CN113278090B - 一种合欢花多糖、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种合欢花多糖、制备方法及应用。对合欢花多糖进行酸辅助热水法提取。将上述粗提液经乙醇沉淀及反复冻融，得到一级粗提物，再对一级粗提物进行脱蛋白得到二级粗提物，再经柱层析纯化，得到最终产物。上述方法制备得到的合欢花多糖是由均一多糖分子聚合而成，由等比例的阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸组成，物质降解温度为220‑340℃，为耐高温物质。相较于传统热水提取，本方法提取得到的粗提液含糖量更大；且最终得到的合欢花多糖能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中的TNF‑α和COX‑2两种炎症因子以及iNOS基因的mRNA相对表达量（P<0.05），可用于制备辅助治疗炎症相关中枢系统疾病的药物。

Description

一种合欢花多糖、制备方法及应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种合欢花多糖、制备方法及其应用，制备的合欢花多糖具有显著抗炎症作用，可用于辅助治疗炎症相关的中枢系统疾病。

背景技术

合欢花为合欢属合欢Albizia julibrissin，其干燥的花序常被入药，主要用于镇静催眠，治疗心神不安。有报道表明，合欢花水煎提取物具有较强的催眠作用，但化合物具体成分不明确。

目前国内外对合欢花多糖研究较少，对合欢花多糖功能的研究也仅限于对其粗多糖的抗氧化活性研究。袁建梅等(响应面法优选和合欢花多糖的提取工艺[J].中国药房,2013,24(23):2145-2148)使用热水提取法从合欢花中提取粗多糖，并使用响应曲面法优化多糖提取率，得到最佳提取工艺是浸提温度91.4℃，浸提时间3.7h，液料比26.6:1(ml/g)，在此条件下多糖实际提取率为5.79％。袁建梅等(合欢花多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究[J].湖北农业科技,2013,52(11):2625-2628)使用热水提取法联合正交法优化合欢多糖提取率，得到最佳提取工艺是浸提温度90℃，浸提时间4h，液料比30:1，提取2次，在此条件下多糖实际提取率为5.72％，并得出合欢花粗多糖对羟自由基和亚硝酸根离子有较强的清除能力。

上述现有技术对合欢花多糖的研究仅限于粗多糖水平，多糖成分不明确，因此对于合欢花多糖的制备方法和结构有必要进行深入研究，以期为天然无毒副作用药物成分的替代产品开发提供新的对象。

发明内容

本发明的目的之一，在于提供一种合欢花多糖，所述多糖为均一杂多糖，其重均分子量为550kDa，由摩尔比为1.10:1.01:1的阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸组成，糖苷键组成是→2)-β-D-GalAp-(1→，→2)-β-D-Galp-(1→和→2)-β-D-Araf-(1→，物质降解温度为220-340℃。

本发明的另一目的，在于提供所述的合欢花多糖在制备炎症相关的中枢系统疾病药物中的用途。

优选地，所述的中枢系统疾病为阿尔兹海默病。

本发明的另一目的，在于提供一种合欢花多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)将合欢花的花蕾部分充分晒干，采用酸辅助热水提取法提取，离心得到上清液即为粗提液；所述的酸辅助热水提取法为物料与提取液质量比1:65，pH值1.45，90℃水浴，提取150min；

(2)将步骤(1)所得的粗提液浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱放置15h，离心后取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，反复冻融5次，将溶解液冷冻干燥得到一级粗提物；

(3)取(2)中获得的一级粗提物溶解于蒸馏水，Sevag法脱蛋白6次，加入4倍体积无水乙醇，沉淀冷冻干燥后得到二级粗提物；

(4)取步骤(3)中获得的二级粗提物500mg溶解于15mL蒸馏水，上DEAE-SepharoseCL-6B柱，洗脱步骤为二步法，首先经蒸馏水以60mL/h的速度洗脱1500mL，此步不收集洗脱液，再使用600mL蒸馏水和600mL 1M NaCl溶液进行直线梯度洗脱，此步使用自动部分收集器收集360mL到720mL的流出液，将收集到的流出液用截留分子量3500-5000的透析袋用自来水和蒸馏水各透析20h，将透析液缩后冷冻干燥，得到合欢花初级多糖；

(5)取步骤(4)获得的初级多糖100mg溶于3mL蒸馏水，上Sephacryl S-400HR柱，使用0.2mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，调节流速为0.5mL/min，每24min收集一管，每管收集12mL，收集40-60管洗脱液，经截留分子量3500-5000的透析袋透析，将透析液浓缩和冷冻干燥后得所述合欢花多糖。

