KR100339154B1 - 미나리로부터카페익산을추출하는방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미나리로부터 카페익산을 추출하는 방법에 관한 것으로, 미나리를 수성용매로 1차 추출, 유기용매로 2차 추출한 추출물을 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 카페익산은 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성 성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

미나리로부터 카페익산을 추출하는 방법{METHOD OF EXTRACTION OF CAFFEIC ACID FROM OENANTHE JAVANICA}

본 발명은 미나리로부터 카페익산을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미나리를 수성 용매 및 유기 용매로 추출 정제하여 B형 간염 치료제로 유효한 카페익산을 얻는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 세계적으로 약 2억 5천 만명의 인구가 HBV에 감염되어 있다. B형 간염 바이러스는 전세계적으로 다양하게 분포하나 국가별 발병율은 큰차이를 보이는데, 미국은 0.5%, 일본은 1.5%, 유럽은 1% 등으로 낮고 한국은 8%, 중국은 15%, 아프리카는 7% 정도의 높은 발병율을 보인다. 현재까지 한국 국민의 B형 간염 바이러스 보유율은 8% 정도인데, 이중 15 내지 20% 가 간경변증까지 진행되고 간경변증 환자의 20% 정도에서 간암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 추후 더 이상의 보균자가 발생하지 않더라도 70 만명의 간경변증 환자와 14 만명의 간암 환자가 발생할 것으로 추정된다(I. H. Hu et al.,월간약국 4월호, PP 54-59(1992)).

B형 간염 바이러스의 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95%는 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA 가 사람 간세포의 게놈 DNA 에 동화되어 만성 활동성 간염,간경병증,간암 등으로 발전하게 된다. HBV 에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에 까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다(Don Ganem et al.,Ann. Rev. Biochem. 56,651(1987); R.P. Beasley et al.,Lancet 2,1129(1981); D. A. Shafritz et al.,New England J. Med. 305,1067(1981); S.N. Zaman et al.,Lancet 1,1357(1985)).

지금까지 HBV 감염을 예방하기 위한 많은 백신들이 개발되었다. 이들 백신들은 면역원(Immunogen)으로서 B형 표면항원(HBs Ag)을 이용하는데, B형 표면항원은B형 간염 바이러스에 감염된 보균자의 혈장으로부터 또는 유전공학 기법을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 표면 항원계 백신은 개체 감염을 방지하는데는 일반적으로 효과적이라 할 수 있지만 백신이 투여된 모든 개체에서 보호 수준의 항체가 형성되는 것은 아니다. 이들 항체의 형성정도는 투여되는 을의 연령 및 면역 시스템의 억제정도는 물론, 주사부위와 같은 요인들에 의해서 영향을 받으며, 또한 백신이 투여된 모든 사람은 과민반응을 일으킬 다소의 위험도 갖고 있다.

일단 HBV 에 감염된 환자의 경우는 적절한 치료제의 공급이 요구된다. 현재까지 B형 간염 치료제로서 몇가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없다. Ara-A가 지금까지 미국 FDA 로 부터 승인받은 유일한 약으로, 임상시험에서는 유의할 만한 결과를 보여 주었으나 약물 자체가 갖는 독성 때문에 사용이 극히 제한적이며 인터페론과 병용치료하는 방법으로 사용된다. Ara-A의 부작용으로는 오심, 식욕부진, 설사, 구토 및 혈소판 감소등에 의한 가역적 골수억제 등이 알려져 있다(J. A. Payne et al.,Disease a Month,March, pp. 117-159(1988)), 한편, 아사이클로비르(Acyclovir; 9-(2-히드록시 구아닌)나 인터페론의 경우, 투여시에는 B형 간염에 대해 다소의 치료효과를 보이기는 하지만 투여를 중지하면 투여전 상태로 다시 복귀하기 때문에 장기 투여를 하여야 하며, 이로 인해 심한 부작용을 초래한다는 문제점이 있다. 한편, 이외에도 포스포노포르메이트(Phosphono-formate; Foscarnet), 수라민(Suramin), 프로스타글란딘(Prostaglandin), 2-CDG(carbocyclic analogue of 2-deoxyguanosine), 팜사이크로비르(Famciclovir) 등이 유망하다고 알려져 있기는 하지만 아직 많은 검증이필요하다. 최근에 개발된 약제 가운데 약효 및 독성면에서 가장 유망하다고 알려진 FIAU(Fialuridine)의 경우 임상 Ⅱ 단계에서 예상치 못한 사망으로 인해 임상시험이 중단된 예도 있다.

