WO2013078764A1 - 1β-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用 - Google Patents

1β-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用 Download PDF

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hydroxy
rheumatoid arthritis
lactone
tablet
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张卫东
胡振林
苏娟
单磊
柳润辉
李慧梁
徐希科
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中国人民解放军第二军医大学
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    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the invention relates to a traditional Chinese medicine, in particular to the application of ⁇ -hydroxyxulinone in the preparation of a medicament for preventing and treating rheumatoid arthritis.
  • RA Rheumatoid arthritis
  • RA Rheumatoid arthritis
  • the disease occurs in small joints such as hands, wrists, and feet. It is easy to recurrent and is symmetrically distributed. In the early stage of the disease, there are joint redness, heat, pain and dysfunction. When the disease reaches the advanced stage, the joints may have different degrees of stiffness and deformity, accompanied by atrophy of the bone and skeletal muscles, which is easily disfigured.
  • rheumatoid arthritis is a major involvement of the synovial membrane (which can later affect the articular cartilage, bone tissue, joint ligaments and muscle bonds), followed by the serosa, heart, lungs and eyes. Extensive inflammatory disease of connective tissue. Systemic manifestations of rheumatoid arthritis include fever, fatigue, pericarditis, subcutaneous nodules, pleurisy, arteritis, and peripheral neuropathy. However, there is no specific treatment for rheumatoid arthritis, and it is still in the treatment stage for inflammation and sequelae.
  • Inula L. is a genus of Compositae. There are about 100 species in the world, mainly in Asia, Europe and Africa, and the Mediterranean region. There are more than 20 species in China, and many species of this genus are often used for medicinal purposes. For example, L helenium can be used as a stomach, diuretic, sputum and anthelmintic drug. I. britannica has a phlegm , qi, soft, water and other effects.
  • sesquiterpenoids are characteristic components of the genus of the genus, and are mainly brothel type, gemasane type and guaiac wood type, including pseudo guaiac raft type, split ring brothel type, and oyster type. , Xanthium and a small amount of acyclic sesquiterpenes and sesquiterpene dimers. Studies have shown that sesquiterpenoids in this genus have the functions of deworming, insecticidal, antibacterial, antitumor, antiviral and immunosuppressive.
  • Inulajaponica is also known as Golden Buddha, Golden Buddha Grass (Jiangsu and Zhejiang), June Ju (Hebei). Perennial herb. Rhizome short, traversing or oblique, with thick fibrous roots. It is distributed in northern China, northeastern, central, eastern, Sichuan, Guangdong and other places, and is available for medicinal purposes. The roots and leaves of the invertebrate flower can treat the scalp and sputum poisoning; the decoction can relieve asthma and relieving cough; the flower is the stomach and phlegm medicine, and also treats the chest suffocation, stomach swelling, hernia, cough, vomiting, etc. Jiangsuzhou Herbal Medicine”:).
  • the technical problem to be solved by the present invention is to study the application of the extract of the invertebrate flower, 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone, in the preparation of a medicament for treating rheumatoid arthritis.
  • the present invention provides an application of ⁇ -hydroxyxulinone in the preparation of a medicament for the prevention and treatment of rheumatoid arthritis.
  • the 1 ⁇ -hydroxyxulinone of the present invention is prepared by the following method:
  • the extracted 1 ⁇ -hydroxyxulinolactone is tested in animal efficacy, and the results show that 1 ⁇ -hydroxyxulinolactone can inhibit the clinical onset of CIA (Collagen-Induced Arthritis) and significantly inhibit The severity and incidence of CIA. It can also down-regulate TNF- ⁇ (tumor necrosis factor a), IL-17 (interleukin-17) and IFN- y (interferon gamma) in spleen cell supernatant, and inhibit the pro-inflammatory cytokines TNF-a, IFN- ⁇ and IL. - 17 secretion, which has a protective effect on CIA disease.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor a
  • IL-17 interleukin-17
  • IFN- y interferon gamma
  • TNF-a and IFN- ⁇ play an important role in the pathogenesis of RA.
  • TNF-a can directly induce proteolytic enzymes Synthesis, causing damage to the matrix structure.
  • the experimental results also showed that ⁇ -hydroxyxulinolactone can significantly reduce the secretion of TNF- a from spleen cells.
  • the use of anti-TNF- ⁇ therapy has achieved good results in the treatment of RA, which not only prevents bone tissue damage but also inhibits IL-17 production. 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone control of inflammation and protection of joint tissues may be related to its reduction of TNF-a content.
  • IFN- ⁇ is mainly secreted by CD4+ T cells infiltrated in the lesion, which activates macrophages, and activated macrophages subsequently express various inflammatory factors, which participate in and aggravate the inflammatory response; IFN- ⁇ can also induce MIP-1 a, MIP-1 ⁇ and IP-10 expression, these chemokines are involved in the process of lymphocyte migration to the lesion.
  • IP-hydroxyxulinolactone significantly reduced the level of IFN- ⁇ in vivo, possibly associated with blocking subsequent migration of lymphocytes. It has been reported that TNF-a and IFN- ⁇ co-stimulate fibroblasts and human microvascular endothelial cells in vitro to induce the production of chemokine CXCL10.
  • Elevated IL-15 in a rheumatoid arthritis model can exert its pro-inflammatory cytokine properties by inducing IL-17, which may be caused by cyclosporin A and steroid-sensitive pathways in joints. IL-17 is over-secreted. In addition to stimulating the release of various inflammatory mediators by synoviocytes, IL-17 also stimulates bone resorption by stimulating RANKL and RANK. It is currently recognized as the most important cytokine in rheumatoid arthritis bone destruction pathology. One.
  • 1 ⁇ -hydroxyxulinolactone has a significant effect on CIA, which can significantly inhibit the clinical pathogenesis of CIA, inhibit the production of IL-17, and reduce the secretion of inflammatory cytokines TOF-ot and IFN- ⁇ .
  • CIA can significantly inhibit the clinical pathogenesis of CIA, inhibit the production of IL-17, and reduce the secretion of inflammatory cytokines TOF-ot and IFN- ⁇ .
  • the medicament for the preparation of rheumatoid arthritis is a pharmaceutical composition prepared by using 1 ⁇ -hydroxyxyllactone as an active ingredient and a conventional pharmaceutical carrier.
