KR100342937B1

KR100342937B1 - 인진으로부터스코폴레틴을추출하는방법

Info

Publication number: KR100342937B1
Application number: KR1019940037729A
Authority: KR
Inventors: 김훈주; 김순하; 권혁준; 김준; 김정민
Original assignee: 주식회사 엘지씨아이
Priority date: 1994-12-28
Filing date: 1994-12-28
Publication date: 2003-09-19
Also published as: KR960022500A

Abstract

본 발명은 인진으로부터 스코폴레틴을 추출하는 방법에 관한 것으로, 인진을 수성용매로 추출하여 얻어진 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 얻어진 스코폴레틴은 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인진으로부터 스코폴레틴을 추출하는 방법

본 발명은 인진으로부터 스코폴레틴을 추출하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인진을 수성 용매로 추출, 정제하여 B형 간염치료제로 유효한 스코폴레틴을 얻는 방법에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(HBV)는 인체에 특이적으로 감염되는 헤파드나비리대 (Hepadnaviridae) 계통의 바이러스로서, 세계적으로 약 2억 5천 만명의 인구가 HBV 에 감염되어 있다. B형 간염 바이러스는 전세계적으로 다양하게 분포하나 국가별 발병율은 큰차이를 보이는데, 미국은 0.5％, 일본은 1.5％, 유럽은 1％ 등으로 낮고 한국은 8％, 중국은 15％, 아프리카는 7％ 정도의 높은 발병율을 보인다. 현재까지 한국 국민의 B형 간염 바이러스 보유율은 8％ 정도인데, 이중 15 내지 20％ 가 간경변증까지 진행되고 간경변증 환자의 20％ 정도에서 간암이 발생하는 것으로 알려져 있으며, 추후 더 이상의 보균자가 발생하지 않더라도 70만명의 간경변증 환자와 14 만명의 간암 환자가 발생할 것으로 추정된다(I. H. Hu et al.,월간약국 4월호, PP 54-59(1992)).

B형 간염 바이러스의 잠복기는 60 내지 110 일 정도이며 다양한 정도의 임상기를 거쳐 90 내지 95％는 완전히 회복된다. 감염에서 회복되지 않는 환자의 경우에는, HBV DNA 가 사람 간세포의 게놈 DNA에 동화되어 만성 활동성 간염, 간경병증, 간암 등으로 발전하게 된다. HBV 에 의한 만성간염은 다른 질환과 마찬가지로 만성 바이러스 감염증, 임파종 질환 및 만성 신장장애를 일으킨다. 따라서 만성간염은 더욱 강력한 형태의 질환으로 발전하여 결국 환자를 사망에 까지 이르게 하는 치사율이 매우 높은 질환이라 할 수 있다(Don Ganem et al.,Ann. Rev. Biochem. 56, 651(1987); R.P. Beasley et al.,Lancet 2, 1129(1981); D. A. Shafritz et al.,New England J. Med. 305, 1067(1981); S.N. Zaman et al.,Lancet 1,1357(1985)).

지금까지 HBV 감염을 예방하기 위한 많은 백신들이 개발되었다. 이들 백신들은 면역원(Immunogen)으로서 B형 표면항원(HBsAg)을 이용하는데, B형 표면항원은 B형 간염 바이러스에 감염된 보균자의 혈장으로부터 또는 유전공학 기법을 통해서 얻을 수 있다. 이러한 표면 항원계 백신은 개체 감염을 방지하는데는 일반적으로 효과적이라 할 수 있지만 백신이 투여된 모든 개체에서 보호 수준의 항체가 형성되는 것은 아니다. 이들 항체의 형성 정도는 투여되는 을의 연령 및 면역 시스템의 억제정도는 물론, 주사부위와 같은 요인들에 의해서 영향을 받으며, 또한 백신이 투여된 모든 사람은 과민반응을 일으킬 다소의 위험도 갖고 있다.

