CN105111252B

CN105111252B - 烯炔糖苷酯类化合物及其药物组合物和应用

Info

Publication number: CN105111252B
Application number: CN201510584906.7A
Authority: CN
Inventors: 陈纪军; 耿长安; 黄晓燕; 马云保; 赵勇; 张雪梅
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2015-09-15
Filing date: 2015-09-15
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2035-09-15
Also published as: CN105111252A

Abstract

本发明提供结构式(I)所示的两个烯炔糖苷酯类化合物3S,8S‑二羟基‑9‑癸烯‑4,6‑二炔1‑O‑(6'‑O‑咖啡酰基)‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷(3S,8S‑dihydroxydec‑9‑en‑4,6‑yne 1‑O‑(6'‑O‑caffeoyl)‑β‑D‑glucopyranoside，1)和3S,8S‑二羟基‑9‑癸烯‑4,6‑二炔1‑O‑(2'‑O‑咖啡酰基)‑β‑D‑吡喃葡萄糖苷(3S,8S‑dihydroxydec‑9‑en‑4,6‑yne 1‑O‑(2'‑O‑caffeoyl)‑β‑D‑glucopyranoside，2)，以治疗有效量的化合物1或/和2及可药用载体或赋型剂组成的药物组合物，化合物1或/和2及其药物组合物的制备方法，以及它们在制备治疗人类疾病尤其是在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

Description

烯炔糖苷酯类化合物及其药物组合物和应用

技术领域：

本发明属于药物技术领域。具体地，涉及两个新的烯炔糖苷酯类化合物1和2，以化合物1或/和2为活性成分的治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，它们的制备方法，以及它们在制药中的应用，特别是在制备抗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

背景技术：

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的乙型病毒性肝炎是影响人类健康的严重传染性疾病。特别是慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B,CHB)可长期携带，是引发肝硬化、肝癌的主要病因。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界共有20亿HBV携带者，其中CHB患者约3.5亿；中国作为高发区，HBV携带约1.2亿人，CHB患者超过3000万(林永焕.乙型肝炎预防与治疗[M].北京:科学技术文献出版社,2007.；Lavanchy D.JViralHepatitis.2004,11,97-107.)。现有的抗HBV药物(主要包括疫苗、干扰素和核苷类)的疗效已得到确认，其中疫苗以预防为主，对已感染者无效；干扰素和核苷类药物因副作用明显、易产生耐药性、作用靶点单一(HBV聚合酶)等原因尚不能满足临床治疗需要(AntonioC.,等.J Hepatol.2006,44,77-83；Lv Z.L.,等.J Med Chem.2010,53,660-668.；吴剑涓.天津药学.2006，18，49-52.)。目前乙型肝炎是威胁全世界人类健康的重要疾患，结构和作用机制新颖的抗HBV药物仍然是全球药物研发的热点。

天然产物结构复杂多样，从中寻找高效低毒、作用靶点新颖的先导化合物已经成为新型抗HBV药物研发的重要组成部分。茵陈为菊科植物滨蒿Artemisia scopariaWaldst.et Kit.或茵陈蒿Artemisia capillaris Thunb.的干燥地上部分。《中国药典》中收录的多种治疗乙肝的中药制剂(乙肝宁颗粒、乙肝养阴活血颗粒、小儿肝炎颗粒、护肝片等)中均以茵陈作为主要药效组分(中国药典，2010版)。中医认为其气芳香，有清湿热，退黄疸的功效，临床上主要用来治疗黄疸尿少、湿疮瘙痒、黄疸型传染性肝炎等症状。为揭示茵陈蒿和滨蒿的活性成分，中外研究者对其化学成分进行了较多研究，表明茵陈中主要含有香豆素，烯炔，黄酮，三萜，甾体，长链脂肪族化合物，及挥发油等(Wu,T.S.,等.Bioorg MedChem.2001，9，77-83；Okuno,I.,等.Chem Pharm Bull.1988，36，769-775)。然而，现有文献中对于这些化合物活性的报导主要集中在保肝利胆方面，其抗HBV活性研究较少，仅见2014年赵勇等从茵陈蒿中分离得到系列倍半萜、绿原酸衍生物、三萜、黄酮、木质素和酚酸类成分具有一定的体外抗HBV活性(Zhao Y.,等.Fitoterapia.2014，95,187-193.；Zhao Y.,等.J.Ethnopharmacol.2014，156,147-154.)。

