CN105311015A - 1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域。本发明提供了1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用。本发明还提供了1β-羟基土木香内酯对由TNF-α(肿瘤坏死因子α)刺激引起的NF-κB信号通路异常活化具有很好的抑制作用，进一步研究发现1β-羟基土木香内酯还具有较好的抗肿瘤作用。1β-羟基土木香内酯的化学结构式如式(Ⅰ)所示：

Description

1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用。

背景技术

蛋白的泛素化同蛋白的磷酸化一样也是蛋白的转录后修饰过程，涉及细胞的增殖、分化和凋亡等多个过程。泛素化过程是一种酶促级联反应，首先由泛素激活酶E1(Ub-activatingenzyme)激活泛素(Ub)并将其转移到泛素结合酶E2(Ub-conjugatingenzyme)的半胱氨酸残基上。接着形成的E2-Ub会在泛素链接酶E3(Ubligase)的作用下，将Ub转移到被修饰靶蛋白的赖氨酸残基上。一旦Ub与目的蛋白结合后，其他的Ub也会在以上酶促级联反应的作用下链接到第一个Ub的七个赖氨酸(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63)残基上，形成不同链接形式的多聚泛素链。此外，Ub还可通过其N端和C端首尾相连形成直链泛素链。多聚泛素链依据其结合形式的不同在细胞内发挥不同的生物学功能，例如K48泛素链主要是诱导目的蛋白发生蛋白酶体水解，而K63泛素链主要参与细胞内的信号传导过程。

旋覆花属(InulaL.)植物是菊科(Compositae)中的一属，全世界约有100种，分别于亚洲、欧洲和非洲，以地中海地区为主。中国有20余种，本属多种植物常供药用，如土木香(I.helenium)可作为健胃、利尿、祛痰和驱虫药；大花旋覆花(I.britannica)具有消痰、下气、软坚、行水等功效。倍半萜类化合物是本属植物的特征性成分，以桉烷型、吉马烷型和愈创木烷型为主，还包括伪愈创木烷型、裂环桉烷型、榄烷型、苍耳烷型和少量的无环倍半萜及倍半萜二聚体。研究表明，该属植物中的倍半萜类化合物具有驱虫杀虫、抗菌抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。

旋覆花(Inulajaponica)又名金佛花，金佛草(江浙)，六月菊(河北)。多年生草本。根状茎短，横走或斜生，有粗壮的须根。分布在中国北部、东北部、中部、东部、四川、广东等地，可供药用。旋覆花的根及叶可治疗刀伤疔毒；煎服可平喘镇咳；其花是健胃祛痰药，也治疗胸中痞闷、胃部膨胀、嗳气、咳嗽、呕逆等(《江苏省药材志》)。旋覆花在古方为祛痰、除湿、利肠，又为治水肿的主要药。

本发明人一直致力于旋覆花化学成份的系统研究，已于2011年11月29日申请中国发明专利，专利申请号为CN201110388307.X，公开号为CN102499916A，发明名称为“1β-羟基土木香内酯在制备防治类风湿关节炎的药物中的应用”，1β-羟基土木香内酯的化学结构式如下：

本发明人对1β-羟基土木香内酯的药用价值进行更深入的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供1β-羟基土木香内酯的新的医药用途。

本发明人对采自中国安徽亳州的旋覆花进行了系统的化学成分研究，以期明确其化学成分，发现旋覆花的提取物1β-羟基土木香内酯对泛素化酶具有很好的抑制作用，尤其对由TNF-α(肿瘤坏死因子α)刺激引起的NF-κB信号通路异常活化具有很好的抑制作用，进一步研究发现1β-羟基土木香内酯具有较好的抗肿瘤作用。

本发明提供了1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用。

1β-羟基土木香内酯的化学结构式如式(Ⅰ)所示：

所述的1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，具体是指在制备治疗由肿瘤坏死因子-α刺激引起的细胞核转录因子-κB信号通路异常活化相关疾病药物中的应用。

