KR100988877B1

KR100988877B1 - 작약 추출물을 유효성분으로 하는 ｂ형 간염 치료제 조성물

Info

Publication number: KR100988877B1
Application number: KR1020070035693A
Authority: KR
Inventors: 이성진; 이학교; 김창현; 조진국
Original assignee: 한경대학교 산학협력단
Priority date: 2007-04-11
Filing date: 2007-04-11
Publication date: 2010-10-20
Also published as: KR20080092167A

Abstract

본 발명은 작약 추출물과 작약 추출물에 포함된 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-beta-D-glucose)의 새로운 의학적 용도에 관한 것으로, 구체적으로 작약의 에칠 아세테이트 추출물과 작약의 주요 성분인 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-글루코오스을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제에 관한 것이다.본 발명에서는 작약 유기용매 추출물과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스을 이용하여, in vitro 실험에서 추출물의 B형 간염바이러스 억제활성이 우수함을 확인하였다. 따라서 작약 추출물과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스는 B형 간염 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

작약, 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스, B형 간염 바이러스

Description

작약 추출물을 유효성분으로 하는 Ｂ형 간염 치료제 조성물 {Anti-hepatitis B virus agent from Paeonia lactiflora}

도 1은 작약의 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스(PGG)가 B형 간염바이러스를 억제하는지 확인인하기 위하여 B형 간염치료제인 라미뷰딘(3TC)을 농도별(0.08 - 20 ㎍/㎖)로 HepG2 2.2.15 세포주에 처리한 후, 배양액을 677 bp의 HBV 유전자 탐침을 이용하여 슬롯 블럿한 결과를 보여주는 사진이다.

도 2은 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스가 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)의 양의 저해효과를 나타내는 그림이다.

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV) 억제 효과를 갖는 작약 추출물과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스에 관한 것이다.

B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 급성 또는 만성간염이나 간암을 일으키는 주요 원인으로서 우리나라 뿐만 아니라 세계적으로도 중요한 문제가 되고 있다. 전 세계적으로는 3 억명 이상 감염되어 있는 것으로 추산되고 특히 한국을 포함한 극동지역과 아프리카에서는 전 인구의 10% 이상이 보균자일 정도로 만연하 고 있다. 따라서 새로운 치료제가 개발되면 국내시장은 물론 해외시장의 많은 부분에 급격한 시장확대가 이루어질 것이다. 1995년 WHO의 세계보건통계연감에 의하면 우리 나라 40대 남자의 주요 사인 중 간암이 차지하는 비율이 10만 명당 33.4명이었다. 이는 OECD 가입국 중 2위로 하루에 40명 정도의 국민이 간암으로 사망한다는 심각한 보건현실을 보여준다.

만성간염 치료제로는 FDA에 승인되어 사용중인 interferon 알파가 있다. 이 약물은 성인의 경우 후천적인 간염환자에 있어서 40 % 정도는 효과적으로 사용할 수 있으며 20～25 %에 있어서는 C형간염에도 효과적인 것으로 알려져 있으나 독감 증세와 비슷한 부작용을 일으키는 것으로 알려져 있다. 최근글락소(Glaxo)-웰컴 제약회사에서 특허를 가지고 있는 라미뷰딘 (3TC)은 ddC를 모체로하여 합성한 가장 대표적인 뉴클레오시드계 화합물로서 B형간염바이러스는 물론 AIDS바이러스의 역전사효소에 작용한다. 이 화합물은 바이러스가 증식하는데 필요한 RNA로부터 DNA합성을 못하도록 차단한다. 그러나 숙주세포가 가지고 있는 DNA 중합효소는 비정상적 구조의 라미뷰딘을 인지할 수 있기 때문에 정상적인 뉴클레오시드로 교체함으로서 완전한 DNA로의 합성이 가능하다. 따라서 숙주세포에는 영향이 적고 바이러스에만 작용하여 증식을 효과적으로 차단할 수 있게 된다. 그러나 장기간 동안 이 화합물을 투여 할 경우 바이러스는 스스로가 살아남기 위하여 역전사효소의 구조를 변형시키게 되고 숙주세포의 DNA 중합효소와 같이 라미뷰딘을 인지할 수 있는 능력이 생기게 됨으로서 내성을 같게 된다. 또한 이 약품은 부작용으로서 구토 등을 유발한다고 알려져 있다. 따라서 세계적인 추세는 라미뷰딘과 동일계열인 다른 뉴클레오시드계 의 항바이러스제를 합성하여 개발하는 수준의 단계에 있으며 또한 이 계열의 화합물에 대한 내성을 줄이기 위하여 두 가지 뉴클레오시드계 화합물을 동시에 투여하는 복합처방을 이용하고 있다.