迄今，现有技术中无化合物3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(6'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(2'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，2)的报道，也没有化合物1或/和2作为有效成分的药物组合物的报道，也没有化合物1或/和2药物组合物在制备或治疗乙型病毒性肝炎药物中的应用报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供一类新的具有药用价值的式(I)所示的化合物3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(6'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(2'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，2)，含有治疗乙型病毒性肝炎有效量的化合物1或/和2及药用载体或赋形剂的药物组合物，化合物1或/和2及其药物组合物的制备方法，化合物1或/和2及其药物组合物在制备抗乙型病毒性肝炎药物中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

结构式(I)所示的化合物3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(6'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(2'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，2)，

药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)化合物1或/和2，和药学上可接受的载体。

用于治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物，其中含有治疗有效量的式(I)化合物1或/和2，和药学上可接受的载体。

如所述的药物组合物，为治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物。

所述式(I)的化合物1或/和2在制备治疗人类疾病或病症的药物中的应用。

如所述的应用，所述的疾病是乙型病毒性肝炎。

所述药物组合物在制备治疗人类疾病或病症的药物中的应用。

如所述的应用，所述的疾病是乙型病毒性肝炎。

制备权利要求1所述式(I)化合物1和2的方法，取茵陈蒿(Artemisia capillaris)或滨蒿(Artemisia scoparia)干燥全草，粉碎，用90％乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收乙醇得浸膏。浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇-水(9:1:0、9:1:0.1、8:2:0.2、6:4:0.4)梯度洗脱，得到5个组分A-E，组分D经过MCI CHP-20P gel柱中压制备，乙腈-水(20:80至80:20)梯度洗脱，得到5个流份D-1～D-5。D-4经硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇-水8:2:0.2洗脱，得到两个流分D-4-1和D-4-2。D-4-2经Rp-C₁₈柱中压制备，乙腈-水21:79洗脱，纯化得到化合物1和2。

制备含化合物1或/和2的药物组合物的方法是以化合物1或/和2为原料，加入可药用载体或赋形剂。

本发明化合物1或/和2用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1～99％，优选为0.5～90％的化合物1或/和2，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。

附图说明：

图1为本发明化合物1和2的2DNMR相关和ECD谱；

图2为本发明化合物1和2的结构式。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明的实质，下面结合附图，用本发明的试验例和实施例来进一步说明本发明化合物3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(6'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(2'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，2)的药理作用结果，以及本发明的制备方法及药物组成，但不以此试验例和实施例来限定本发明。

试验例1：

化合物1和2对乙肝病毒表面抗原(HBsAg)和乙肝病毒e抗原(HBeAg)的分泌以及乙肝病毒DNA(HBV DNA)复制的抑制作用以及对HepG 2.2.15细胞的细胞毒性。

1材料和方法

1.1材料:3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(6'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(3S,8S-dihydroxydec-9-en-4,6-yne 1-O-(2'-O-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside，2)；泰诺福韦(江西晨阳药业有限公司)；HepG 2.2.15细胞(广州空军医院)；高糖DMEM(GIBCO)；G418(GIBICO)；胎牛血清(GIBICO)；L–谷氨酰胺(AMRESCO)；青霉素，链霉素[石药集团中诺药业(石家庄)有限公司]。

1.2仪器：酶标仪Bio-RAD 680(美国)；CO₂培养箱Thermo Forma 3310(美国)；倒置生物显微镜XD-101型(南京)；荧光定量PCR仪Mastercycler ep realplex型(德国eppendorf公司)；低温高速离心机Centrifuge 5415D型(德国eppendorf公司)。