  • the drug combination The substance may be a tablet, a dispersible tablet, a tablet, an orally disintegrating tablet, a sustained release tablet, a capsule, a soft capsule, a dropping pellet, a granule, an injection, a powder injection or an aerosol. Has a large clinical application value.
  • Fig. 2 Results of detection of cytokine TNF- ⁇ in spleen cell supernatant; column 1: blank group column 2: model group column 3: methotrexate group column 4: 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone 0.2 mg/kg column 5: 13-hydroxyxulinone lmg/kg column 6: 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone 2 mg/kg *P ⁇ 0.05 ** P ⁇ 0.01
  • Fig. 3 Results of cytokine IL-17 detection in spleen cell supernatant; column 1: blank group column 2: model group column 3: methotrexate group column 4: IP-hydroxyxyl lactone 0.2 mg/kg column 5: 1 ⁇ -hydroxyxulinone lmg/kg column 6: 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone 2 mg/kg *P ⁇ 0.05 ** P ⁇ 0.01
  • Fig. 4 Results of detection of cytokine IFN- ⁇ in spleen cell supernatant; column 1: blank group column 2: model group column 3: methotrexate group column 4: 16-hydroxyxyl lactone 0.2 mg/kg column 5: 13-hydroxyxulinone lmg/kg column 6: IP-hydroxylulinol 2 mg/kg *P ⁇ 0.05 ** P ⁇ 0.01 Detailed Description
  • the ground part of the dried inlaid flower (Ljaponica) (including stems, leaves, flowers, collected from Wuzhou, Anhui province) was 10.0 kg of powder, and extracted with 95% ethanol for 3 times at room temperature (temperature 25 ° C) (100 L each time) , each time is 24, 12, 12 hours. Diluted 427.5 g of the obtained crude extract with an appropriate amount (10 L) of water, followed by petroleum ether (four times, 40 L each time), dichloromethane (four times, 40 L each time), ethyl acetate (four times) , 40L each time, n-butanol extraction (four times, 40L each time).
  • Example 1 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone: Prepared in Example 1, at 3%.
  • the CMC-Na (carboxymethylcellulose sodium) solution was dissolved into a 1 mg/ml solution.
  • Different doses were intraperitoneally injected according to the animal's body weight at the time of administration.
  • IFA Incomplete Freund's Complete Adjuvant
  • Phosphate buffered saline Prepared by the laboratory: 8 g of NaCl, 0.2 g of KCl, 1.44 g of Na 2 HP 0 4 and 0.24 g of KH 2 PO 4 were dissolved in 800 ml of distilled water. Adjust the pH to 7.4 with hydrochloric acid, dilute to 1 L with water, filter and sterilize;
  • Methotrexate tablets Shanghai Pharmaceutical (Group) Co., Ltd. Xinyi Pharmaceutical Factory (080605)
  • High-speed benchtop centrifuge Eppendorf; high-speed benchtop cryogenic centrifuge, HITACHI; inverted microscope, Nikon; ultra-clean platform, manufactured by Sujing Group Antai; electric thermostatic blast drying oven, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.; Humidity C0 2 Incubator, Heraus Company; Constant Temperature Water Bath, Shanghai Guohua Electric Co., Ltd.
  • CFA Complete Freund's Adjuvant
  • glacial acetic acid preparation 11.43 ⁇ 1 glacial acetic acid dissolved in 20ml of deionized water, filtered, 4'C spare.
  • C II was dissolved in 0.01 M glacial acetic acid to a final concentration of 4 mg/ml and stored at 4 °C.
  • Emulsification of the antigen Connect two glass needles with a tee, PBS, complete Freund's adjuvant and antigen C
  • each ⁇ emulsion contains 20 ( ⁇ g CII and 50 ⁇ 1 complete Freund's adjuvant), after removing the bubbles in the needle tube, push the needle tube back and forth about 500 times, and fully mix the components in the needle tube into emulsification Status.
  • the 2-3 ⁇ m of the tail of the mouse was given ⁇ /only the emulsified C II antigen was injected subcutaneously; on the 21st day, the booster was 50 ⁇ l.
  • ⁇ and 150 ⁇ 1 ⁇ 8 were thoroughly mixed, 150ul/intraperitoneal injection; the normal group was injected with normal saline.
  • mice were randomly divided into 6 groups, 12 in each group, which were normal group, CIA model group, and positive control group (metamethazine 2 mg kg); 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone component was high, medium and low.
  • the three dose groups were administered at 10 mg/kg, 5 mg/kg, and 1 mg/kg, respectively.
  • the IP-hydroxyxyl lactone group was administered continuously at 10 mg/kg, 5 mg/kg, 1 mg/kg on the day before the second immunization (Day 20) to Day 34, and each of the methotrexate groups was administered. The day was administered at 2 mg/kg, and the normal group and the model group were given drinking water at 10 ml/kg.
  • the systemic joint lesions of the mice were recorded regularly, and the disease rate and the average disease index were calculated according to the 3-level scale.
  • the specific scoring criteria are: 0 points - normal joints; 1 point - slight redness of joints; 2 points - severe joint swelling, involving the entire joint, limited mobility; 3 points - paw or joint dysfunction, joint stiffness.
  • the sum of the extremities was scored in mice, with a maximum of 12 points.
  • mice were sacrificed, fixed, and the abdominal skin was cut open, and the inguinal lymph nodes were taken. After opening the abdominal cavity, the spleen was removed, and immediately placed in a 15 ml centrifuge tube containing 1640, placed on ice; the spleen was poured into a 70 ⁇ cell grinding filter. In the net, fully grind with a lml syringe needle to make a cell suspension; collect the cell suspension, centrifuge at 4 ° C, 1000 rpm for 8 min, discard the supernatant after centrifugation; break up the cells and add 0.83% ammonium chloride water.
  • MNC lymphocyte and spleen mononuclear cell
  • 1, 1 ⁇ - via base wood lactone can inhibit the clinical onset of CIA
  • mice were randomly divided into 6 groups: control group and three groups of IP-hydroxyl groups. Inulinic acid lactone group.