국내의 B형간염 치료제의 개발현황을 보면 96년 10월26일 중외제약이 질경이에서 추출한 NP-77A를 개발하였으며 98년 2월 18일 녹십자가 목암생명공학연구소와 공동으로 B형 간염 면역치료제를 세계에서 처음으로 개발하여 발표하였다. 또한 부광약품이 98년 2월 27일 미국 연구진과 공동 개발한 차세대 B형간염 치료제 L-FMAU를 발표하였다. 한국산 야생초(Phyllanthus urinaria ;여우구슬)의 추출 물질이 B형간염 치료에 탁월한 효과를 나타낸 것으로 경북대 의대의 간 연구소 정태호 박사가 발표하였다.

그 동안 B형 간염바이러스에 대한 많은 연구에도 불구하고 HBV의 narrow host range 즉, 사람, 침팬지, woodchuck, 오리 등의 간에서만 증식할 수 있는 특성으로 인하여 바이러스를 감염시킨 소수 종의 질환 동물만이 바이러스성 간염 치료제 효력 검색에 활용되었으며 이는 많은 비용이 들기 때문에 1차 약효 검색법으로는 적합하지 못하다는 견해가 제시되었다. 1991년에 미국 Georgetown 대학의 Korba 박사 등은 HBV 유전자를 인간의 간암세포에 도입하여 HBV가 증식, 생산되는 특성을 가진 HepG2.2.15 세포주를 사용하여 항HBV 약효검색 시스템을 개발하여 보고하였다(Korba와 Milman, Antiviral research 15: 217-228, 1991; Korba와 Gerin, Antiviral research 19: 55-70, 1992). HepG2.2.15 세포주는 짧은 시간에 많은 시료를 검색할 수 있어 유용하며, 동일한 목적으로 일본에서 개발된 HB 611 세포주보 다 세포배양이 용이하고 바이러스 수율이 높아 실험의 재현성이 높은 것으로 보고되었다(Kruining 등 J. of Hepatology 22: 263, 1995). 이러한 검색법을 이용해 손쉽게 많은 천연물의 약효를 검색하고 보다 효율적으로 천연물 유래의 항HBV 생리활성 물질을 찾고자 하였다.

작약(Paeoniae lactiflora Pall.)은 목단과에 속하는 식물로서 다년초이고 근은 비후했으나 꼿꼿이 자라되 방추형이고 긴 것은 30cm 내외의 길이를 갖는다. 이 식물은 진경, 진통, 수렴, 완화약으로 근육의 경련, 두통, 복통, 이질, 세균성감염 및 지한(止汗), 조경(調經) 등에 유효하다. 주로 간에 작용하며 간의 기운을 부드럽게 하고 혈액을 보충하는 기능이 있어서 월경의 주기가 불규칙한 여성과 스트레스로 인해 짜증이 있는 경우에 좋은 효과를 나타낸다. 그러나 현재까지 작약의 HBV 감염 치료에 대한 효능에 대해서는 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 B형 간염바이러스를 억제제 개발할 목적으로 수십 종의 생약에 대하여 추출물을 제조하고 HepG2 2.2.15 배양세포를 사용한 약효 검색 시스템을 이용하여 B형 간염 바이러스 저해력을 측정한 결과 작약의 추출물과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스가 B형 간염에 효과가 탁월함을 규명하여 본 발명을 완성하게 되었고 외국 저명 학술지 Biol. Pharm. Bull. 29, 2131-2134 (2006년10월)에 게재되었다.