지금까지 B형 간염 치료제로는 뉴클레오사이드 유사체들에 대한 연구가 주종을 이루었으나, 이들의 경우는 심한 부작용이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 한편, 뉴클레오사이드 유사체가 아닌 천연약재로부터 B형 간염 치료제를 개발하고자 하는 연구도 보고되어 있다. 인디안의 황달 치료제로 널리 알려진 필란써스 니루리(Phyllanthus niruri)와 필란써스 아마루즈(Phyllanthus amarus)라는 약용식물의 추출물이 동물실험에서 B형 간염 바이러스의 억제에 매우 효과적인 것으로 보고되었으며 현재 유효성분 분석과 임상시험중에 있다(P. S. Venkateswaren et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 274(1987); Blumberg et al.,Vaccine 8, 274(1990)).

한편, 미나리는 수영, 수근 등으로 호칭되기도 하며 미나리과에 속하고 학명은 오난세 자바니카(Oenanthe javanica)로 알려져 있는데, 오래전부터 민간요법이나 한방에서 다양한 용도로 널리 사용되어 왔다. 항지방간 작용, 간경병 억제 작용, 혈중 콜레스테롤 저하 작용, 해독 작용, 지혈 작용 등의 여러 약리작용을 지니고 있어, 물고기 중독, 혈뇨, 자궁출혈, 고혈압, 불면증등 여러 질병의 치료에 다양하게 응용되고 있으며, 특히 급만성 간염의 치료에 효과적인 것으로 알려져 있다(중국 대사전, 상권, pp 1044-1047; 중국 대사전, 2권, pp 1334; 천연약물 대사전, pp 244). 그러나, 상기의 여러 보고들은 한방치료적인 측면에서 미나리가 급만성 간염에 효과가 있다는 사실을 규명했을 뿐, 유효성분 분석이라든가 B형 간염바이러스와의 직접적인 관련성에 대해서는 지금까지 전혀 연구된 바 없다.

이에 본 발명자들은, 천연 약재로부터 B형 간염 치료제를 찾고자 노력하던 중 미나리의 수성 추출물 및 그로부터 분리된 단일성분 화합물인 카페익산(caffeic acid)이 유효 활성성분임을 확인하게 되었다.

카페익산은 식물에 흔하게 존재하는 페놀 계통 화합물의 하나로서, 매우 다양한 생리활성-간손상 회복작용 (A. V. Perez et al.,Pharmacology, 47, 330(1993)), 강력한 항암작용 (C. V. Rao et al.,Cancer Research, 53, 4182(1993); T. Tanaka et al.,Carcinogenesis, 14, 1321(1993)), 항에이즈바이러스 활성 (M. R. Fesen et al.,P. N. A. S., 90, 2399(1993)), 항염작용 (K. Frankel et al.,Cancer Research, 53, 1255(1993)) 등을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 카페익산과 B형 간염 바이러스의 관련성에 대해서는 전혀 연구된 바 없다.

본 발명의 목적은, 미나리로부터 B형 간염 치료에 유효한 카페익산을 추출 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은, 미나리를 수성 용매로 1차 추출하고, 유기용매로 2차 추출하여 얻어진 추출물을 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 카페익산에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 한다.

여기에서 상기 수성용매로는 물, 바람직하게는 증류수를 사용할 수 있고, 유기용매로는 메탄올, 아세토니트릴등을 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(1) 미나리 추출물의 제조

미나리 10 내지 30g에 증류수 100mℓ를 넣고 약 60 내지 90℃ 에서 12 내지 48 시간 중탕하여 미나리 수성 추출액을 얻는다. 바람직하게는 80℃ 에서 24 시간 동안 유지한다. 얻어진 수성 추출액은 단일 성분을 분리하기 위한 다음 공정에 들어가기 전에 원심분리 등의 공지의 방법으로 여러 불순물을 제거하는 것이 필요하다.

불순물이 제거된 수용성 미나리 추출액을 유기용매로 2차 추출하고 추출액을 감압하에 증발시켜 미나리 추출물을 얻는다.

(2) 미나리 추출물의 분리 및 정제

상기 (1)에서 얻은 미나리 추출물을 다시 물에 녹여서 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행한다. C18 컬럼을 사용하고 용출용매로 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물(16:84)(v/v) 을 사용하여 분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발 건조시켜 단일 성분으로 수득한다.

각 피크의 수집액에 대하여 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 평가한 결과, 수집용 역상 HPLC 에서 9 분대 피크인 M7이 B형 간염 표면항원 생성에 강한 억제효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌는데, 이 성분은 NMR 및 MASS 구조분석 결과 카페익산임이 확인되었고 B형 간염에 대한 효과도 입증되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이로서 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 미나리로부터 추출 정제된 성분의 B형 간염 표면 항원에 대한 억제 정도는 다음 방법에 의해 평가한다.

B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도 분석

미나리 추출물로부터 얻은 샘플이 처리된 세포 배양액을 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbottlab., #1980-24)를 이용하여 B형 표면항원 생성에 대한 억제정도를 정량적으로 분석한다.

