CN114656575B - 一种合欢花非均一多糖，其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合欢花非均一多糖、其制备方法及用途。本发明采用水提醇沉的方法及阴离子交换琼脂糖凝胶柱(DEAE SepharoseTM Fast Flow)得到多糖AJDW，通过化学和物理方法鉴定了该多糖组分的组成，结构特征以及相关的理化性质。经体内外实验证明，AJDW可显著抑制胰腺癌细胞生长增殖，且几乎没有毒性，有望成为一种抗胰腺癌的候选糖类药物。

Description

一种合欢花非均一多糖，其制备方法及用途
技术领域
本发明属于多糖领域，具体而言，涉及一种从植物合欢花(Albizia julibrissinDurazz)中提取得到的非均一多糖,其制备方法，以及其在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物中的用途。
背景技术
胰腺癌是全球第七大癌症死亡原因，由于预后不良，2021年的死亡人数(46.6万人)与患病人数(49.6万人)几乎相同，5年生存率不足10％。现有的治疗方式包括药物治疗和手术治疗，但由于其高转移性和侵袭性，大多数患者被诊断为晚期癌症，因此只有不到20％的患者可以接受手术治疗。化疗是这些患者的主要选择，如吉西他滨、Abraxane、FOLFIRINOX和联合疗法，但它们的高耐药性和毒性限制了它们的使用。因此，寻找有效的抗癌药物和副作用小的治疗方法已成为当务之急。天然多糖具有低毒抗肿瘤活性，越来越受到人们的关注。它们可以通过DNA损伤、细胞周期阻滞、线粒体膜损伤等手段阻止肿瘤细胞转移和杀伤肿瘤细胞，并对肿瘤细胞表现出选择性的杀伤活性。
合欢花(Albizia julibrissin)是豆科植物合欢(Albizzia julibrissinDurazz.)的干燥花序或花蕾，是一种传统中药。据《中国药典》记载，合欢花性味甘、平，归心肝经，具有解郁安神的功效，用于心神不安，忧郁失眠；另据《分类草药性》中所述，合欢花可清心明目。合欢花中含黄酮类、萜类、挥发油和多糖类等化学成分。
发明内容
本发明用一种简单有效的提取和纯化植物多糖的工艺和方法，以浙江产地的合欢花为原料获得了粗多糖，并进一步进行了分离，获得了非均一多糖组分AJDW。药理实验表明，AJDW能够剂量依赖性地抑制胰腺癌细胞AsPC-1、PANC-1、SW1990的生长增殖，降低其细胞活力，但对胰腺正常细胞HPDE6-C7和肝脏细胞L02无明显抑制作用；同时体内实验证明该多糖可以明显抑制胰腺癌的生长；该多糖具有潜在的治疗胰腺癌的效果，有望开发成为一种预防和/或治疗胰腺癌的糖类药物。
为解决上述发明目的，一方面，本发明提供了一种合欢花非均一多糖AJDW，其单糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖组成，其中，基于构成多糖的单糖总量，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例范围分别为10-35％，10-50％，10-40％，1-15％和1-10％。
在具体实施方式中，所述合欢花非均一多糖AJDW中，基于构成多糖的单糖总量，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例分别为28.6％，35.2％，23.6％，8.7％，3.9％。
在具体实施方式中，所述合欢花非均一多糖AJDW的分子量范围为1-10kDa。
在一个实施方式中，所述合欢花非均一多糖AJDW的平均相对分子质量为3.7kDa。
在具体实施方式中，所述合欢花非均一多糖AJDW中，残基有以下连接方式：末端连接的阿拉伯糖，其比例为1-10％；末端连接的木糖，其比例为5-15％；1,4-连接的木糖，其比例为1-7％；末端连接的半乳糖，其比例为3-15％；1,4-连接的半乳糖，比例为8-35％；末端连接的葡萄糖，其比例为5-20％；1,6-连接的葡萄糖，其比例为1-10％；1,4,6-连接的葡萄糖，其比例为10-35％；1,4-连接甘露糖的甘露糖，其比例为15-40％；1,4,6-连接的甘露糖，其比例为1-6％，上述比例均基于构成多糖的单糖的总量计。