进一步地，本发明还提供了1β-羟基土木香内酯在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用。

所述的肿瘤为肝癌等。

本发明的应用，还可以以1β-羟基土木香内酯作为活性成分与常规药用辅料制成药物制剂。

所述的药物制剂可以是片剂、、颗粒剂、分散片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂，或气雾剂等。

本发明所述的1β-羟基土木香内酯是通过下列方法制备得到的：

将干燥的旋覆花(I.japonica)的地上部分(包括茎，叶和花，采自安徽亳州)粉粹，室温下用95％的乙醇，分别以24，12，12小时提取3次。将所得粗提物加适量水稀释后，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取。将二氯甲烷萃取物用200-300目的薄层硅胶分离，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。薄层色谱检测，分别收集其中含有1β-羟基土木香内酯的组分，再采用SephadexLH-20进行分离，用二氯甲烷-甲醇进行洗脱，得到混合物，香草醛浓硫酸显色为倍半萜类化合物，最后采用HPLC分离得到1β-羟基土木香内酯。

本发明设计了体外包含酶的泛素化反应系统考察对1β-羟基土木香内酯对泛素化和泛素酶活的影响。结果显示1β-羟基土木香内酯抑制泛素化过程的机制是抑制E2-Ub硫酯复合物的形成，提示1β-羟基土木香内酯是一种新型的E2酶抑制剂，具有重要的研究价值。

本发明进一步采用Pulldown和Biacore法证实了1β-羟基土木香内酯是通过和UbcH5c发生结合来抑制其活性的，并采用生物质谱实验确证了1β-羟基土木香内酯是通过α亚甲基γ内酯环的不饱和基团与UbcH5c的Cys85发生共价结合而抑制其活性。

本研究首次发现了1β-羟基土木香内酯是泛素化酶UbcH5c的小分子抑制剂，并且阐明了其作用位点和作用机制，由此我们可以得出1β-羟基土木香内酯对由TNF-α(肿瘤坏死因子-α)刺激引起的细胞核转录因子-κB(NF-κB)信号通路异常活化相关的疾病如肿瘤有治疗效果。本发明的1β-羟基土木香内酯具有较好的临床应用前景。

附图说明

图1为1β-羟基土木香内酯对RIP泛素化的影响；

图2为1β-羟基土木香内酯对NEMO泛素化的影响；

图3为1β-羟基土木香内酯对Ubc5介导的泛素链形成的影响；

图4为1β-羟基土木香内酯对LUBAC和UbcH5c介导的直链泛素链形成的影响；

图5为1β-羟基土木香内酯对E2-25K(图5A)和UbcH7(图5B)介导的直链泛素链形成的影响；

图6为1β-羟基土木香内酯对E2-Ub复合物形成的影响；

图7为Pulldown法寻找1β-羟基土木香内酯结合蛋白；

图8为1β-羟基土木香内酯与UbcH5c结合的信号响应图；

图9为1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的计算机拟合图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。

本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：1β-羟基土木香内酯的制备

将干燥的旋覆花(I.japonica)地上部分(包括茎、叶、花，采自安徽亳州)10.0kg粉粹，室温(温度25℃)下用95％的乙醇提取3次(每次100L)，每次分别用时为24，12，12小时。将所得粗提物427.5g加适量(10L)水稀释后，依次用石油醚(分四次，每次40L)，二氯甲烷(分四次，每次40L)，乙酸乙酯(分四次，每次40L)，正丁醇萃取(分四次，每次40L)。将其中取得的二氯甲烷萃取物50.5g用200-300目的薄层硅胶分离，用二氯甲烷-甲醇(100:0,50:1,20:1,10:1,5:1,2:1,)进行梯度洗脱。薄层色谱检测(2010版中国药典附录ⅥB薄层色谱法)，分别收集其中含有1β-羟基土木香内酯的组分，再采用SephadexLH-20进行分离，用二氯甲烷-甲醇(1:1)进行洗脱，得到混合物，香草醛浓硫酸显色为倍半萜类化合物，该混合物采用制备HPLC分离(采用十八烷基键合硅胶为填充剂的色谱柱，以甲醇-水50:50为展开剂，)得到1β-羟基土木香内酯95mg(得到的化合物先采用质谱测定分子量248，分子式C₁₅H₂₀O₃，再进行核磁共振分析得到碳谱、氢谱以及二维谱数据，进行结构解析，与已知化合物1β-羟基土木香内酯的数据一致)。