일단 HBV 에 감염된 환자의 경우는 적절한 치료제의 공급이 요구된다. 현재까지 B형 간염 치료제로서 몇가지 약제가 개발되기는 하였으나 만족할만한 효능을 지닌 것은 거의 없다. Ara-A가 지금까지 미국 FDA 로 부터 승인받은 유일한 약으로, 임상시험에서는 유의할 만한 결과를 보여 주었으나 약물 자체가 갖는 독성 때문에 사용이 극히 제한적이며 인터페론과 병용치료하는 방법으로 사용된다. Ara-A의 부작용으로는 오심, 식욕부진, 설사, 구토 및 혈소판 감소등에 의한 가역적 골수억제 등이 알려져 있다(J. A. Payne et al.,Disease a Month, March, pp. 117-159(1988)). 한편, 아사이클로비르(Acyclovir: 9-(2-히드록시 구아닌)나 인터페론의 경우, 투여시에는 B형 간염에 대해 다소의 치료효과를 보이기는 하지만 투여를 중지하면 투여전 상태로 다시 복귀하기 때문에 장기 투여를 하여야 하며, 이로 인해 심한 부작용을 초래한다는 문제점이 있다. 한편, 이외에도 포스포노포르메이트(Phosphonoformate; Foscarnet), 수라민(Suramin), 프로스타글란딘 (Prostaglandin), 2-CDG(carbocyclic analogue of 2-deoxyguanosine), 팜사이크로비르(Famciclovir) 등이 유망하다고 알려져 있기는 하지만 아직 많은 검증이 필요하다. 최근에 개발된 약제 가운데 약효 및 독성면에서 가장 유망하다고 알려진 FIAU(Fialuridine)의 경우 임상 II 단계에서 예상치 못한 사망으로 인해 임상시험이 중단된 예도 있다.

지금까지 B형 간염 치료제로는 뉴클레오사이드 유사체들에 대한 연구가 주종을 이루었으나, 이들의 경우는 심한 부작용이 가장 큰 단점으로 지적되고 있다. 한편, 뉴클레오사이드 유사체가 아닌 천연약재로부터 B형 간염 치료제를 개발하고자 하는 연구도 보고되어 있다. 인디안의 황달 치료제로 널리 알려진 필란써스 니루리 (Phyllanthus niruri)와 필란써스 아마루스(Phyllanthus amarus)라는 약용식물의 추출물이 동물실험에서 B형 간염 바이러스의 억제에 매우 효과적인 것으로 보고되었으며 현재 유효성분 분석과 임상시험중에 있다(P. S. Venkateswaren et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 274(1987); Blumberg et al.,Vaccine 8. 274(1990)).

한편, 인진(茵蔯)은 면인진, 사철쑥(한국), 새당쑥(중국) 등의 여러가지로 호칭되기도 하는데, 국과에 속하며 학명은 아르테메지아 카필라리스 썬베르그 (Artemesia capillaris Thunberg)로 알려져 있다. 인진은 오래전부터 민간요법이나 한방에서 이수이담약(利水利膽藥)으로 널리 사용되어 왔으며, 이의 추출물 및 일부 유효성분들은 항인플루엔자 바이러스작용, 항균작용, 항진균작용, 청열이습작용, 이담작용 및 해열작용 등의 여러가지 약리작용을 지니고 있어 각종 질병의 치료에다양하게 응용되고 있는데, 특히 급성 황달형 간염의 치료에 임상적으로 사용되고있다(한국 유용식물자원 연구 총람, 한국화학연구소, pp 226-232 (1988);한방 임상응용, 성보사, pp 176-178(1982)). 그러나, 상기의 여러 보고들은 한방치료적인 측면에서 인진이 급성 황달형 간염에 효과가 있다는 사실을 규명했을 뿐, 유효성분 분석이 라든가 B형 간염 바이러스와의 직접적인 관련성에 대해서는 지금까지 전혀 연구된 바 없다.

이에 본 발명자들은, 천연 약재로부터 B형 간염 치료제를 찾고자 노력하던 중 인진의 수성 추출물 및 그로부터 분리된 단일성분 화합물인 스코폴레틴 (scopoletin)이 유효 활성성분임을 확인하게 되었다.

한편, 각종 식물의 뿌리, 몸체, 열매등에 다양하게 분포하는 것으로 알려진 쿠마린(coumarin) 유도체는 에이즈 바이러스 억제작용(Totani et al,, JP 03,227,923); 혈압강하 작용(U. Zutshi et al.,Indian J. Exp. Biol. 16, 836 (1978); 면역억제작용(H. C. Huanget et al.,Eur. J. Pharmacol. 198, 211(1991)등의 다양한 약리작용을 갖는 것이 보고되었다.