  • the positive control group was given 2 mg/kg methotrexate every 2 days, 10 mg/kg in the high dose group of 1 ⁇ -hydroxyxulinone, and 5 mg/kg in the middle dose group.
  • the dose group was 1 mg/kg and was administered continuously for 14 days until the end of the experiment. Mice were observed daily and each mouse was scored according to the scoring criteria. CII induced CIA, and mice developed symptoms after booster immunization.
  • 1 ⁇ -light base agaryl lactone can down-regulate TNF-ct, IL-17, IFN- ⁇ in spleen cell supernatant
  • mice were sacrificed after the disease reached the plateau stage, and the spleen cells were taken out to make a single cell suspension, 1.5 ⁇ 10 6 cells per well, and stimulated with 20 ⁇ 8 / ⁇ 1 antigen CII in vitro. The supernatant was collected after 48 hours of culture, and the cytokine was measured by ELISA by enzyme-linked immunosorbent assay.
  • Preparation method 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone, lactose and starch are mixed, uniformly moistened with water, the wetted mixture is sieved and dried, sieved, magnesium stearate is added, and then the mixture is tableted, each tablet weight 300 mg, 1 ⁇ -hydroxyxulinone content of 25 mg.
  • the preparation method comprises the steps of: dissolving 1 e-hydroxylulinolide and glucose in an appropriate amount of water for injection, filtering the obtained solution, and filling the infusion bottle under aseptic conditions, each bottle containing i-hydroxylulinolactone
  • Example 5
  • the preparation method comprises the following steps: dissolving IP-hydroxyxicolactone and mannitol in an appropriate amount of water for injection, filtering the obtained solution, charging into a vial under aseptic conditions, and lyophilizing, each containing 1 ⁇ -hydroxy Ester 10 mg.
  • Example 6 1 Effect of ⁇ -hydroxyxyl lactone on synoviocytes
  • Tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) purchased from Peprotech. Second, the experimental method
  • Synovial cells were isolated from the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients undergoing joint replacement or synovectomy, and the pure cells of the fifth generation were used for experiments.
  • the cell culture conditions were as follows: The medium containing 10% peptide bovine serum was cultured at 37 ° C, 5% CO 2 . Serum-free culture was performed after all the experiments were administered.
  • Synovial cells were plated in 96-well plates (purchased from Corning) at 2X 104/well of cells per well. After changing for 24 hours, the cells were cultured for 24 hours, and then added to the final concentration of 2.5-40 ⁇ M of 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone for 12 hours. The final concentration was 10 ng/ml tumor necrosis factor ( ), and the culture was continued for 24 hours. Methylthiazolyl tetrazolium (MTT) with a concentration of 5 mg/ml was cultured for 2 h at 37'C.
  • MTT Methylthiazolyl tetrazolium
  • phosphate buffer PBS
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the synovial cells were plated and added to the serum concentration of 2.5, 5, and ⁇ ⁇ 1 in a serum-free medium of 12, 5, ⁇ ⁇ ⁇ for 12 h, and then added with a final concentration of 10 ng/ml tumor necrosis factor (TNF- ⁇ ) for 24 h.
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor
  • the cell supernatant was centrifuged and frozen at -80 'C.
  • Cellular supernatants were assayed for interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), monocyte chemoattractant protein 1 (MCP1) and matrix metalloproteinase 3 using a commercially available ELISA kit (purchased from Invitrogen). Expression of MMP3).
  • RNA of the synoviocytes was extracted according to the instructions of the RNA extraction kit (RNAeasy mini RNA isolation kits purchased from Qiagen). The concentration of RA was measured using a multi-function microplate reader and the purity was checked.
  • the cDNA was obtained by reverse transcription using a reverse transcription kit (PrimerScript RT reagent Kit, purchased from Takara). Finally, quantitative detection was carried out using a real-time quantitative amplification kit (SYBR Premix Ex TaqTM purchased from Takara), and the primers used were synthesized by Invitrogen, see Table 1.
  • the amplification method was as follows: The cDNA and SYBR Premix Ex Taq reagent were mixed, and the corresponding gene primers were added to a 96-well RA plate, and the following cycle was performed in a real-time quantitative amplification instrument (purchased from Applied Biosystems): 95 ° C, 30 seconds; 95 ° C, 5 seconds and 55 ° C, 30 seconds cycle 30 times; dissociation determination solubility curve. Calculate the AC t value based on the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) housekeeping gene ( ⁇ The calculated results were compared with the mR A levels of unstimulated cells, and a relative increase in the amount of mRNA expression was calculated.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • 1 ⁇ -hydroxyxyl lactone inhibits the expression of inflammatory factors in synoviocytes induced by TNF- ⁇
  • TNF- ⁇ can induce the expression of inflammatory factors in synovial cells, and over-expressed inflammatory factors can promote synovial tissue proliferation and increase the migration of inflammatory cells to joint tissues. Therefore, the drug was investigated for TNF- a ⁇ induces the influence of inflammatory factor expression in synoviocytes.
  • TNF- ⁇ monocyte chemoattractant protein 1
  • MCP1 monocyte chemoattractant protein 1
  • IL-8 growth-regulated oncogene 1
  • GRO- ⁇ growth-regulated oncogene 1
  • ⁇ - ⁇ ⁇ hematopoietic negative regulator
  • RANTES normal sputum cell expression and differentiation factor
  • ⁇ 3 matrix metalloproteinase 3
  • TGF- ⁇ protective factor transforming growth factor beta
  • 1 ⁇ -hydroxyxulinone inhibited the expression of TNF- ⁇ -induced inflammatory factors in a dose-dependent manner.
  • 1 ⁇ -hydroxyxulin (2.5 - ⁇ ⁇ ⁇ ) to IL-6, MCPl , IL-8, GRO-a, MIP-1 a, RANTES, MMP3 and MMP13 inhibition rates range from 25-88%, 42-90%, 41-80%, 28-82%, 40-78%, 71 -94%, 60-90% and 27-76%.