优选方式下，步骤(2)中粗提液用60℃旋转蒸发仪减压浓缩40倍。

优选方式下，步骤(3)中一级粗提物制成3％溶解液后使用Sevag法脱蛋白。

优选方式下，所述步骤(4)中凝胶柱的规格为4.6cm(直径)×33cm(高)，透析袋的截留分子量3500。

优选方式下，所述步骤(5)中Sephacryl S-400HR凝胶柱规格为2.6cm(直径)×85cm(高)，透析袋的截留分子量3500。

本发明的有益效果是：

(1)本发明制备得到的合欢花多糖是新型多糖，组分均一，结构明确。该多糖具有糖类物质的特征官能团，由分子质量为550kDa的均一多糖分子聚合而成，糖原组成为阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸，各单糖摩尔比是1.10:1.01:1，糖苷键是→2)-β-D-GalAp-(1→，→2)-β-D-Galp-(1→和→2)-β-D-Araf-(1→，物质降解温度为220-340℃。

(2)采用本发明的制备方法对合欢花多糖进行酸辅助热水法提取，相较于传统热水提取，本方法提取得到多糖提取率更高。将上述粗提液经醇沉及反复冻融，得到一级粗提物，再对一级粗提物进行脱蛋白得到二级粗提物，二级粗提物经DEAE-Sepharose CL-6B和Sephacryl S-400HR柱层析在特定的制备条件下进行纯化，得到最终产物，该工艺简单易行，所得合欢花多糖纯度高，糖含量超过98％，且不含有蛋白质和核酸等杂质。

(3)本发明制备得到的合欢花多糖具有显著抗炎症作用，150μg/mL质量浓度的合欢花多糖能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中的TNF-α和COX-2两种炎症因子的mRNA相对表达量(P<0.05)，抑制率分别为71.31％和68.14％，且能显著降低iNOS基因的表达量(P<0.05)，效果与阳性对照组(地塞米松)无显著差异。TNF-α是脑损伤的重要因素，脑出血后细胞会释放大量TNF-α，TNF-α的高表达可能是血-脑屏障被破坏和神经细胞凋亡等的继发反应。iNOS基因的过表达会释放大量的一氧化氮，从而加剧神经元细胞的损伤。本发明制备得到的合欢花多糖能有效抑制炎症细胞中TNF-α和iNOS的过量表达，且没有毒副作用，有效成分明确，可以作为炎症相关中枢系统疾病的辅助药物。

附图说明

图1为本发明实施例3合欢花多糖AJP的高效凝胶排阻色谱图。

图2为本发明实施例3合欢花多糖AJP红外光谱图。

图3为本发明实施例3标准单糖及AJP的气相色谱图。

图4为本发明实施例3合欢花多糖AJP的热重分析图。

图5为本发明实施例3合欢花多糖AJP的核磁图。

A:¹H,B:¹³C,C:COSY,D:HSQC,E:TOCSY,F:NOESY。

图6为本发明实施例3合欢花多糖AJP的透射电镜图。

图7为本发明实施例4合欢花多糖AJP对LPS刺激RAW264.7小鼠巨噬细胞TNF-α(A),IL-1β(B),COX-2(C)和iNOS(D)mRNA表达的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1酸辅助热水提取法提取合欢花多糖的工艺优化

实验方法：称取1g合欢花花蕾，按照表1实验设计加入相应的蒸馏水，调节pH值，在特定的提取温度下提取得到合欢花粗提液，采用苯酚硫酸法检测所得粗提液的多糖提取率。根据单因素实验结果，发现提取时间对总糖提取率影响小，所以固定提取时间为150min，采用Box-Behnken模型安排实验，以pH值、提取温度、液料比为主要实验因素，研究酸辅助热水提取法对合欢花多糖提取率的影响，结果如表1。

表1酸辅助热水提取法提取合欢花总糖的Box-Behnken设计方案及得率

结果：采用Design-Expert 8.0软件对表1数据进行二次响应面回归拟合，得到多糖提取率Y与所考察的3因素之间的模型，及模型显著性检验结果和R值。该模型的回归方程是Y＝+6.35+0.37A-0.56B+0.16C-0.11AB+0.06AC+0.1BC-0.81A²-0.54B²-0.89C²，多元相关系数R²＝0.9901，说明99.01％的变量可以用这个模型来解释，调整后R²和预测R²分别是0.9773和0.9030，相差小于0.1，p小于0.0001，显著，失拟项是0.2944，不显著，说明模型预测可靠准确。结合回归模型的数学分析，得到酸辅助热水提取合欢花多糖的最适工艺条件为：液料比为65:1，提取温度90℃，浸取pH 1.45，提取时间150min，此时总糖提取率的模型预测值是6.56％，验证试验值为6.49％。