본 발명의 목적은 B경 간염바이러스 억제효과를 갖는 작약추출물 및 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스를 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공하는 것이 다.

이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 작약 추출물과 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스를 유효성분으로 하는 B형 간염 치료제를 제공한다.

본 발명 작약 추출물의 제조방법으로는 공지방법을 사용하는 것이 가능하다. 예컨대 작약을 채취하여 생 또는 건조된 상태의 것을 에탄올, 메탄올, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 용매들을 가한 후 실온에서 침적 추출하거나 가온 추출할 수 있다.

작약 추출물은 식품의약품안정청 고시식품주원료로 사용가능한 품목으로 지정 되어있어 작약 추출물은 부작용이나 독성 등의 문제가 없어 B형 간염에 임상적으로 치료제로 이용하거나 기능성 식품의 유효성분으로도 이용할 수 있는 것으로 판단된다.

본 발명에 따른 작약 추출물은 실질적으로 부작용이나 독성이 없이 안전하게 투여할 수 있는 약제로 판단되며, 약학적 조성물을 임상적으로 이용시 약제학적 분야에서 통상적인 방법에 따라 통상적인 약제학적 제제로 제형화시켜 이용할 수 있다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용효과를 실시예를 통하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리범위는 이에 한정되지 않는다.

실시예 1. 작약 추출물 (extract)의 제조

작약을 건조약재의 상태로 경동약령시장에서 구입하여 추출용 재료로 사용하였다. 작약 건조약재와 에탄올(ethanol)을 각각 1 : 3(W/V)의 비율로 섞어 7일 동안 냉침하여 추출한 후, 여과종이필터을 이용하여 여과한 후 여과액을 감압농축기로 40℃에서 농축하였다.농축물을 70% 메탄올로 다시 녹인 후, 극성도에 따라 4가지 용매(헥산, 에틸아세테이트, 부탄올, 물)를 이용하여 순차적으로 추출하여 감압농축기를 사용하여 40℃에서 농축하였으며, 물층은 동결건조기를 이용하여 동결건조하여 추출물 시료로 사용하였다.

실시예 2. 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스의 단리

에틸아세테이트 추출물 14.4g 중 77 mg을 주입하여 고속 액체 크로마토크래피(High performance liquid chromatography, AKTA explorer 10, Amersham Pharmacia사)의 실리카 컬럼(23 × 250 mm, DAISO사)에 이동상 용매로 (사이클로헥산-아이소프로판올 (0 : 20 -> 20 : 80))의 농도를 변화시키면서 시험관에 17 ml을 받아 36개의 분획물을 얻어 농축기(speed vac)를 이용하여 감압농축 시킨 후에 분획물 시료로 사용하였다. 분리된 분획들 중 가장 효과가 좋은 18번째 분획을 같은 조건으로 반복해서 얻은 후 농축기를 이용하여 감압농축하여 모았다. 모은 18번째 분획을 고속액체크로마토크래피(Waters Delta 600)의 실리카 젤(23 × 250 mm, DAISO사)에 100 mg을 주입한 후 이동상 용매인 사이클로헥산과 아이소프로필알콜 농도를 변화(100 : 0 -> 0 : 100) 시키면서 시험관에 받아 5개의 분획물을 얻어 농축기(speed vac)를 이용하여 감압농축 시킨 후에 분획물 시료를 모았다. 실험을 통해 활성이 가장 좋은 5번 분획을 고속액체크로마토크래피(Waters Delta 600)의 프리펙 컬럼(Prepak C18 cartridge, 19 × 300 mm, Waters사)에 100 mg을 주입한 후 이동상 용매인 물과 아세토나이트릴(acetonitrile)의 농도를 변화(100 : 0 -> 0 : 100)시키면서 시험관에 받아 3개의 분획물 중 가장 활성이 높은 두 번째 분획을 모아 농축기(speed vac)를 이용하여 감압농축 시킨 후에 단리된 순수물질을 53 mg 확보하였고, 핵자기 공명스펙트럼과 질량 분석기로 분석한 결과 단리된 물질이 화학식 1에서 보는 바와 같이 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스임을 확인하였다.