实施例2：1β-羟基土木香内酯(IJ-5)对泛素化的影响

除了上游的激酶可以激活IKKβ的磷酸化，近年来，越来越多的实验证实NF-κB通路的激活和泛素化密切相关。IKK除了可被TAK1、MEKK3激活外，上游蛋白的泛素化对其活化起了非常大的作用。进一步研究证明RIP1和NEMO的泛素化与NF-κB通路的激活有非常密切的关系，因为这些重要信号分子的泛素化一方面介导了IKKβ与激活IKKβ的上游激酶和下游底物(IκB)复合物的聚集，另一方面还诱导IKK复合物本身发生多聚化，进而发生反式自磷酸化激活。

由于RIP1发生泛素化可以募集下游的IKK复合物并诱导其激活，因此我们首先检测了1β-羟基土木香内酯对转染HA-Ub(增加检测信号强度)293T细胞内RIP1泛素化的影响。结果显示1β-羟基土木香内酯在2.5-10μM的剂量范围内可以抑制TNF-α诱导的RIP1的泛素化(图1)。

同样的，当293T细胞转染HA-ub质粒，考察1β-羟基土木香内酯对NEMO泛素化的影响，IP结果表明1β-羟基土木香内酯在2.5-10μM的剂量范围内可以抑制TNF-α诱导的NEMO的泛素化。(图2)。提示1β-羟基土木香内酯是通过抑制信号通路因子的泛素化来抑制IKK复合物的自磷酸化激活，推测1β-羟基土木香内酯可能对NF-κB通路中泛素酶系统具有抑制作用。

实施例3：1β-羟基土木香内酯对体外泛素链形成的影响

在TNF-α介导的NF-kB通路激活过程中涉及的重要的E2和E3酶分别为Ubc5和c-IAP1。我们首先在体外构建了包含E1、UbcH5c、c-IAP1和ub的泛素化反应体系，考察1β-羟基土木香内酯对于UbcH5c介导的泛素链形成的影响。如图所示(图3)，1β-羟基土木香内酯在2.5-10μM的剂量范围内可以剂量依赖性的抑制泛素链的形成，提示1β-羟基土木香内酯可能调控泛素化系统中一个或多个泛素酶来发挥抑制作用。

实施例4：1β-羟基土木香内酯对不同E2介导的泛素链形成的影响

泛素E3酶LUBAC可以和不同的泛素E2酶搭配催化直链泛素链的形成。为了探明1β-羟基土木香内酯抑制泛素链形成的作用机制。我们在体外构建了包含E1、E2(UbcH5c、E2-25K或UbcH7)、HIOP/RNF31和ub的泛素化反应体系。其中HIOP/RNF31是LUBAC的活性蛋白可以代替LUBAC复合物催化直链泛素链的形成。结果显示，1β-羟基土木香内酯在2.5-5μM的剂量下，对LUBAC和UbcH5c催化的直链泛素链的形成也具有显著的抑制作用(图4)。

进一步将以上系统中的E2酶换成E2-25K或UbcH7，结果未见1β-羟基土木香内酯对直链泛素形成的有抑制作用(图5)。综合上述结果，1β-羟基土木香内酯在以UbcH5为E2酶的体外泛素化系统中均表现对多聚泛素链合成的抑制活性，不论E3酶是cIAP或LUBAC；但如果E2酶被替换为E2-25K或UbcH7，E3和E1酶保持不变，则1β-羟基土木香内酯不再表现抑制作用，因此我们推测1β-羟基土木香内酯很可能是选择性的作用于E2酶UbcH5c，而不是通过作用于E1或E3酶来抑制泛素化的。