在一个实施方式中，所述合欢花非均一多糖AJDW中，残基有以下连接方式：末端连接的阿拉伯糖，其比例为4.5％；末端连接的木糖，其比例为8.0％；1,4-连接的木糖，其比例为1.1％；末端连接的半乳糖，其比例为6.1％；1,4-连接的半乳糖，其比例为18.2％；末端连接的葡萄糖，其比例为9.5％；1,6-连接的葡萄糖，其比例为2.4％；1,4,6-连接的葡萄糖，其比例为20.5％；1,4-连接甘露糖，其比例为25.3％；1,4,6-连接的甘露糖，其比例为1.7％，上述比例均基于构成多糖的单糖的总量计。
另一方面，本发明还提供了所述合欢花非均一多糖AJDW的制备方法，其包括如下步骤：
(1)多糖的提取：干燥的合欢花沸水提取，得到提取液，对提取液进行浓缩得到浓缩液；向浓缩液中加入乙醇醇沉，收集沉淀，得合欢粗多糖AJD；
(2)多糖的分离：粗多糖AJD经DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱分离，使用去离子水洗脱，收集去离子水洗脱液的洗脱组分，得到合欢花非均一多糖AJDW。
优选地，本发明方法步骤(1)中，沉淀所用乙醇为体积分数95％的乙醇水溶液；沉淀所用的乙醇水溶液体积为浓缩液的3～6倍(比如4倍)。
优选地，本发明方法步骤(1)中，在进行醇沉前，先对浓缩液进行离心去沉淀，然后对离心上清液进行透析，透析时间优选为24～72h。
优选地，本发明方法步骤(2)所述阴离子交换柱分离时使用去离子水洗脱，并收集该洗脱组分为AJDW。
优选地，本发明方法步骤(2)中，在用去离子水洗脱后，进一步包括将所述洗脱组分减压浓缩，透析和冻干的工序。
本发明对所得到的合欢花非均一多糖AJDW的鉴定，包括进行纯度及分子量的测定，然后采用糖组成的测定及核磁共振等方法对其结构特征进行分析。
再一方面，本发明还提供了一种药物组合物，其包含所述合欢花非均一多糖AJDW，以及任选的药学上可接受的辅料。
在优选实施方式中，所述药物组合物还包含用于治疗胰腺癌的其他药物例如，吉西他滨等。
还一方面，本发明还提供了所述合欢花非均一多糖AJDW或所述药物组合物在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物中的用途。
有益效果
本发明提供了从合欢花(豆科植物合欢花的干燥花序或花蕾)当中获得一种合欢花非均一多糖AJDW及其制备方法和其在制备预防和/或治疗抗胰腺癌药物中的用途。本发明采用水提醇沉的方法及阴离子交换琼脂糖凝胶柱(DEAE SepharoseTM Fast Flow)得到多糖AJDW，通过化学和物理方法鉴定了该多糖组分的组成，结构特征以及相关的理化性质。经体内外实验证明，AJDW可显著抑制胰腺癌细胞生长增殖，且几乎没有毒性，有望成为一种抗胰腺癌的候选糖类药物。
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本申请文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
图1为制备实施例1中制得的合欢花非均一多糖AJDW的单糖组成比例图谱，其中上图为9种标准品的糖组成对照图(9种标准品分别为：甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖)，下图为AJDW的糖组成比例图。
图2为显示测试实施例中使用MTT细胞增殖实验检测制备实施例1中制得的合欢花非均一多糖AJDW对胰腺癌细胞AsPC-1、PANC-1和SW1990(A)以及胰腺正常细胞HPDE6-C7和肝脏细胞L02(B)细胞活力影响的折线图。其中，A中折线旁边标注各细胞株的IC50值。