  • IL-8 person 5' -ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' 5' -AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
  • GAPDH human 5 ' -TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3, 5 ' -CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3,

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Abstract

本发明提供了1β-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用。所述1β-羟基土木香内酯的结构式如式（I）。1β-羟基土木香内酯能够明显抑制CIA的发病严重程度和发病率，并能下调脾细胞上清液中TNF-α、IL-17、IFN-γ，抑制TNF-α、IL-17、IFN-γ的分泌。1β-羟基土木香内酯可用于制备治疗类风湿关节炎的药物，所述药物以1β-羟基土木香内酯为活性成分，与常规药用载体制成药物组合物，包括片剂、分散片、含片、口崩片、缓释片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、颗粒剂、注射剂、粉针剂或气雾剂等。

Description

ip-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用 技术领域
本发明涉及中药，具体涉及 ΐβ-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的 药物中的应用。 背景技术
类风湿性关节炎 （Rheumatoid Arthritis, RA) 是一种病因尚未明了的慢性 全身性炎症性疾病， 以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表 现， 属于自身免疫炎性疾病。 该病好发于手、 腕、 足等小关节， 易反复发作，并 呈对称性分布。患病早期有关节红肿热痛和功能障碍表现， 到达晚期时， 关节可 出现不同程度的僵硬畸形， 并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残。从病理改变的 角度来看， 类风湿性关节炎是一种主要累及关节滑膜（以后可波及到关节软骨、 骨组织、 关节韧带和肌键）， 其次为浆膜、 心、 肺及眼等结缔组织的广泛性炎症 性疾病。 类风湿性关节炎的全身性表现除关节病变外， 还有发热、 疲乏无力、心 包炎、皮下结节、 胸膜炎、 动脉炎、 周围神经病变等。但是， 类风湿性关节炎至 今尚无特效疗法， 仍处于对炎症及后遗症的治疗阶段。
旋覆花属（Inula L.)植物是菊科（Compositae)中的一属，全世界约有 100种， 分别于亚洲、 欧洲和非洲， 以地中海地区为主。 中国有 20余种， 本属多种植物常 供药用， 如土木香 (L helenium)可作为健胃、利尿、祛痰和驱虫药； 大花旋覆花 (I. britannica)具有消痰、 下气、 软坚、 行水等功效。 倍半萜类化合物是本属植物的 特征性成分， 以桉院型、 吉马烷型和愈创木垸型为主， 还包括伪愈创木垸型、裂 环桉院型、 榄垸型、 苍耳垸型和少量的无环倍半萜及倍半萜二聚体。 研究表明， 该属植物中的倍半萜类化合物具有驱虫杀虫、抗菌抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制的 功效。
旋覆花（Inulajaponica)又名金佛花， 金佛草（江浙）， 六月菊（河北）。 多 年生草本。 根状茎短， 横走或斜生， 有粗壮的须根。 分布在中国北部、 东北部、 中部、 东部、 四川、 广东等地， 可供药用。 旋覆花的根及叶可治疗刀伤疔毒；煎 服可平喘镇咳； 其花是健胃祛痰药， 也治疗胸中痞闷、 胃部膨胀、 嗳气、 咳嗽、 呕逆等（《江苏省药材志》：)。 旋覆花在古方为祛痰、 除湿、 利肠， 又为治水肿的 主要药。 本发明人对采自中国安徽亳州的旋覆花进行了系统的化学成分研究，以 期明确其化学成分， 发现旋覆花的提取物 1β-羟基土木香内酯具有治疗类风湿性 关节炎的良好活性， 宜进一步研究开发新药。 发明内容
本发明所要解决的技术问题在于研究设计旋覆花的提取物 1β-羟基土木香内 酯在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
本发明提供了 ΐβ-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应 用。
1β-羟基土木香内酯的结构式如下-
Figure imgf000004_0001
1β-羟基土木香内酯 。
本发明所述 1 β-羟基土木香内酯是通过下列方法制备得到的：
将干燥的旋覆花（L japonica) 的地上部分（包括茎， 叶和花， 采自安徽亳 州）粉粹， 室温下用 95%的乙醇， 分别以 24， 12， 12小时提取 3次。 将所得粗提 物加适量水稀释后， 依次用石油醚， 二氯甲垸， 乙酸乙酯， 正丁醇萃取。将二氯 甲垸萃取物用 200-300目的薄层硅胶分离， 用二氯甲垸 -甲醇 进行梯度洗脱。 薄 层色谱检测， 分别收集其中含有 I P -羟基土木香内酯的组分， 再采用 Sephadex LH-20进行分离， 用二氯甲烷-甲醇进行洗脱，得到混合物， 香草醛浓硫酸显色为 倍半萜类化合物， 最后采用 HPLC分离得到 1 β -羟基土木香内酯。
本发明将提取的 1 β -羟基土木香内酯进行动物药效试验，结果显示 1 β -羟基 土木香内酯可抑制 CIA (Collagen-Induced Arthritis, 胶原诱导的关节炎） 的 临床发病， 明显抑制了 CIA 的发病严重程度和发病率。并能下调脾细胞上清液中 TNF- α (肿瘤坏死因子 a ) 、 IL-17 (白介素 17) 、 IFN- y (干扰素 γ ) ， 抑制 促炎细胞因子 TNF- a、 IFN- γ和 IL- 17的分泌， 从而对 CIA疾病具有保护作用。