实施例5：1β-羟基土木香内酯对E2-Ub聚合物形成的影响

当反应系统中不含E3酶时，反应将停留在E2-ub二聚体形成的这一步上。因此，为确认1β-羟基土木香内酯对UbcH5c的选择性，本研究考察1β-羟基土木香内酯对不同泛素E2酶与Ub聚合物形成的影响。结果显示1β-羟基土木香内酯在2.5-10μM的剂量范围内可以抑制UbcH5家族中三种E2酶的活性，但对其他E2酶如UbcH7和E2-25K无明显抑制活性(图6)。以上结果提示1β-羟基土木香内酯很可能是UbcH5家族的选择性抑制剂。

实施例6：Pull-Down法验证1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合作用

前面的研究发现1β-羟基土木香内酯可以选择性的抑制UbcH5c的活性来抑制泛素化系统，从而抑制IKK复合物的聚合及自磷酸化激活。那么1β-羟基土木香内酯是否是通过直接与UbcH5c结合来抑制其活性的呢？本研究采用Pulldown的方法进一步考察1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的作用，结果显示，与空白磁珠相比，结合有1β-羟基土木香内酯的磁珠可以结合反应溶液中的UbcH5c，而且当溶液体系中含有游离的1β-羟基土木香内酯是，结合条带明显变浅，表明游离的1β-羟基土木香内酯可与偶连的1β-羟基土木香内酯竞争性地与UbcH5c结合，提示1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合作用具有选择性和可饱和性(图7)。通过以上一系列实验我们确定1β-羟基土木香内酯的作用靶点为UbcH5c。

实施例7：Biacore法检测1β-羟基土木香内酯与Ubc5的相互作用

体外泛素酶活实验结果说明1β-羟基土木香内酯是泛素E2酶UbcH5c的抑制，Pulldown实验进一步确认了1β-羟基土木香内酯的作用靶蛋白为UbcH5c。为了考察1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的相互作用，我们采用Biacore法检测了1β-羟基土木香内酯与UbcH5c相互作用的动力学过程。如图所示(图8)，1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合曲线信号明显，呈现良好的浓度依赖性，亲和力在μM级别。KD值与我们活性实验的给药浓度基本一致为4.9μM。同时1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合过程缓慢不同于常见的非共价结合的快上快下型方式，提示1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合作用可能为共价结合。

实施例8：LC-MS法寻找1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合位点

之前的文献研究发现倍半萜内酯类化合物的α亚甲基γ内酯环和蛋白中半胱氨酸(Cys)的硫醇可以发生Micheal加成，调节靶蛋白酶活和功能。Pull-Down和Biocore实验提示1β-羟基土木香内酯做为倍半萜内酯类化合物很可能也是通过共价键与UbcH5c结合。UbcH5c蛋白在85位和111位上含有2个游离的Cys，而其中85位的Cys也是UbcH5c与Ub发生结合的活性位点，根据前面的研究IJ-5可以抑制Ub与UbcH5c的连接，因此推测1β-羟基土木香内酯潜在的作用位点就是Cys85，通过与其发生共价结合从而竞争性的抑制UbcH5c-Ub复合物的形成。

为了证实以上假设，采用LC-OrbitrapCIDMS/MS比较了UbcH5c与1β-羟基土木香内酯共孵育和不与1β-羟基土木香内酯共孵育，蛋白酶解后多肽碎片分子量的精确变化。结果发现了一个m/z1145.62的母离子肽段，它是由UbcH5c的73-90这段序列经1β-羟基土木香内酯共价修饰而来。值得注意的是这段肽段恰好包含Cys85，并且其分子量变化表明这个段多肽发生了1β-羟基土木香内酯共价修饰对这个母离子肽段打二级质谱，进行序列分析后进一步确认1β-羟基土木香内酯的共价修饰位点为Cys85。