1.3实验过程：HepG 2.2.15细胞生长培养基组成为高糖DMEM，10％的胎牛血清，0.03％L–谷氨酰胺，100mg/L G418,100IU青霉素以及100IU链霉素。维持液组成为高糖DMEM，2％的胎牛血清，0.03％L–谷氨酰胺，100mg/L G418,100IU青霉素以及100IU链霉素。供试药物由维持液稀释配制成一定浓度的含药培养基。将胰酶消化后的单细胞悬液接种于细胞板上，于48h后换为含药培养基，每种药物用维持液四倍稀释为四个药物浓度，同时设置只加维持液的细胞对照组，并以泰诺福韦做阳性药物对照。用MTT法测定药物对细胞的毒性；用酶联免疫法测定HBsAg和HBeAg载量，用荧光定量PCR法检测HBV DNA载量。

1.3.1药物细胞毒性测定：

根据Mosmann建立的MTT法检测药物的细胞毒性。具体方法是：HepG 2.2.15细胞接种于48孔板，3×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h，吸除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中继续培养72h后吸除培养基，按0.2mL每孔加入浓度为0.8mg/mL的MTT，于37℃5％CO₂孵育4h后弃上清，每孔中加入0.2mL二甲基亚砜，于37℃孵育10min，至生成的蓝紫色结晶物完全溶解，在酶标仪上测定溶液在490nm下的吸光度值。根据结果计算药物对细胞的破坏百分率：

η_destroy＝(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100％。

1.3.2抑制HBsAg和HBeAg分泌活性的测定：

利用ELISA(酶联免疫吸附试验)法，测定样品对HBsAg和HBeAg抑制活性。HepG2.2.15细胞接种于48孔板，3×10⁴细胞每孔，加入生长培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h，吸除原培养基，加入不同浓度含药培养基，于5％CO₂，37℃培养箱中培养72h。取上清液，分别利用HBsAg和HBeAg试剂盒检测。利用酶标仪测定溶液在的吸光度值(490nm)。

抑制率η_inhibitory＝(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100％

IC₅₀＝Anti lg[(50–<50％抑制率)/(>50％抑制率–<50％抑制率)×lg(稀释倍数)+lg(<50％抑制率的浓度)]

SI＝CC₅₀/IC₅₀

1.3.3抑制HBV DNA复制活性的测定：

具体方法是：HepG 2.2.15细胞按5×10⁵个每孔接种于24孔细胞板，于5％CO₂，37℃培养箱中用生长培养基培养，72h后更换为含药培养基，48h后继续以含药培养基更换原培养基，培养48h。使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Gemomic DNAKit，TIANGEN，China)提取细胞DNA。用HBV核酸定量检测试剂盒(QIAGEN,Co.,Ltd,Shenzhen)荧光定量PCR法定量检测HBV DNA载量。取2μL DNA样品，加入37.6μL HBV PCR反应液，0.4μLTaq酶，0.06μL UNG。PCR反应在Mastercycler Ep Realplex System定量PCR仪(Eppendorf,Masteraycler Eprealplex,German)上进行，扩增程序为：37℃：5min；94℃：1min；95℃：5sec，60℃：30sec，40个循环。根据结果计算药物的抑制百分率：

η_inhibition＝(A_{细胞对照组}–A_{供试样品组})/(A_{细胞对照组}–A_空白组)×100％。

2.结果：

CC₅₀为半数细胞致死浓度，根据破坏百分率η_destroy计算得到。IC₅₀为半数病毒抑制浓度，根据抑制百分率η_inhibition计算得到。最终结果以选择指数(SI＝CC₅₀/IC₅₀)来评价。

CC₅₀，IC₅₀及SI的计算公式：

A＝log(>50％时的η_destroy/η_inhibition的药物浓度)

B＝log(<50％时的η_destroy/η_inhibition的药物浓度)

C＝|A–B|

CC₅₀＝Anti log[(50–<50％时的η_destroy)×C/(>50％时的η_destroy–<50％时的η_destroy)]+B

IC₅₀＝Antilog[(50–<50％时的η_inhibition)×C/(>50％时的η_inhibition–<50％时的η_inhibition)]+B

SI＝CC₅₀/IC₅₀

具体结果见表1：

表1 4-[6-乙基-4-(1H)-吡啶酮-2-基]-3R-O-β-D-吡喃葡萄糖基丁酸(1)在HepG2.2.15细胞上对HBV抑制活性和细胞毒性(单位mM)