TNF- a和 IFN- γ在 RA发病机制中起着重要作用。 TNF- a可直接诱导蛋白水解酶的 合成，造成基质结构的破坏。实验结果也表明， ΐ β -羟基土木香内酯可较大程度 降低脾脏细胞分泌 TNF- a。用抗 TNF- α疗法在治疗 RA上取得了良好的效果，不但 阻止了骨组织破坏而且也抑制了 IL-17 的产生。 1 β -羟基土木香内酯对炎症的控 制及对关节组织的保护可能与其降低 TNF- a含量有关。 IFN- γ主要由浸润在病灶 局部的 CD4+T细胞分泌， 它可以激活巨噬细胞， 活化的巨噬细胞随后表达多种炎 症因子， 参与并加重炎症反应； IFN- γ还可诱导 MIP-1 a、 MIP-1 β和 IP-10的表 达，这些趋化因子参与淋巴细胞向病灶迁移的过程。本发明的实验中， I P -羟基 土木香内酯在体内明显降低了 IFN- Y的水平，有可能与阻断了淋巴细胞的后继迁 移有关。有研究报道， TNF- a与 IFN- Y在体外共同刺激纤维原细胞和人微血管内 皮细胞可协同诱导趋化因子 CXCL10 的产生， RA病人滑液中大量 CXCL10 的表达导 致活化 Thl细胞及自然杀伤细胞的浸润，对组织造成损伤。 （1、 Ueno A, Yamamura M, Iwahashi M, Okamoto A, Aita T， Ogawa N, Makino H. The production of CXCR3- agonistic chemokines by synovial fibroblasts from patients with rheumatoid arthritis. Rheumatol Int. 2005 Jun ; 25 (5) : 36卜 7。 2、 Bedard PA, Golds EE: Cytokine- induced expression of mRNAsfor chemotactic factors in human synovial cells and fibroblasts. J Cell Physiol 1993， 154:433-441 )。
在类风湿关节炎的模型中升高的 IL-15可通过诱导 IL-17而发挥其促炎症细胞 因子的特性， IL-15可能通过环孢菌素 A和类固醇敏感的途径，导致关节中的 IL-17 过度分泌。 IL-17除了可刺激滑膜细胞释放各种炎症介质外， 还可通过刺激 RANKL与 RANK结合， 刺激骨吸收， 是目前认识到的在类风湿性关节炎骨破坏 病理中最重要的细胞因子之一。 （M I oenders, L A B Joosten, W B van den BergPotential new targets in arthritis therapy : interleukin (IL) -17 and its relation to tumour necrosis factor and IL-1 in experimental arthritis. Ann Rheum Dis 2006 : 65 : 1129- 1133) 。
上述说明， 1β-羟基土木香内酯对 CIA有显注的疗效， 可明显抑制 CIA临床 发病， 抑制 IL-17的生成， 降低炎性细胞因子 TOF-ot及 IFN-γ的分泌， 因此， 可用 于制备治疗类风湿关节炎的药物。
本发明所述 1β-羟基土木香内酯在制备防治类风湿性关节炎的药物为由 1β- 羟基土木香内酯作为活性成分与常规药用载体制成的药物组合物。所述药物组合 物可以是片剂、 分散片、 含片、 口崩片、 缓释片、 胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、颗 粒剂、 注射剂、 粉针剂或气雾剂等。 有较大的临床应用价值。 附图说明
图 11 β -羟基土木香内酯临床评分图
图中 +模型组 +对照组 羟基土木香内酯 img/kg— ie-羟基 土木香内酯 5mg/kg+l β -羟基土木香内酯 10mg/kg
图 2脾细胞上清细胞因子 TNF-α检测结果图；柱 1:空白组 柱 2:模型组 柱 3： 甲氨喋呤组 柱 4: 1β-羟基土木香内酯 0.2mg/kg柱 5: 13-羟基土木香内酯 lmg/kg柱 6: 1 β -羟基土木香内酯 2 mg/kg *P<0.05 ** P<0.01
图 3 脾细胞上清细胞因子 IL-17检测结果图；柱 1:空白组 柱 2:模型组 柱 3： 甲氨喋呤组 柱 4: IP-羟基土木香内酯 0.2mg/kg柱 5: 1β-羟基土木香内酯 lmg/kg柱 6: 1 β -羟基土木香内酯 2 mg/kg *P<0.05 ** P<0.01
图 4脾细胞上清细胞因子 IFN-γ检测结果图；柱 1:空白组 柱 2:模型组 柱 3： 甲氨喋呤组 柱 4: 16-羟基土木香内酯 0.2mg/kg柱 5: 13-羟基土木香内酯 lmg/kg柱 6: IP-羟基土木香内酯 2 mg/kg *P<0.05 ** P<0.01 具体实施方式
实施例 1 1 β -羟基土木香内酯的制备
将干燥的旋覆花（Ljaponica)地上部分（包括茎、 叶、 花， 采自安徽亳州） 10.0kg粉粹， 室温 （温度 25°C)下用 95%的乙醇提取 3次 （每次 100L), 每次分 别用时为 24， 12， 12小时。 将所得粗提物 427.5 g加适量（10L)水稀释后， 依次 用石油醚（分四次， 每次 40L), 二氯甲烷 （分四次， 每次 40L), 乙酸乙酯（分 四次， 每次 40L)， 正丁醇萃取（分四次， 每次 40L)。 将其中取得的二氯甲垸萃 取物 50.5 g用 200-300目的薄层硅胶分离，用二氯甲垸 -甲醇 (100:0， 50: 1， 20: 1 , 10: 1， 5:1,2:1,)进行梯度洗脱。 薄层色谱检测 （2010版中国药典附录 VI B 薄层色谱 法）， 分别收集其中含有 IP-羟基土木香内酯的组分， 再采用 SephadexLH-20进 行分离， 用二氯甲垸 -甲醇 (1:1)进行洗脱， 得到混合物， 香草醛浓硫酸显色为倍 半萜类化合物， 该混合物采用制备 HPLC分离 （采用十八垸基键合硅胶为填充剂 的色谱柱， 以甲醇-水 50:50为展开剂，）得到 1 0 -羟基土木香内酯 95mg (得到的 化合物先采用质谱测定分子量 248， 分子式 C15H2Q03， 再进行核磁共振分析得到 碳谱、氢谱以及二维谱数据， 进行结构解析， 与已知化合物 I P -羟基土木香内酯 的数据一致)。