有意思的是未见包含游离Cys111的另一个肽段(m/z1353.73)发生共价修饰，提示1β-羟基土木香内酯是选择性的与UbcH5c的Cys85发生共价结合。

实施例9：计算机拟合1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的结合方式

基于前面质谱实验结果，以1β-羟基土木香内酯的α亚甲基上末端碳原子和UbcH5c蛋白85位半胱氨酸的硫原子为共价结合位点，采用maestro9.0做共价对接。选取前20个底自由能的结合方式进行人工分析找到最佳的三维对接方式。根据计算对接方式分析发现1β-羟基土木香内酯与UbcH5c的活性口袋具有很好的互补性，除了与Cys85形成共价键外，1β-羟基土木香内酯分子中的羟基和羰基还分别可以和UbcH5c中Cys85附近的Gln92和Asn114等残基发生氢键结合(图9)。

实施例10：1β-羟基土木香内酯的体内抗肿瘤活性

动物处理与分组：无菌条件下抽取肝癌小鼠腹水中的H₂₂细胞,以无菌PBS(磷酸盐缓冲液)调整为5×10⁶/ml。于BALB/c小鼠左侧下腹部行无菌皮下接种，接种量0.2ml细胞悬液。接种后对小时随机分为5组,每组10只。接种后第3天给药。第1组为阴性对照，给予生理盐水；第2组为阳性对照组，给予环磷酰胺(上海华联制药有限公司,20mg/kg/d)；第3组给予高浓度1β-羟基土木香内酯(50mg/kg/d)；第4组给予中浓度1β-羟基土木香内酯(20mg/kg/d)；第5组给予低浓度1β-羟基土木香内酯(10mg/kg/d)。连续给药观察15天。

抑瘤作用评价：每日观察荷瘤小鼠的生长情况。给药后第5天起隔日称重并测量瘤块体积,用电动游标卡尺测量瘤体的最长径和最短径。

肿瘤体积＝[(瘤体长径+瘤体短径)/2]²；

抑瘤率＝(对照组平均瘤重治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。

根据抑瘤率绘制肿瘤生长曲线。停药后次日处死小鼠，剥瘤称重。

实验结果表明在实验浓度下，1β-羟基土木香内酯均表现出明显的抑瘤效应，特别是对荷瘤小鼠给予高浓度1β-羟基土木香内酯50mg/kg/d时，抑瘤率与阳性药相当。观察给予不同高浓度药物治疗的荷瘤小鼠肿瘤的生长情况，可见给予生理盐水组肿瘤生长迅速，在给药后第7天，其肿块明显大于其他给药组，给予1β-羟基土木香内酯均能有效地抑制肿块的增长。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，其特征在于，1β-羟基土木香内酯的化学结构式如式(Ⅰ)所示：

2.根据权利要求1所述的1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述的应用是指在制备治疗由肿瘤坏死因子-α刺激引起的细胞核转录因子-κB信号通路异常活化相关疾病药物中的应用。

3.1β-羟基土木香内酯在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用。

4.根据权利要求3所述的1β-羟基土木香内酯在制备预防或治疗肿瘤的药物或保健品中的应用，其特征在于，所述的肿瘤为肝癌。

5.根据权利要求1所述的1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述的应用是以1β-羟基土木香内酯作为活性成分与常规药用辅料制成药物制剂。

6.根据权利要求5所述的1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述的药物制剂是片剂、、颗粒剂、分散片、胶囊剂、软胶囊剂、滴丸、注射剂、粉针剂，或气雾剂。

7.根据权利要求1所述的1β-羟基土木香内酯在制备泛素化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述的1β-羟基土木香内酯是通过下列方法制备得到的：

将干燥的旋覆花(I.japonica)的地上部分粉粹，室温下用95％的乙醇，分别以24、12、12小时提取3次；将所得粗提物加适量水稀释后，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取；将二氯甲烷萃取物用200-300目的薄层硅胶分离，用二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱。薄层色谱检测，分别收集其中含有1β-羟基土木香内酯的组分，再采用SephadexLH-20进行分离，用二氯甲烷-甲醇进行洗脱，得到混合物，香草醛浓硫酸显色为倍半萜类化合物，最后采用HPLC分离得到1β-羟基土木香内酯。