작약으로부터 단리된 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스는 20 mg/ml로 DMSO에 녹여 -20℃에 보관하였다. 이하 본 발명의 조성물의 B형 간염 바이러스 억제능을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

실시예 3. B형 간염 바이러스 저해활성 검색

2.2.15 cell line을 5% 우태아혈청 (fetal bovine serum)과 350 μg/ml 젠타마이신 (G-418), 이 들어있는 RPMI-1640 배지에서 37℃, 5% CO2, 100% humidity의 조건으로 계대배양을 한다. 24-well plate에 10x104 cells/well의 세포를 넣고, CO2 incubator에서 상기의 조건으로 배양한다. test할 시료와 배지는 2, 4, 6일에 새것으로 교환하고, 8일째에는 배지만 바꾸어준 후 48시간 더 배양한다. 0.4 ml의 배지를 바이러스 DNA 정량을 위하여 사용하며, 남아있는 세포는 크리스탈 바이올렛(crystal violet)을 이용하여 생존율 검사를 한다. 이때 세포독성은 DMSO의 값을 대조군으로 보고 % of control을 이용하여 CC50 (50% 세포독성)으로 나타내다. 바이러스 DNA의 측정은 슬롯 블롯 혼성화 (slot blot hybridization) 기술을 이용한다. 슬롯 블롯 장치에 변성 (denature)시킨 배지를 넣고 나일론 멤브레인 (nylon membrane)에 블롯팅 한다. PCR로 HBV DNA의 일부를 증폭시켜 만든 677-bp probe를 42℃에서 20 시간 혼성화 (hybridization) 하고 이이지 분석기로 분석한다. 그리고 시료에 대한 항 바이러스 효과는 DMSO의 값을 재조군으로 보고 상대값을 계산해서 나타낸다.

HBs항원은 세포에 천연물을 처치한 후 8일째 세포배양액을 수거하여 면역키트를 이용하여 측정하고, 그 값을 DMSO 처리군과 비교하여 대조군의 항원생성 억제능을 측정하였다.

B형 간염 바이러스 저해활성(100 μg/ml)

추출물	B형 간염 바이러스 억제율(%)	세포독성(%)
메탄올 추출물	25.7	2.5
헥산 추출물	7.5	3.8
에틸 아세테이트 추출물	72.5	4.5
부탄올 추출물	32.2	3.1
물 추출물	1.4	0.3

표 1에서 보는 바와 같이 작약의 메탄올, 에틸 아세테이트, 부탄올 추출물은 B형 간염 바이러스의 증식을 억제하는 효과를 보여 주고 있으며, 세포독성이 거의 없어 안전하게 사용할 수 있음을 알 수 있다.

또한, 가장 효과가 우수한 에틸 아세테이트를 활성추적을 통해 분리한 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스의 B형 간염 바이러스 저해활성 저해 활성은 도 1에 나타내었는데, 도 1에서 보는 바와 같이 농도 의존적으로 억제를 하는 것으로 나타났으며, 50% 억제하는 농도가 1.0 μg/ml로 매우 우수한 것으로 나타났다.

또한, 도 2에서 보는 바와 같이 HBs항원을 농도 의존적으로 억제하고, 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스의 최고농도인 4 μg/ml에서 약 25% 억제하여 HBs항원 억제능도 우수한 것으로 나타났다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명은 작약추출물과 작약의 주성분 하나인 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스는 B형 바이러스 억제효과가 우수하여 B형 간염 치료제로 사용될 수 있는 유용한 발명인 것이다.

Claims

삭제
하기 화학식 1의 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-베타-D-글루코오스 화합물을 유효성분으로 하는 B형 간염 치료용 조성물.