图3为显示测试实施例中使用制备实施例1中制得的合欢花非均一多糖AJDW对胰腺癌患者来源的皮下异种移植瘤肿瘤大小影响的折线图。其中，横坐标为接种肿瘤后的时间，纵坐标表示肿瘤体积，不同折线代表不同的给药方式，同时使用三角标注尾静脉注射的时间。P<0.05被认为有显著差异(*P<0.05,**P<0.01)。
图4为显示测试实施例中使用制备实施例1中制得的合欢花非均一多糖AJDW对胰腺癌患者来源的皮下异种移植瘤肿瘤重量影响的柱状图。其中，横坐标表示不同给药方式，纵坐标表示肿瘤重量。P<0.05被认为有显著差异(*P<0.05,**P<0.01)。
具体实施方式
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
制备实施例1：合欢花多糖组分AJDW的提取分离纯化和结构表征
(1)多糖的提取
用水提醇沉法提取合欢花多糖，用硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。合并提取液，浓缩至小体积后，离心去沉淀。将上清液用对流水透析两天。透析内液用体积分数95％的乙醇水溶液以提取液与乙醇水溶液的体积比为1：4(v/v)进行醇沉，静置过夜。弃掉上层多余乙醇，沉淀在60℃烘箱中除去多余乙醇后冻干，将干燥后得合欢花水提粗多糖AJD，(共77.7g，得率为3.8％)。
(2)多糖的纯化
每次取7.3g上述粗多糖溶解于80mL去离子水中，搅拌过夜，离心取上清上样于DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱，用去离子水进行洗脱，流速控制在13mL/15min，用自动收集仪收集。每管取100μL用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪(型号Novostar，采购于德国BGM公司)在490nm下检测其吸光度，用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集分离的多糖进行减压浓缩、对水透析、冷冻干燥，最后得到水洗脱液的洗脱组分AJDW(227mg，得率为3.1％)。
(3)多糖的结构鉴定
取合欢花多糖组分样品AJDW 2-4mg于洗净的鸡心瓶，加入2ml的去离子水和2ml的4M三氟乙酸(TFA)，加塞密封，于110℃完全酸水解4h后，冷却至室温，加甲醇(重复)旋蒸除去多余TFA至无酸味，复溶于200μL去离子水中，从中取50μL，加入新的2ml EP管，再加入50μL 0.6M的氢氧化钠和100μL 0.5M的PMP甲醇溶液(87.1mg/ml)，70℃水浴衍生化100min，加入100μL 0.3M的盐酸溶液中和，结束反应，再加入700μL的去离子水和1ml氯仿，涡旋振荡萃取，离心并室温静置90min后吸取上层水相溶液800μL于新的2ml的EP管，弃氯仿层；再次加入氯仿，萃取重复两次后，离心取上层水相，过0.22μm微孔滤膜后装入液相小瓶即得到单糖组成样品。
经HPLC测定单糖组成。设定流速为1ml/min，柱温为25℃，紫外检测波长值为254nm，样品进样量为10μl/个。结果显示，合欢花多糖主要含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。其中基于构成多糖的单糖总量，甘露糖含量为10-40％，葡萄糖含量为10-50％，半乳糖含量为10-35％，木糖含量为1-15％，阿拉伯糖含量较少，为1-10％。
经高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定合欢花多糖组分样品AJDW的平均相对分子质量为3.7kDa。
