を分析するこ
とにより検査した。

BALB/cマウスは２×10⁵FFUの濃度でFVと共に接種され
た。各グループの動物は４匹のマウスであり、分析はプ
ールされた部分標本について行われた。

第３表においてBu＝全ビリルビン,AP＝アルカリホス
ファターゼ,LDH＝乳酸脱水素酵素,SGOT＝血清グルタミ
ルアミノトランスフェラーゼ,SGPT＝血清グルタミルペ
ンチジルトランスフェラーゼ,GGT＝ガンマ−グルタミル
−トランスペプチターゼ．第３表に示されるようにFVによる静脈注射の接種はLD
H,SGOT及びSGPT酵素活性を増加に導き、感染マウスにお
ける全血清ビリルビンの増加を導いている。そのような
増加は公知のように肝臓機能損失の指示である。静脈注
射及び内腹膜注射の両方のPsの投与はこれらのウイルス
的に誘起する増加を減少に導いている。

（４）放射線白血病ウイルス（RadLV）感染に及ぼす
抗ウイルス性効果マウスの感受性株におけるねずみの放射線白血病ウイ
ルスの胸腺接種は明白な白血病の発生及び胸腺細胞の悪
性形質転換を生じる。（Meruelo,D.et al J.Exp.Med.14
7:470-487この文献は引例として挿入される）この形質
転換はウイルスの白血病誘発効果に対して抵抗性または
罹患性を決定するところの主要な組織適合性複合体（MH
C）に関連することが示されている。

若干のマウス株におけるウイルス感染が続く初期の結
果にはグループI H−２抗原の細胞表面表現の劇的な増
加がある。この増加は白血病の次の発生及び悪性な形質
転換後のこれらの抗原の表現における減少による結果と
して生じる。Ｈ−２抗原表現における変化はウイルス感
染を検査し、このウイルスの感染レベルに及ぼすHy及び
Psの効果を決定するのに使用されてきた。

ねずみの放射線白血病ウイルス（RadLV）はMeruelo e
t al（前掲）において記載されるようにBIO.T（6R）マ
ウスに腹膜内的に接種された。６つのマウスのグループ
は等浸透圧の生理食塩水溶液中の腹膜内的に投与された
Hy化合物のマウス当たり30マイクログラムをもって24時
間後に治療した。マウスは10日後に犠牲になった。クラ
スI H−２抗原の表現は蛍光活性化セルソータ（cellsor
ter）（Ortho Cytofluorograph Model 50H,Ortho Diagn
ostic Systems,Westwood,MA）（FACS）を用いて、Ｘ−5
6 抗−Ｈ−2D^dマウスの単一な特異性の抗体（Meruelo,
et alにおいて記載されたもの、同様な抗体はATCC No.H
B75として入手できる。American Type Cultue Collecti
on,Rockville.MD）を使用して分析により決定された。
その結果は第４表に示した。

第４表におけるデータからみることができるようにHyは
６つの試験されたマウスの４つにおけるＨ−２表現での
増加において著しい抑制を与え（第４表），化合物Hyの
内腹膜の投与につづいてウイルスの感染能力の著しい減
少を示している。このことは最初のウイルス接種の後24
時間ほどおそく生起した。RadLVにより誘発されたＨ−
２表現に及ぼす効果は化合物Psについて見い出せなかっ
た。

実施例III:RNA−従属 DNAポリメラーゼ（逆転写酵素）
に及ぼすPs及びHyの効果レトロウイルス（RNA腫腸ウイルス）はビリオンのな
かに逆転写酵素を運ぶ。逆転写酵素はウイルスと共に細
胞の感染により鋳型としてのウイルスのRNAゲノムを用
いてビリオンRNAの相補的DNA（cDNA）複写を細胞合成器
及び転写器に補充している。レトロウイルスで感染した
細胞の成長媒体中での逆転写酵素（RT）活性のレベルの
決定は公知の方法であり、細胞により感染ウイルス粒子
の放出を評価し、本発明の成分の抗ウイルス活性を測定
するのに用いられてきた。Hy及びPsの化合物のml当たり
10マイクログラムの濃度でRadLV RT活性に及ぼすHy及び
Ps両方の混合物の効果を試験した。

２つの成分の混合物は2,4及び16時間の後の感染で投
与され、上清は採取され、Stephenson等による方法によ
りRT活性を検査した。（Stephenson et al,Virology 4
8:749-756,1972,及びWeissback et al,J.Virol.10:321-
327,1972,これらは引用例として挿入する）検査は次のように行われた。

ａ）ウイルスの製造 RadLV−感染リンパ芽球細胞ラインBIO.T（6R）は４℃
で、3500rpm.15分間遠心分離され、小球にされた。上清
（10ml）の上部の2/3が検査のため除去された。上清は1
2mlの超遠心分離用管のなかで４℃で１時間400000rpmの
回転数で遠心分離された。このために固定角度式超遠心
分離回転器（Ti70 Rotor,Beckman Instruments,Fullert
on,CA）が使用された。上清は注意深く傾斜し、その管
は乾燥された。小球は0.02MのTris/HCl,pH7.8,0.1MのNa
Cl,0.001Mのジチオトレイトール及び0.2％のTriton X-1
00を含む緩衝液の200マイクロリットルのなかに再懸濁
された。ウイルス含有小球及び緩衝液の混合物は渦巻さ
れ、使用される前に30分間氷の上で培養された。