实施例 2 I P -羟基土木香内酯动物药效试验
一、 实验材料
药物与试剂
1 β -羟基土木香内酯： 实施例 1制得， 以 3%。的 CMC-Na (羧甲基纤维素钠） 溶液溶解成 lmg/ml的溶液。 给药时按照动物体重腹腔注射不同的体积。
鸡 II型胶原 (C II ): Chondrex, Redmond, WA 98052, USA;
不完全弗氏完全佐剂（IFA) Difco Laboratories, Detroit, MI;
磷酸缓冲盐溶液（PBS) ： 由本实验室自行配制： 在 800ml蒸馏水中溶解 8 gNaCl, 0.2g KCl， 1.44 g Na2HP04和 0.24 g KH2PO4。 用盐酸调 PH至 7.4， 加水 定容至 1 L， 过滤除菌后使用；
DMSO二甲基亚砜 (Dimethyl sulfoxide, DMSO): 为 sigma公司产品；
1640培养基： 吉诺生物医药技术有限公司；
小牛血清： 民海生物有限公司；
96孔平底板， CORNING公司； 70μτη细胞研磨滤网， BD Falcon公司； 15ml、 50ml离心管， BD Falcon公司； 0.22μιη滤器， Millipore 公司； 1ml旋口注射 器， BD 公司； 贝朗三通， 德国贝朗公司；
甲氨喋呤片： 上海医药 （集团）有限公司信谊制药总厂（080605 )
动物
DBI/I型小鼠， 雄性， 6-8周， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供， 许 可证号： SCXK (沪） 2007-0005， 饲养于第二军医大学实验动物中心清洁级环境 中。 仪器与设备
高速台式离心机， Eppendorf; 高速台式低温离心机， HITACHI公司； 倒置 显微镜， Nikon公司； 超净台， 苏净集团安泰公司制造； 电热恒温鼓风干燥箱， 上海精宏实验设备有限公司； 湿度 C02培养箱， Heraus公司； 恒温水浴锅， 上 海国华电器有限公司。
二、 实验方法
模型的建立
实验准备
完全弗氏佐剂（CFA)的制备： 在不完全弗氏佐剂中加入热灭活的结核分支 杆菌至终浓度 4 mg/ml， 使用之前充分混匀。
0.01、冰乙酸制备： 11.43μ1冰乙酸溶于 20ml去离子水中，过滤， 4'C备用。
C II制备： 将 C II溶解于 0.01M冰乙酸至终浓度 4 mg/ml， 4 °C保存。
抗原的乳化： 用三通管连接两支玻璃针管， 将 PBS、 完全弗氏佐剂和抗原 C
II分别加入一支针管中 （每 ΙΟΟμΙ乳化液含 20(^g CII和 50μ1完全弗氏佐剂） ， 排除针管内气泡后，来回推动针管约 500 次，将针管内各成分充分混勾成乳化状 态。
CIA模型的诱导
第 0天，小鼠尾根部 2-3 厘米处给予 ΙΟΟμΙ /只乳化好的 C II抗原皮下注射免 疫； 第 21 天， 加强免疫： 50μ1。ΙΙ 和 150μ1 ΡΒ8充分混匀， 150ul/只腹腔注射； 正常组用生理盐水同法注射。
三、 实验分组和给药方案
小鼠随机分为 6组， 每组 12只， 分别为正常组、 CIA模型组、阳性对照组（甲 氨喋呤 2mg kg) ； 1 β -羟基土木香内酯组分为高、 中、低三个剂量组， 其给药量 分别为 10mg/kg、 5mg/kg、 1 mg/kg。 于二次免疫前一天（第 20天）至第 34天 I P - 羟基土木香内酯组分别按 10mg/kg、 5mg/kg、 1 mg/kg连续灌胃给药， 甲氨喋吟组 每两天按 2mg/kg给药， 正常组和模型组按 10ml/kg给予饮用水。
1、 多发性关节炎指数 (arthritis index, AI)评分
二次免疫后， 定期记录小鼠全身关节病变情况， 按 3级评分法评价， 计算发 病率及平均发病指数。 具体评分标准为： 0分 -关节正常； 1分-关节轻微红肿； 2 分-关节红肿严重， 累及整个关节， 活动受限； 3分-爪子或关节功能障碍， 关节 僵硬。 四肢的总和为小鼠的评分， 最高为 12分。
2、 淋巴及脾脏单个核细胞（MNC) 悬液的制备 小鼠处死， 固定， 剪开腹部皮肤， 取两侧腹股沟淋巴结； 后打开腹腔， 取出 脾脏， 立即放入装有 1640 的 15ml离心管中， 置于冰上； 将脾脏倒入 70μιη的细 胞研磨滤网中， 用 lml注射器针芯充分研磨， 使之成细胞悬液； 收集细胞悬液， 4°C， lOOOrpm,离心 8min,离心后弃去上清；打散细胞，加入 0.83%氯化铵水（约 1.0ml/脾脏） ， 裂解 5min; 加入 3 倍体积的 PBS终止裂解反应， 并用玻璃吸管去 除细胞悬液中的絮状物； 4°C , lOOOrpm, 离心 8min， 离心后弃去上清； 打散细 胞， 加入 lml 1640 (含小牛血清） ， 混勾后计数， 以 1640完全培养基（含小牛血 清）在 96孔板中培养， 5xl06/ml每孔 100ul， 贴壁 2小时。
3、 脾细胞 NO测定
在 96孔平圆底板中每孔加入 5x106/ml脾脏 MNClOOul, 每组 4复孔； 贴壁 2 小时后， 换液 DMEM培养基 （市售， 补充生产商， 购自上海丽臣生物科技有限 公司）， 每孔加 LPS (脂多糖） （终浓度 lug/ml)， 将细胞置于 37°C， 5%C02培 养箱中培养 18小时后取出上清液检测 NO。
4、 脾、 淋巴细胞增值测定
在 96孔平圆底板中分别加入 5xl06/ml脾脏及淋巴 MNClOOul, 每组 4复孔； 贴壁 2小时后， 加 C II ( 100ug/ml) ， 将细胞置于 37°C， 5 %C02培养箱中培养 72 小时后取出加 MTS (四甲基偶氮唑盐）测增值。 在 96孔平圆底板中加入 5xl06/ml脾脏 MNClOOul,每组 4复孔；贴壁 2小时后， 加 C II ( lOOug/ml)， 将细胞置于 37°C， 5%C02培养箱中培养 48小时后取上清液 检测细胞因子。
四、 结果
1、 1 β -经基土木香内酯可抑制 CIA的临床发病