3、结论：

实验结果显示，化合物1和2在体外对HBsAg的分泌以及HBV DNA复制都具有显著的抑制作用，化合物1抑制HBsAg的IC₅₀值为0.79±0.23，抑制HBV DNA复制的IC₅₀值为0.07±0.04，选择指数分别为2.1和23.6；化合物2抑制HBsAg的IC₅₀值为0.88±0.20，抑制HBV DNA复制的IC₅₀值为0.12±0.05，选择指数分别为2.3和17.1。与阳性药物泰诺福韦相比，化合物1和2不但抑制HBV DNA的复制，亦可抑制HBsAg的分泌，提示可能具有不同的作用机制。

实施例1：

化合物1和2的制备：

化合物1和2的提取分离：

取茵陈蒿(Artemisia capillaris)或滨蒿(Artemisia scoparia)干燥全草，粉碎，用90％乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收乙醇得浸膏。浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用氯仿-甲醇-水(9:1:0、9:1:0.1、8:2:0.2、6:4:0.4)梯度洗脱，得到5个组分A-E，组分D经过MCI CHP-20Pgel柱中压制备，乙腈-水(20:80至80:20)梯度洗脱，得到5个流份D-1～D-5。D-4经硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇-水8:2:0.2洗脱，得到两个流分D-4-1和D-4-2。D-4-2经Rp-C₁₈柱中压制备，乙腈-水21:79洗脱，纯化得到化合物1(12mg)和2(15mg)。化合物1和2的结构通过¹H，¹³C-NMR、HSQC、HMBC、¹H-¹HCOSY、ROESY、IR，UV，HRESIMS、ECD，以及旋光等数据得以确定。

化合物1和2的结构数据：

旋光由Jasco model 1020旋光仪(Horiba，Tokyo，Japan)测定；红外光谱(IR)采用KBr压片法，由Bio-Rad FTS-135型红外光谱仪(Hercules,California,USA)测定；紫外光谱由UV-2401PC型紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；ECD谱由Applied Photophysics圆二色谱仪(Agilent,Santa Clara,United States)测定，核磁共振谱(1D和2D NMR)用AVANCE III-600型超导核磁共振仪(Bruker,Bremerhaven,Germany)测定，以氘代甲醇作为溶剂，TMS(四甲基硅烷)作内标；高分辨质谱(HRMS)用LCMS-IT-TOF型质谱仪(Shimadzu,Kyoto,Japan)测定；薄层色谱硅胶、柱层析硅胶(200-300目)购自青岛美高及青岛海洋化工集团有限公司。Sephadex LH-20凝胶购自Pharmacia Fine Chemical Co.,Ltd.(Uppsala,Sweden)，CHP20PMCI凝胶购自Mitsubishi Chemical Corporation(Tokyo,Japan)。

化合物1

分子式：C₂₅H₂₈O₁₁

分子量：504.16

性状：无色油状物

旋光(c 0.2，甲醇)

HRESIMS(+)m/z:实验值503.1534，计算值503.1559(C₂₅H₂₇O₁₁,[M-H]^-)。

IR(KBr)v_max:3441,3425,2151,1694,1632,1610,1524,1446,1279,1166,1084,1054,1023cm^–1。

UV/Vis(甲醇)λ_max(logε):582(2.05),548(2.02),330(4.14),218(4.15),201(4.23)nm。

CD(0.0002M,MeOH)λ_max(Δε)196(-35.9)nm。

¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表2

化合物2

分子式：C₂₅H₂₈O₁₁

分子量：504.16

性状：无色油状物

旋光(c 0.04，甲醇)

HRESIMS(+)m/z:实验值503.1548，计算值503.1559(C₂₅H₂₇O₁₁,[M-H]^-)。

IR(KBr)v_max:3416,2925,2252,2151,1690,1631,1604,1517,1445,1274,1165,1053,1023cm^–1。