세포 배양액을 인산염 완충 생리 식염수(pH 7.0)로 최종 흡광도가 1.0 내지 1.5 범위에 들도록 희석(대략 20 내지 50배 희석)한 후, 희석액 0.2mℓ 대조용액 0.2mℓ을 표면항원에 대한 1차 단일항체, HRP(Horse Radish Peroxidase)가 연결된 2차 단일항체가 이미 결합되어 있는 비트와 40℃에서 2시간 동안 각각 반응시킨 후, 비드를 증류수로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에 과산화수소수가 함유된 0-페닐렌디아민(0-phenylenediamine) 용액 300 ㎕을 가하고 30분 배양한 후 0.1N HCl 을 가하여 반응을 중지시켰다. 대조군과 실험군의 흡광도를 492 nm에서 측정하고, 하기 식을 이용하여 B형 간염 표면 항원 생성 억제 정도를 계산한다.

실시예

단계 1: 미나리 추출물의 제조

한약재인 미나리 50g에 증류수 300 mℓ을 넣고 교반시키면서 80 ℃에서 24시간 동안 가열하였다. 이렇게 얻은 미나리 추출액을 8,500 rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전은 제거하고 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 한외 여과막 (whatman, #1)으로 여과하여 잔여 불용성 물질이 완전히 제거된 미나리의 수성 추출물을 얻었다.

미나리의 수성 추출물을 90%(v/v) 메탄올(?)로 2차 용매추출하고, 감압하 70℃ 에서 증발시켜 미나리 주출물 10 g을 수득하였다.

상기 미나리 추출물을 여러가지 농도로 만들어 B형 간염 표면 항원에 대한 억제정도를 조사하여 그 결과를 아래 [표 1] 에 나타내었다.

[표 1]에서 보듯이, 미나리 추출물은 9 mg/mℓ의 농도에서 74%의 높은 억제효과를 나타냄을 알 수 있다.

단계 2. 수집용 역상 고압액체 크로마토그래피

수집용 역상 HPLC 수행시, μ-BondaPack C18 컬럼(7.8mm x 300mm, Waters, U.S.A.)을 사용하여 다음 프로그램에서 등용매 용출하여 각 피크들을 분리, 수집한다. 이때의 등용매 용출액으로는 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (16:84)(v/v)를 사용하였고, 용출 속도는 3.5 mℓ/min, 흡광도는254 nm에서 측정하였다.

단계 1에서 얻은 미나리 수성 추출물의 수집용 역상 HPLC 분석 결과를 제 1 도에 나타내었다.

분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발시켜 건조시킨 후, 0.2 mg/mℓ의 농도에서 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 분석하여 [표 2] 에 나타내었다.

상기 표 2 에서 보듯이, 수집용 역상 HPLC를 수행시 여러 피크의 성분에서 B형 간염 표면항원 생성에 대한 억제효과를 보였다. 우선 9분대 피크인 M7에 대해서 HPLC, NMR 및 MASS 를 이용한 확인 및 구조분석을 시행하였다.

분석용 역상 고압액체 크로마토그래피

컬럼은 Microsorb C18 (4.6 X 250mm, Rainin, U.S.A.)을 사용한다. 용출 완충용액은 0.1% 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (18:82) 를 사용하여 분당 1.2 mℓ의 유속으로 등용매 용출시킨다.

제 2 도는 수집용 역상 HPLC로 얻은 M7 성분(A) 및 시판되는 카페익산(B)의분석용 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, M7 피크와 시판되는 카페익산이 동일한 시간대의 피크양상을 보이는 것으로 보아, 미나리로부터 분리, 정제된 물질 M7이 카페익산임을 확인할 수 있었다. 이는 하기의 NMR 및 MASS 구조분석 결과와도 일치한다.

NMR 및 MASS 구조분석

수집용 역상 HPLC 에서 9 분대 피크 성분 M7을 NMR 및 MASS 구조 분석한 결과, 미나리로부터 분리, 정제된 성분 M7은 단일 성분으로서 카페익산임이 확인되었다.

제 3 도는 M7 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 4 도는 M7 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 5 도는 M7 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 미나리로부터 수성 용매 및 유기 용매로 추출하고 역상 HPLC로 분리 정제된 카페익산은 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효 활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

제 1 도는 미나리 수성 추출물의 수집용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내며,

제 2 도는 수집용 역상 HPLC로 얻은 M7 성분(A) 및 시판되는 카페익산(B)의 분석용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내고,

제 3 도는 M7 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 4 도는 M7 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 5 도는 M7 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

Claims (4)

1. 미나리를 수성용매로 1차 추출하고, 유기용매로 2차 추출하여 얻어진 추출물을 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 카페익산에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 하는, 미나리로부터 카페익산을 추출하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 수성용매가 물이고, 상기 유기용매가 메탄올 또는 아세토니트릴인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   수성용매로 추출시, 60 내지 90℃ 에서 12 내지 48 시간 동안 물중탕 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

   수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피 수행시 C18 컬럼을 사용하고 용출용매로 0.1 % 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물 (16:84)(v/v) 을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법