逆転写酵素検査は容積100マイクロリッタのなかに次
の成分を含有させて行われた：反応混合物50マイクロリッタは上に得られた50マイク
ロリッタの上澄液と混合され、30℃で１時間培養した。
反応は0.1mlの0.06M燐酸ナトリウムを添加して停止さ
せ、渦巻させ、氷の中で培養した。0.3Mの燐酸ナトリウ
ムを含む2mlの10％トリクロロアセティク（TCA）が加え
られ、混合物は渦巻され、10から20分間氷の上で培養し
た。TCA−鋭敏−放射能はガラスファイバフィルタ（2.4
cm Whatman GFC.Whatman,Clifton,NJ）を使用して試料
を過した後に決定された。第３図にその結果が示され
ている。第３図におけるデータはHy及びPsの50:50の混
合物についてのウイルス感染細胞の培養を２時間及び４
時間のポスト感染における検出可能なRT活性におけるす
くなくとも50％減少に導き、さらに16時間のポスト感染
で検査されたときにはこの酵素は約75％抑制されたこと
を示している。

実施例IV:本発明の化合物によるHIVの培養 Ps,Hy及びその混合物のヒトの免疫欠損ウイルス（HI
V）に対する活性は次のやり方で検討できる。クローン
（Clone）H9のようなHIV−感染 OKT4＋リンパ芽球細胞
は（Popovic.M.,et al,Science 224:497-500,1984.こ
れを引例として挿入する）20％の子牛の胎児血精（Flow
Laboratories,Inglewood CA）を含有するRPMI-1640媒
体（GIBCO,GRAND Island,New York）のなかに保持され
る。細胞の三重の培養はml当たり約４×10⁵細胞の濃度
で種をつけ、Polybrene（ml当たり２マイクログラム.Si
gma Chemical Co.St.Louis,MO）にさらされ、４×10⁵H9
細胞当たり２×10⁸HTLV III粒子をもって感染させ、Ps,
Hy及びその混合物の存在または不存在において上記実施
例２と同様にして培養した。

本発明の化合物の抗ウイルス活性は逆転写酵素活性及
びHIVタンパク質p24及びp17の表現を検査することによ
り決定された。これはSarin,P.S.et al J．Nat．cancer
Inst．78:663-665,1987に記載されている。この文献
を引例として挿入する。

実施例V:HTLV III gagタンパク質p24及びp17の表現感染されてないまたはHTLV IIIに感染されたいずれか
のH9細胞（２×10⁵）は４日間ml当たり５から100マイク
ログラムの間の濃度でPs,Hy及びその混合物の種々な濃
度に対して連続的にさらされた。HTLV IIIのp24及びp17
gagタンパク質を表現する細胞の百分率はHTLV-III p17
及びp24に対するマウスのモノクロナール抗体を使用し
て蛍光抗体間接顕微鏡により決定された。（HTLV-III p
17及びp24はAbbott Labs.North Chicago.IL及びDupont,
Wilmington,DEからHIV血清抗原検出キットとして商業的
販売源から入手できる）陽性な細胞は蛍光標識した山羊
抗−マウスIgG（Cappell Laboratories,Cochranville
PA）で処理することにより視覚化される。実験はすく
なくとも３回重複して行われた。

実施例VI:逆転写酵素活性の決定感染されないH9またはHTLV-III（500ウイルス粒子／
細胞）により感染されたH9細胞は上述のようにPs,Hy及
びその混合物の種々な濃度でさらされた。４日間で、培
養の上清は集められ、ウイルス粒子はポリエチレングリ
コールにより沈澱され、FVのための実施例２で記載した
ように遠心分離により得られた。ウイルス粒子は50mMの
Tris-HCl（pH7.5）,5mMのジチオトレイトール,250mMのK
Cl,及び0.25％のTriton X-100を含有する緩衝液300マイ
クロリットルのなかに懸濁される。これらの試料の逆転
写酵素活性は50mMのTris-HCl（pH7.5）,5mMのジチオト
レイトール,100mMのKCl,0.01％Triton X-100,鋳型プラ
イマとしての10ulのdT₁₅rAn,10mMのMgCl₂,15uMの
［³Ｈ］dttp（ニューイングランドニウクレア，ボ
ストン MA），及び10マイクロリッタの破壊されたウイ
ルス懸濁液を含有する50-ulの反応混合物中で分析され
た。37℃で１時間の培養の後50マイクログラムの酵母tR
NA（Sigma Chemical,St.Louis.MO）を添加し、冷トリク
ロロ酢酸−不溶フラクションのなかの混合物が上述の実
施例２と同様にして検査された。検査は重複して行わ
れ、三回繰返された。

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Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】レトロウイルスにより生ずる感染で苦しむ
哺乳類動物の治療のために、ヒペリシン、プソイドヒペ
リシン、その塩及びその混合物からなる群より選ばれた
１つの化合物の有効量を含むことを特徴とする哺乳類動
物のレトロウイルス感染治療のための薬剤。
【請求項２】前記化合物がヒペリシンを含むことを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の薬剤。
【請求項３】前記化合物がプソイドヒペリシンを含むこ
とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の薬剤。
【請求項４】前記化合物がヒペリシン及びプソイドヒペ
リシン混合物を含むことを特徴とする特許請求の範囲第
１項記載の薬剤。
【請求項５】非経口投与の形態であることを特徴とする
特許請求の範囲第１項記載の薬剤。
【請求項６】タブレット、カプセルからなる群から選ば
れた固体経口投与の形態であることを特徴とする特許請
求の範囲第５項記載の薬剤。
【請求項７】前記有効量が、前記化合物の200ミリグラ
ムから12000ミリグラムであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項記載の薬剤。
【請求項８】前記薬剤が、非経口的投与に許容された担
体または希釈剤を含むことを特徴とする特許請求の範囲
第６項記載の薬剤。
【請求項９】注射可能な溶液であることを特徴とする特
許請求の範囲第５項記載の薬剤。