UV/Vis(甲醇)λ_max(logε):330(4.52),300(4.45),202(4.79)nm。

CD(0.0001M,MeOH)λ_max(Δε)196(-64.0)nm。

¹H-NMR和¹³C-NMR数据见表2

表2.化合物1和2的¹H-NMR和¹³C-NMR数据

实施例2：

化合物组合药物剂型—片剂：

本发明的化合物1或/和2作为有效成分的药物组合片剂的制备：使用化合物1或/和2作为药物活性成分，使用表3所述赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分，按照比例配比制成每片含有化合物1或/和2的药物成分5～60mg的片剂样品，表3给出普通片剂的配方比例：

表3 本发明化合物1或/和2组合药物片剂的原料药和辅料配方

将一定数量化合物1或/和2与赋形剂、辅料制备成不同剂量片剂制剂的方法是将几种赋形剂辅料与原料药均匀混合，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料，过筛制粒，湿粒烘干并过筛整粒，加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀后压片即得。

实施例3：

化合物组合药物剂型—胶囊：

含有化合物1或/和2作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备：使用化合物1或/和2样品作为药物活性成分，使用表中几种赋形剂作为制备组合药物胶囊的辅料成分，按照比例配比制成每粒胶囊中含有化合物1或/和2的药物成分5～50mg的胶囊制剂，表4给出普通胶囊制剂的配方比例：

表4 化合物组合药物胶囊制剂的原料药和辅料配方

将一定数量的化合物1或/和2样品与赋形剂辅料制备成胶囊制剂的方法是：将几种赋形剂辅料与的化合物1或/和2混合均匀，加入1％羟甲基纤维素钠溶液适量，制成湿粒烘干过筛整粒，加入硬脂酸镁混合均匀，装入入胶囊制得；或不使用制粒步骤，而直接将化合物1或/和2与几种赋形剂辅料混合均匀，过筛后，直接装入胶囊制得。

实施例2和3的化合物样品的给药剂量范围，使用实施例2和3的化合物成分作为药物活性成分，每日用药剂量特征是在5～200mg范围内。

Claims

1.结构式(I)所示的化合物3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(6'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(1)和3S,8S-二羟基-9-癸烯-4,6-二炔1-O-(2'-O-咖啡酰基)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)，

2.含有治疗有效量的权利要求1所述的式(I)化合物1或/和2和药学上可接受的载体的药物组合物。

3.含有治疗有效量的权利要求1所述的式(I)化合物1或/和2和药学上可接受的载体的用于治疗乙型病毒性肝炎的药物组合物。

4.权利要求1所述的式(I)的化合物1或/和2在制备治疗乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

5.权利要求2或3所述的药物组合物在制备治疗或预防乙型病毒性肝炎的药物中的应用。

6.制备权利要求1所述的式(I)化合物1和2的方法，取茵陈蒿或滨蒿干燥全草，粉碎，用90％乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用9:1:0、9:1:0.1、8:2:0.2、6:4:0.4的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，得到5个组分A-E，组分D经过MCI CHP-20P gel柱中压制备，20:80至80:20的乙腈-水梯度洗脱，得到5个流份D-1～D-5，D-4经硅胶柱层析，以8:2:0.2的乙酸乙酯-甲醇-水洗脱，得到两个流分D-4-1和D-4-2，D-4-2经Rp-C₁₈柱中压制备，21:79的乙腈-水洗脱，纯化，得到化合物1和2。

7.制备权利要求2所述的药物组合物的方法，取茵陈蒿或滨蒿干燥全草，粉碎，用90％乙醇回流提取两次，每次3小时，合并乙醇提液，减压回收乙醇得浸膏，浸膏用80％乙醇溶解吸附于硅胶上，室温放置挥干溶剂，研碎过筛后经硅胶柱层析，用9:1:0、9:1:0.1、8:2:0.2、6:4:0.4的氯仿-甲醇-水梯度洗脱，得到5个组分A-E，组分D经过MCI CHP-20P gel柱中压制备，20:80至80:20的乙腈-水梯度洗脱，得到5个流份D-1～D-5；D-4经硅胶柱层析，以乙酸乙酯-甲醇-水8:2:0.2洗脱，得到两个流分D-4-1和D-4-2；D-4-2经Rp-C₁₈柱中压制备，乙腈-水21:79洗脱，纯化得到化合物1和2，再以化合物1或/和2为原料加入可药用载体。