在此 CIA (类风湿性关节炎） 的实验中， 用 C II 诱导 CIA模型， 初次免疫 为第 0天， 第 21 天加强免疫后小鼠随机分为 6组： 对照组和三组 I P -羟基土木 香内酯组。 于第 20天开始给， 阳性对照组每两天给予甲氨喋呤药 2mg/kg， 1 β - 羟基土木香内酯高剂量组给予 10 mg/kg , 中剂量组为 5 mg/kg， 低剂量组为 lmg/kg,连续给药 14天，直到实验结束。每天观察小鼠并依据评分标准给每只小 鼠评分。 CII诱导 CIA, 加强免疫后小鼠陆续出现发病， 对照组与用药组在发病时间 上没有明显差异。发病后， 模型组组小鼠疾病严重程度加重较快， 在免疫后第 37 天达到高峰， 而给药组小鼠发病后疾病发展较对照组小鼠缓和 （图 1) 。 从发病 率来看， 模型组为 90%， 对照组为 73%， 1β-羟基土木香内酯高、 中、 低三个剂 量组分别为 68%， 70%和 71%。 由此可见， 1β-羟基土木香内酯对 CIA发病时间 没有明显影响，但明显抑制了 CIA 的发病严重程度和发病率，说明 1β-羟基土木 香内酯对 CIA具有明显的保护作用。
2、 1β-轻基土木香内酯能下调脾细胞上清液中 TNF-ct、 IL-17、 IFN-γ
在体内给予药物治疗 CIA的实验中， 疾病达到平台期后处死小鼠， 取出脾脏 细胞， 制成单细胞悬液， 每孔 1.5χ106个细胞铺板， 在体外用 20μ8/ιη1的抗原 CII 刺激，培养 48小时后收集上清，用 ELISA方法酶联免疫吸附试验法测量细胞因子
TNF-0 IFN-γ的浓度。
如图 2、 3、 4所示， C II刺激后， 模型组细胞上清中 TNF-a、 IFN-γ及 IL-17 均高于各个药物处理组， 与阳性对照组及 13-羟基土木香内酯组相比， 存在统计 学差异 （p<0.05) 。 说明体内给予药物治疗后， 能够抑制促炎细胞因子 TNF-o
IFN-γ和 IL-17的分泌， 并能从而对 CIA疾病具有保护作用。
实施例 3
片剂： IP-羟基土木香内酯 25g
乳糖 210g
玉米淀粉 60g
硬脂酸镁 5g
制备方法： 将 1β-羟基土木香内酯、 乳糖和淀粉混合， 用水均匀湿润， 把 湿润后的混合物过筛并干燥， 再过筛， 加入硬脂酸镁， 然后将混合物压片， 每片 重 300mg， 1 β -羟基土木香内酯含量为 25mg。
实施例 4:
注射液： 1β-羟基土木香内酯 5g
葡萄糖 50g
制备方法:将 1 e -羟基土木香内酯和葡萄糖溶解于适量的注射用水 中， 过滤所得溶液， 在无菌条件下装入输液瓶中， 每瓶含 ie-羟基土木香内酯 实施例 5:
注射用冻干粉针剂： I P -羟基土木香内酯 10g
甘露醇 30g
制备方法：将 I P -羟基土木香内酯和甘露醇溶解于适量的注射用水中，过滤 所得溶液，在无菌条件下装入西林瓶中，冻干,每支含 1 Ρ -羟基土木香内酯 10mg。 实施例 6 1 β -羟基土木香内酯对滑膜细胞的影响试验
一、 实验材料
i e -羟基土木香内酯： 实施例 1制得。
胎牛血清、 DMEM培养基（一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基） 、 胰酶： 购 自 Gibco公司。
肿瘤坏死因子 （TNF- α ) ： 购自 Peprotech公司。 二、 实验方法
类风湿关节炎病人滑膜细胞的培养
从进行关节置换或滑膜切除手术的类风湿关节炎病人的滑膜组织分离出滑 膜细胞，取第 5代以后的纯种细胞进行实验。细胞培养条件如下： 含 10%肽牛血 清的培养基 37°C， 5% C02进行培养。 所有实验给药后均进行无血清培养。
MTT (甲基噻唑基四唑） 实验
取滑膜细胞以每孔 2X 104/孔的细胞铺于 96孔板中 （购自 Corning公司）。 换液后继续培养 24h后加入终浓度 2.5-40 μ M的 1 β -羟基土木香内酯无血清培养 12小时后加入终浓度为 10 ng/ml肿瘤坏死因子 （ )， 继续培养 24h后加 入 20μ L浓度为 5mg/ml的甲基噻唑基四唑（MTT) 37'C培养 2h。加入适量磷酸 盐缓冲液（PBS)洗涤 2次后加入 100 μ L二甲基亚砜（DMSO) 37°C摇匀 5min， 570nm处读取吸光度值。 酶联免疫吸附实验（ELISA)
取滑膜细胞铺板加入终浓度分别为 2.5、 5、 ΙΟ μ Μ的 1 6 -羟基土木香内酯 无血清培养基培养 12h后加入终浓度为 10ng/ml肿瘤坏死因子 （ TNF- α )作用 24h, 取细胞上清液离心后 -80 'C冻存。 采用商品化的 ELISA试剂盒 （购自 Invitrogen公司）测定细胞上清中白介素 6 (IL-6)，白介素 8 ( IL-8)，单核细胞 趋化蛋白 1 (MCP1 ) 和基质金属蛋白酶 3 (MMP3 ) 的表达。
R A的提取与定量 RT-PCR测定
依据 RNA提取试剂盒（RNAeasy mini RNA isolation kits购自 Qiagen公司） 说明书要求提取滑膜细胞的总 RNA。采用多功能酶标仪测定 R A的浓度并进行 纯度检査。 采用逆转录试剂盒（PrimeScript RT reagent Kit购自 Takara公司）逆 转录获得 cDNA。 最后采用实时定量扩增试剂盒 （SYBR Premix Ex Taq™购自 Takara公司）进行定量检测， 所用的引物由 Invitrogen公司合成， 见表 1。 扩增 方法如下： 将 cDNA和 SYBR Premix Ex Taq试剂混合后加入相应的基因引物置 于 96孔 R A板中， 在实时定量扩增仪（购自 Applied Biosystem公司） 中进行 如下循环： 95°C， 30秒； 95°C， 5秒和 55°C， 30秒循环 30次； 解离测定溶解度 曲线。 以甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 （GAPDH) 看家基因为基准， 计算 ACt值 （△
Figure imgf000012_0001
计算结果与未刺激的细胞的 mR A水平进行比较， 计算出 mRNA表达量的相对增加倍数。 统计分析方法
体内外实验结果均采用 SPSS软件运用单因素方差分析进行统计检验， 两者 比较采用 Dunnett's进行分析，检验水平为 PO.05,所有数据表示为均值士 SEM。 三、 实验结果