取合欢花多糖组分AJDW进行甲基化分析，提前称取4-8mg样品于干燥柜中过夜(反应保证无水)，次日完全溶解于2ml DMSO中，加入30mg研磨好的氢氧化钠粉末，搅拌反应1h，30min内于冰水浴条件下逐滴加入1ml碘甲烷，然后在避光条件下反应1h。用1ml去离子水加入反应体系淬灭反应。将此溶液减压浓缩，除去过量未反应完的CH3I，对水透析24-72h，将溶液冻干。反应后的样品进行完全酸水解，加入2M的TFA 4ml在110℃反应4h，冷却至室温后加入甲醇多次除去多余的酸至无酸味，反应后加入2ml水和50mg硼氢化钠进行还原，密封后室温下反应3h，用25％乙酸溶液中和硼氢化钠以终止反应，重复加入甲醇除去多余的酸，放入100℃烘箱中干燥15min，再加入3ml乙酸酐放入100℃烘箱中进行乙酰化，反应进行1.5h，重复加入甲苯，除去多余的乙酸酐，最后在反应瓶中加入15mL氯仿和15mL去离子水(v/v为1:1)，萃取，弃水相，有机相用去离子水洗涤3次，取无水硫酸钠干燥，将氯仿减压浓缩至1ml，经0.22μm有机相滤膜过滤，装入液相小瓶中。用GC-MS(Thermo Fisher ISQ7000型)检测和分析多糖的连接方式。
甲基化分析结果见下表1。结果显示，合欢花中残基有以下连接方式：末端连接的阿拉伯糖，其比例为1-10％；末端连接的木糖，比例为5-15％，1,4-连接的木糖，比例为1-7％；半乳糖有末端连接和1,4-连接两种形式，其比例分别为3-15％和8-35％；葡萄糖连接方式有末端连接的葡萄糖、1,6-连接葡萄糖和1,4,6-连接的葡萄糖三种形式，其比例分别为5-20％、1-10％及10-35％；甘露糖有1,4-连接甘露糖和1,4,6-连接的甘露糖两种残基连接方式，对应比例分别为15-40％和1-6％。
表1：合欢花多糖组分AJDW的甲基化分析结果
Figure GDA0003645150810000071
根据残基连接方式和比例，AJDW主要由T-Xyl,T-Glc,1,4-Gal,1,4-Man和1,4,6-Man组成。
测试实施例1：合欢花多糖组分AJDW的抗胰腺癌活性
(1)细胞增殖实验MTT检测多糖AJDW对细胞活力的影响
本实施例中使用的细胞分别为胰腺癌细胞AsPC-1、PANC-1和SW1990，胰腺正常细胞HPDE6-C7以及肝脏细胞L02，均购自中国科学院上海生化细胞所细胞库。
取对数生长期的细胞(4×103个/孔)种入96孔板中，设置3个复孔，于培养箱中培养24h待其贴壁生长，吸去细胞上清液，更换新鲜培养基，并加入多糖AJDW，使其终浓度分别为0.03125mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml及1mg/ml，继续培养72h后，每孔加入5mg/ml的MTT溶液10μl(购自美国sigma公司，PBS配制，经0.22μm微孔滤膜过滤)，继续培养4h后吸去孔内的细胞培养液，每孔加入150μl的DMSO(二甲基亚砜)溶解形成的紫色结晶物即甲瓚，用酶标仪在490nm下采集吸光度。细胞存活率按照以下公式进行计算：细胞存活率＝(实验组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)×100％。结果如图3所示，不同浓度的多糖化合物AJDW分别处理细胞72h后，胰腺癌细胞AsPC-1、PANC-1和SW1990的存活率显著降低，其IC50分别为：0.769mg/ml、0.461mg/ml和0.802mg/ml。然而同样的处理条件下，胰腺正常细胞HPDE6-C7以及肝脏细胞L02的细胞活力未发生明显变化，这说明AJDW对胰腺癌的体外生长增殖具有明显的抑制作用，但几乎没有毒性。
(2)使用胰腺癌患者来源的皮下异种移植瘤模型(PDX)检测AJDW对小鼠肿瘤体积及重量的影响
此次动物实验遵行实验动物管理和使用指南，获得中国科学院上海药物研究所动物伦理委员会批准，IACUC审批号2021-03-DK-97。PDX模型根据上海市长征医院人体研究伦理委员会建立。从上海灵畅生物科技有限公司分批次购入6-8周龄雌性Nude小鼠5只和30只，饲养于SPF级动物实验室，每牢饲养5-6只小鼠，鼠牢可以自由获取无菌饮水和食物。在温度(25℃±2℃)恒定，光照循环(12小时光照，12小时黑暗)环境中饲养，适应环境饲养一周后开始实验。