스코폴레틴은 쿠마린(coumarin) 계통의 화합물로서 올레아 아프리카나(Olea Africana)와 올레아 카펜시스(Olea Capensis)등 올레아 계통의 여러 식물에 존재하며(H. Tsukamoto et al.,Phytochemistry 23. 699(1984), 담배 모자이크 바이러스 (Tobacco mosaic virus)에 대해 항바이러스 활성을 보인다(M. M. Antonina et al.,Zesz. Probl. Postepow Nack Rlon. 182, 17(1976). 또한, 스코폴레틴은 오렌지, 레몬 및 밀감의 껍질에 적은 양으로 존재하지만, 감마선 등에 조사되어 스트레스를받으면 메틸트랜스퍼라제의 작용으로 식물의 천연 살균제인 스코파론으로 전환되어 많은 양이 유도됨으로써 자기방어를 하는 것으로 알려져 있다(I. A. Dubery et al.,S. Afr. J. Sci. 83, 440(1987)). 그러나, 스코포레틴과 B형 간염 바이러스의 관련성에 대해서는 전혀 연구된 바 없다.

본 발명의 목적은, 인진으로부터 B형 간염 치료에 유효한 스코폴레틴을 추출 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 방법은, 인진을 수성용매로 추출하여 얻어진 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 스코폴레틴에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

(1) 인진 추출물의 제조

인진 10 내지 40g에 증류수 100㎖를 넣고 약 60 내지 90℃에서 12 내지 48 시간 중탕하여 인진 수성 추출액을 얻는다. 바람직하게는 80℃ 에서 24 시간 동안 유지한다. 얻어진 수성 추출액은 단일성분을 분리하기 위한 다음 공정에 들어가기 전에 원심분리 등의 공지의 방법으로 여러 불순물을 제거하는 것이 필요하다.

(2) 인진 추출물의 분리 및 정제

불순물이 제거된 인진 수성 추출액을 DEAE-페닐 음이온교환 크로마토그래피를 수행하여 먼저 3개의 그룹으로 나눈다. 이 때 컬럼(5 cm ×15 cm, Pharmacia, U. S. A.)의 용출속도는 0.5 ml/분으로 하고 용출액은 1 M NaCl을 함유하는 10 mM인산 완충액(pH 6.0)을 사용하며 샘플의 부피는 100 ml (0.6 g/100ml)로 한다.

상기 음이온교환 크로마토그래피를 시행하여 얻은 각 그룹을 분석용 역상 고압액체 크로마토그래피로 다시 약 5-10개 정도의 피크로 분리한다. 우선적으로 제 2 그룹의 19분대 부근의 피크를 가지고 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행한다. C18 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.1 ％ 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물 (11:89)(v/v)을 사용하여 등용매 용출시켜 분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발 건조시켜 단일 성분으로 수득한다.

각 피크의 수집 액에 대하여 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 평가한 결과, 분석용 역상 HPLC 에서 19 분대 피크가 B형 간염 표면항원 생성에 강한 억제효과를 나타낸다는 것이 밝혀졌는데, 이 성분은 NMR 및 MASS 구조분석 결과 스코폴레틴임이 확인되었고 B형 간염에 대한 효과도 입증되었다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 주어진 것이며 본 발명의 범위가 이로서 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 인진으로부터 추출 정제한 성분의 B형 간염 표면 항원에 대한 억제 정도는 다음 방법에 의해 평가한다.

B형 간염 표면항원애 대한 억제 정도 분석

인진 추출물로부터 얻은 샘플이 처리된 세포 배양액을 상품화된 B형 간염 표면항원 검출키트(Auszyme R, Monoclonal, Abbott lab., #1980-24)를 이용하여 B형 표면항원 생성에 대한 억제정도를 정량적으로 분석한다.

세포 배양액을 인산염 완충 생리식 염수(pH 7.0)로 최종 흡광도가 1.0 내지 1.5 범위에 들도록 희석(대략 20 내지 50배 희석)한 후, 희석액 0.2㎖과 대조용액 0.2㎖을 표면항원에 대한 1차 단일항체 HRP(Horse Radish Peroxidase)가 연결된 2차 단일항체가 이미 결합되어 있는 비드와 40℃에서 2시간 동안 각각 반응시킨 후, 비드를 증류수로 3회 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 다음에 과산화수소수가 함유된 O-페닐렌디아민(O-phenylenediamine) 용액 300 ㎕을 가하고 30분 배양한 후 0.1N HCl 을 가하여 반응을 중지시켰다. 대조군과 실험군의 흡광도를 492 nm에서 측정하고, 하기 식을 이용하여 B형 간염 표면 항원 생성 억제 정도를 계산한다.