1 β -羟基土木香内酯抑制 TNF- α诱导的滑膜细胞中炎症因子的表达
TNF- α可以诱导滑膜细胞中炎症因子的表达， 而过量表达的炎症因子又可 促进滑膜组织增生， 增加炎症细胞的向关节组织迁移。 因此考察了药物对 TNF- a α诱导滑膜细胞中炎症因子表达的影响。 研究发现加入 TNF- α刺激 24h后， 滑 膜细胞中的 IL-6,单核细胞趋化蛋白 1 (MCPl ), IL-8,生长调节癌基因 1 (GRO- α )， 造血负调控因子 （ΜΙΡ-Ι α ) , 调节活化正常 Τ细胞表达和分化因子 (RANTES), 基质金属蛋白酶 3 (ΜΜΡ3 )和 MMP13 mRNA表达量与未刺激组 比分别提高了 3.96， 2.81 , 7.17, 2.37, 4.38， 12.38, 1.97和 1.10倍。 但是保护 因子转化生长因子 β (TGF- β ) mRNA表达却受到抑制， 虽然这种抑制无显著 性意义。 而预先给予 1 β -羟基土木香内酯， 则会剂量依赖性的抑制 TNF- a诱导 的炎症因子的表达， 1 β -羟基土木香内酯 (2.5 - ΙΟ μ Μ )对 IL-6， MCPl , IL-8, GRO- a， MIP-1 a， RANTES , MMP3和 MMP13抑制率范围分别为 25-88%， 42-90%, 41-80%, 28-82%, 40-78%, 71-94%, 60-90%和 27-76%。
为了进一步证实药物的治疗作用， 还采用 ELISA法测定了细胞上清中炎症 因子的表达， 结果表明 I P -羟基土木香内酯 (2.5 - 10 μ Μ )可以剂量依赖性的抑 制 IL-6， IL-8 , MCP1和 ΜΜΡ3的表达， 抑制率范围分别为 55-95%， 31-54%， 71-94%, 22 -99% and 44-95%。 MTT结果表明 1 e -羟基土木香内酯在 2.5 - 10 μ M 剂量范围内对 TNF-α诱导的滑膜细胞增生无明显影响， 但当给药剂量达到 20 μ Μ则能明显抑制细胞增殖， 而在 40 μ Μ则发生明显的细胞毒作用。 表 1 mRNA测定所用的炎症因子的引物序列
基因 种属 正义引物 反义引物
IL-6 人 5' -ACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAGAGA-3' 5' -TGGTCTTGGTCCTTAGCCACTCCT-3'
MCP1 人 5' - CTTCTGGGCCTGCTGTTCACAGTT-3' 5' -TTCTTGGGGTCAGCACAGACCTCT-3'
IL-8 人 5' -ACTGAGAGTGATTGAGAGTGGAC-3' 5' -AACCCTCTGCACCCAGTTTTC-3'
人 5' -TGCAGGGAATTCACCCCAAG-3' 5' -CAGGGCCTCCTTCAGGAACA-3'
MIP-1 α 人 5' -TTCAGAAGGACACGGGCAGCAGAC-3' 5' -ACTGGTTGCAGAGAGCCATGGT-3'
RANTES 人 5 ' - TCACCATATGGCTCGGACACCACT- 3 ' 5 ' -ACACACTTGGCGGTTCCTTCGA-3，
MMP3 人 5' -AGGTGTTGACTCAAGGGTGGATGCT-3' 5' - CACAGGATGCCTTCCTTGGATCTCT- 3'
MMP13 人 5' -TCCCAACCATGTGGATGCTGCA-3' 5' -TCAAAGTGAACCGCAGCGCTCA-3'
TGF- β 人 5' -GCCTGGACACGCAGTACAGCAA-3' 5' -TGCGGCCCACGTAGTACACGAT-3'
GAPDH 人 5 ' -TTCGACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3， 5 ' -CAGGCGCCCAATACGACCAAATC-3，

Claims

权利要求
1、 i e -羟基土木香内酯在制备预防治疗类风湿性关节炎药物中的应用， 其 特征在于， 所述 1β-羟基土木香内酯的结构式如下：
Figure imgf000014_0001
2、 根据权利要求 1所述的应用， 其特征在于， 所述 I P -羟基土木香内酯通 过下列方法制备得到：
将干燥的旋覆花的地上部分， 包括茎、 叶、 花粉粹， 室温下用 95%的乙醇， 分别以 24， 12, 12小时提取 3次，将所得粗提物加适量水稀释后，依次用石油醚， 二氯甲垸， 乙酸乙酯， 正丁醇萃取， 将二氯甲垸萃取物用 200-300目的薄层硅胶 分离， 用二氯甲垸 -甲醇 进行梯度洗脱， 薄层色谱检测， 分别收集其中含有 i e -羟基土木香内酯的组分， 再采用 Sephadex LH-20进行分离， 用二氯甲烷-甲醇进 行洗脱， 得到混合物， 香草醛浓硫酸显色为倍半萜类化合物， 最后采用 HPLC分 离得到 1 6 -羟基土木香内酯。
3、根据权利要求 1所述的应用， 其特征在于所述药物为由 1 β -羟基土木香内 酯作为活性成分与药用载体制成的药物组合物。
4、根据权利要求 3所述的应用，其特征在于所述药物组合物为片剂、分散片、 含片、 口崩片、 缓释片、胶囊剂、 软胶囊剂、 滴丸、 颗粒剂、 注射剂、 粉针剂或 气雾剂。
5、根据权利要求 3所述的应用， 其特征在于所述药物组合物的单剂量含 i e - 羟基土木香内酯为 5mg-25 mg。
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JIANG-JIANG QIN ET AL.: "New sesquiterpenes from Inula japonica Thunb. With their inhibitory activities against LPS-induced NO production in RAW264.7 macrophages", TETRAHEDRON, vol. 66, 2010, pages 9379 - 9388, XP027452235 *

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