胰腺癌患者的肿瘤组织在医院的手术室被切除，迅速放置在冰上，转移到实验室，然后进行皮下异种移植手术，将肿瘤组织接种到5只Nude小鼠皮下。肿瘤形成后，取出肿瘤组织并切成形状大小相似的肿瘤块，再次接种到30只Nude小鼠皮下。待肿瘤形成后，将30只小鼠随机分为5组，每组6只，实验组尾静脉注射含不同浓度AJDW(0.5、5、50mg/kg)的PBS溶液，阳性对照组给予注射吉西他滨(GEM)(40mg/kg)，空白对照组给予尾静脉注射溶剂PBS。定期监测肿瘤大小。大约为期一个月的治疗后，将小鼠处死，并对肿瘤进行称重。结果如图3和图4所示，经过多糖AJDW为期一个月左右的治疗，肿瘤体积显著低于PBS对照组(p<0.05)，肿瘤重量也有明显的差异(p<0.05)，显著低于PBS对照组。在一定程度上与阳性对照吉西他滨的治疗效果相当。

Claims (9)

1.一种合欢花非均一多糖AJDW，其单糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖组成，
其中，基于构成多糖的单糖总量，甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例分别为28.6％，35.2％，23.6％，8.7％，3.9％，
所述合欢花非均一多糖AJDW的平均相对分子质量为3.7kDa，
其中，残基有以下连接方式：末端连接的阿拉伯糖，其比例为4.5％；末端连接的木糖，其比例为8.0％；1,4-连接的木糖，其比例为1.1％；末端连接的半乳糖，其比例为6.1％；1,4-连接的半乳糖，其比例为18.2％；末端连接的葡萄糖，其比例为9.5％；1,6-连接的葡萄糖，其比例为2.4％；1,4,6-连接的葡萄糖，其比例为20.5％；1,4-连接甘露糖，其比例为25.3％；1,4,6-连接的甘露糖，其比例为1.7％，上述比例均基于构成多糖的单糖的总量计。
2.一种制备如权利要求1所述的合欢花非均一多糖AJDW的方法，其包括如下步骤：
(1)多糖的提取：干燥的合欢花沸水提取，得到提取液，对提取液进行浓缩得到浓缩液；向浓缩液中加入乙醇醇沉，收集沉淀，得合欢粗多糖AJD；
(2)多糖的分离：粗多糖AJD经DEAE SepharoseTM Fast Flow阴离子交换柱分离，使用去离子水洗脱，收集去离子水洗脱液的洗脱组分，得到合欢花非均一多糖AJDW。
3.根据权利要求2所述的方法，
其中，步骤(1)中，沉淀所用乙醇为体积分数95％的乙醇水溶液；和/或
步骤(1)中，在进行醇沉前，先对浓缩液进行离心去沉淀，然后对离心上清液进行透析；和/或
其中，步骤(2)中所述阴离子交换柱分离时使用去离子水洗脱并收集该洗脱组分为AJDW；和/或
在步骤(2)中，在用去离子水洗脱后进一步包括将所述洗脱组分减压浓缩，透析和冻干的工序。
4.根据权利要求3所述的方法，
其中，步骤(1)中，沉淀所用的乙醇水溶液体积为浓缩液的3～6倍，
其中，步骤(1)中，透析时间为24～72h。
5.根据权利要求3所述的方法，
其中，步骤(1)中，沉淀所用的乙醇水溶液体积为浓缩液的4倍。
6.一种药物组合物，其包含如权利要求1所述的合欢花非均一多糖AJDW，以及任选的药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其还包含用于治疗胰腺癌的其他药物。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述用于治疗胰腺癌的其他药物为吉西他滨。
9.如权利要求1所述的合欢花非均一多糖AJDW或如权利要求6-8中任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物中的用途。
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