실시예

단계 1: 인진 추출물의 제조

한약재인 인진 120g에 증류수 600㎖을 넣고 교반시키면서 80℃에서 24시간 동안 가열하였다. 이렇게 얻은 인진 추출액을 8,500rpm 에서 30분간 원심분리하여 불용성 침전은 제거하고 상층액을 얻었다. 상기 상층액을 한외 여과막(whatman, #1)으로 여과하여 잔여 불용성 물질이 완전히 제거된 인진의 수성 추출물을 얻었다. 이것을 감압하 70 ℃ 에서 증발시켜 인진 추출물 20 g을 수득하였다.

상기 인진 추출물을 여러가지 농도로 만들어 B형 간염 표면항에 대한 억제정도를 조사하여 그 결과를 아래 [표 1] 에 나타내었다.

[표 1]

(대조군의 흡광도는 0.973 임)

[표 1]에서 보듯이, 인진 추출물은 9.0 mg/㎖ 의 농도에서 64％의 높은 억제효과를 나타냄을 알 수 있다다.

단계 2: DEAE 음이온교환 크로마토그래피

상기 단계 1에서 얻은 인진 추출물 0.6 g을 증류수 100 ml에 녹인 후, 10 mM 인산완충액 (pH 6.0)으로 미리 평형을 맞춘 DEAE 음이온교환 컬럼(5 cm ×15 cm, Pharmacia, U. S. A.)에 흡착시킨 다음, 1 M NaCl을 함유하는 동일한 용출액을 사용하여 계단식 구배로 하여 0.5 ml/분의 속도로 용출시켰다. 용출개시부터 22개의 분획(220 ml)을 모아 제 1 그룹으로, 23번부터 62번까지의 분획(400 ml)을 모아 제 2 그룹으로 하고, 63번부터 72번까지의 분획(100 ml)을 모아 제 3 그룹으로 분류한 후, 각 그룹을 감압하에 증발시켰다. 이렇게 하여 얻은 각 그룹은 NaCl이 들어있기 때문에 B형 간염 표면항원에 대한 억제 정도를 직접 분석할 수 없었다.

상기 단계 1 및 2에서 얻은 각 샘플을 μ-Bondapack C18 컬럼 (3.9 mm ×390 mm, Waters, U. S. A.)을 사용하여 분석용 역상 고압액체 크로마토그래피를 실시하였다. 평형완충용액은 0.1 ％ 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:증류수 (10:90) (v/v)를 사용하였으며 20분 동안 상기 아세토니트릴:증류수 (70:30)(v/v)로 선형구배를 만들어 1.2 ml/분의 속도로 용출시켰다. 시간에 따른 완충용액의 조성은 다음과 같다.

용액 A: 0.1 ％ TFA in Acetonitrile/증류수=1/9 (v/v)

용액 B: 0.1 ％ TFA in Acetonitrile/증류수=7/3 (v/v)

제 1 도는 상기 단계 1에서 얻은 샘플을 분석용 역상 HPLC로 분석한 결과로, 여기에서 보면, 인진의 수용성 추출물은 역상 HPLC 상에서 약 15개 정도의 피크로 분리됨을 알 수 있다.

제 2 도는 상기 단계 2에서 얻은 제 2 그룹을 분석용 역상 HPLC로 분석한 결과로, 여기에서 보면, 인진의 수용성 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그래피로 분리한 제 2 그룹은 20분대의 피크가 잘 분리되어 나타난다는 것을 알 수 있다.

단계 3: 수집용 역상 고압액체 크로마토그래피

상기 단계 2 에서 얻은 제 2 그룹을 가지고 수집용 역상 HPLC를 수행하였는데, μ-BondaPack C18 컬럼 (7.8 mm ×300 mm, Waters, U. S. A.)을 사용하여 다음 프로그램에서 등용매 용출하여 각 피크들을 분리, 수집하였다. 이 때의 등용매 용출액으로는 0,1 ％ 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (11: 89) (v/v)를 사용하였고, 용출 속도는 3 ㎖/min, 흡광도는 254 nm에서 측정하였다.

용액 A: 0.1 ％ TFA in 아세토니트릴:증류수=11:89 (v/v)

제 3 도는 단계 2에서 얻은 제 2 그룹의 수집용 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸다.

분리된 각 피크의 수집액을 감압하에 증발시켜 건조시킨 후, 0.9 mg/㎖의 농도에서 B형 간염 표면항원에 대한 억제정도를 분석하여 [표 2] 에 나타내었다.

[표 2]

상기 표 2 에서 보듯이, 수집용 역상 HPLC를 수행시 P1, P2 및 P3 피크의 성분에서 B형 간염 표면항원 생성에 대한 억제효과가 높은 것을 알 수 있다. 그러나 P1 성분은 강한 세포독성 때문에 제외하고 P3 피크를 수집하여 HPLC, NMR 및 MASS 를 이용한 확인 및 구조분석을 시행하였다.

확인용 역상 고압액체 크로마토그래피

컬럼은 Microsorb C18 (4.6 ×250mm, Rainin, U. S. A.)을 사용한다. 용출 완충용액은 0.1％ 트리플루오로아세트산이 들어 있는 아세토니트릴:증류수 (20:80)을 사용하여 분당 1.0 ㎖의 유속으로 등용매 용출시키고, 280 nm 에서 검출한다.

제 4 도는 수집용 역상 HPLC에서 P3 피크의 성분(A) 및 시판되는 스코폴레틴(B)의 확인용 역상 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다. 여기에서, P3 피크와 시판되는 스코폴레틴이 동일한 시간대의 피크 양상을 보이는 것으로 보아, 인진으로부터 분리, 정제된 P3는 스코폴레틴임을 확인할 수 있었다. 이는 하기의 NMR 및 MASS 구조분석 결과와도 일치한다.

NMR 및 MASS 구조분석

수집용 역상 HPLC의 P3 피크 성분을 NMR 및 MASS 구조 분석한 결과, 상기 성분은 단일성분으로서 스코폴레틴임이 확인되었다.

제 5 도는 P3 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 6 도는 P3 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고, 제 7 도는 P3 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

이상 설명한 바와 같이, 인진으로부터 수성 용매로 추출하고 DEAE 음이온 교환수지 및 수집용 역상 HPLC로 분리 정제한 스코폴레틴은 B형 간염 표면 항원 생성에 대한 억제 효과가 있으므로, 이를 유효 활성성분으로 포함하는 약학 조성물은 B형 간염 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있다.

제 1 도는 인진 수용성 추출물의 분석용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내며,

제 2 도는 인진의 수용성 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그래피로 분리한 제 2 그룹의 분석용 역상 HPLC 분석결과를 나타내고,

제 3 도는 인진의 수용성 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그래피로 분리한 제 2 그룹의 수집용 역상 HPLC 분석결과를 나타내고,

제 4 도는 수집용 역상 HPLC에서 P3 피크의 성분(A) 및 시판되는 스코폴레틴 (B)의 확인용 역상 HPLC 분석 결과를 나타내며,

제 5 도는 P3 성분의¹H NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 6 도는 P3 성분의¹³C NMR 구조분석 결과를 나타내고,

제 7 도는 P3 성분의 MASS 구조분석 결과를 나타낸다.

Claims

인진을 수성용매로 추출하여 얻어진 추출물을 DEAE 음이온교환 크로마토그라피 및 수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피를 수행하여 스코폴레틴에 해당하는 구획을 수집하는 것을 특징으로 하는, 인진으로부터 스코폴레틴을 추출하는 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 수성용매로 물을 사용하여, 60 내지 90℃ 에서 12 내지 48 시간 동안 물중탕 추출하는 것을 특징으로 하는

방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 DEAE 음이온교환 크로마토그라피 수행시, DEAE-페닐 컬럼을 사용하여, 1N NaCl을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 6.0) 을 계단구배로 용출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

수집용 역상 고압 액체 크로마토그래피 수행시 C18 컬럼을 사용하고, 용출용매로 0.1 ％ 트리플루오로아세트산이 들어있는 아세토니트릴:물 (11:89)(v/v) 을 사용하여 등용매 용출시키는 것을 특징으로 하는

방법.