实施例2合欢花多糖的制备方法

(1)将合欢花的花蕾部分充分晒干，称取100g放入6500mL蒸馏水中，使用盐酸调节pH值为1.45，90℃恒温水浴锅提取150min，3500r/min离心5min，得到上清液为粗提取液；

(2)将步骤(1)所得的粗提取液用60℃旋转蒸发仪减压浓缩至150mL，冷却后搅拌同时缓慢加入600mL无水乙醇，4℃冰箱中放置10h以上，3500r/min离心10min后取沉淀。沉淀用100mL蒸馏水溶解后，-20℃冷冻24h，60℃水浴解冻后，离心除去杂质得到溶解液，将溶解液再冷冻解冻，如此反复冻融5次，然后将溶解液冷冻干燥得到一级粗提物；

(3)取(2)中获得的一级粗提物充分溶解于蒸馏水中，按总体积的1/4加入Sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4:1)，充分振荡3h，离心收集上层水相溶解液，对溶解液重复上述步骤6次，直至离心后中间层无固体状蛋白为止，将上层溶解液浓缩后加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱中放置10h以上，离心取沉淀冷冻干燥后得到二级粗提物；

(4)用DEAE-Sepharose CL-6B层析柱对二级粗提取物进行初级纯化，再经过透析和冷冻干燥，得初级多糖，具体如下：

a、DEAE-Sepharose CL-6B凝胶柱的平衡：使用循环水式真空泵对凝胶进行间歇抽真空，至凝胶中不再出现气泡为止。在直径为4.6cm的玻璃层析柱装柱中加入少量蒸馏水，用玻璃棒将凝胶悬浮液缓慢引流进入层析柱，此过程避免产生气泡。打开洗脱杯和恒流泵，调节流速60mL/h，用1200mL以上的蒸馏水平衡层析柱，平衡后的层析柱为4.6cm(直径)×33cm(高)；

b、上样与收集：取500mg二级粗提物溶于15mL蒸馏水，离心后，取上清液上样于上述已经平衡好的DEAE-Sepharose CL-6B层析柱(4.6×33cm)。打开恒流泵，调节流速60mL/h，使用蒸馏水洗脱1200mL以上，然后梯度杯中分别装入600mL蒸馏水和600mL 1M NaCl溶液，进行直线梯度洗脱，打开自动部分收集器进行收集流出液，设定收集器每管收集12mL。用苯酚-硫酸法测定上述收集液糖含量分布情况，合并360mL到720mL的流出液，即30到60管的收集液。将含糖收集液用截留分子量3500的透析袋进行透析，自来水流水透析20h，蒸馏水透析20h，透析液使用旋转蒸发浓缩后冷冻干燥，得初级多糖。

(5)用Sephacryl S-400HR层析柱对步骤(4)获得的初级多糖进一步纯化，得到所述合欢花多糖，具体如下：

将Sephacryl S-400HR凝胶抽气后，制备成直径2.6cm，高85cm的层析柱，使用0.2mol/L NaCl溶液平衡。取步骤(4)获得的初级多糖100mg溶于3mL蒸馏水，上SephacrylS-400HR层析柱，用0.2mol/L NaCl溶液洗脱，流速0.5mL/min，设定每24min收集一管，每管12mL，自动部分收集器收集100管，收集40-60管洗脱液，经透析、浓缩和冷冻干燥后得所述合欢花多糖，命名为AJP。

实施例3合欢花多糖的结构分析

实验方法：1.均一性及分子量分析：采用高效体积排阻色谱法(HPSEC)鉴定样品AJP的组分均一性，使用sugar ks-804色谱柱，流动相为超纯水，流速1mL/min，柱温50℃，示差折光检测器(RIU)检测。根据葡聚糖标准品在sugar ks-804色谱柱的出峰时间，制作分子量标准曲线，计算AJP的相对分子质量。取0.5-1mg/mL AJP水溶液进行全波谱扫描(190-800nm)，检测样品纯度。

2.理化性质分析：使用红外光谱(FTIR)法分析样品的化合物类型，将2mg样品AJP进行KBr压片，Nicolet Nexus 470型红外光谱仪测定。AJP样品的热性质分析，完全干燥的AJP放入70μL氧化铝坩埚中，以氮气为载气，按照10K/min升温速度，使用同步热分析仪在50-600℃内检测。为分析AJP的单糖组成，取30mg AJP用1mol/L硫酸在100℃水解8h，水解液用碳酸钡中和至中性，上清液冷冻干燥，得到单糖水解产物。水解产物经三甲基硅醚化衍生后，将衍生物进行气相色谱分析：hp-5毛细管色谱柱，程序升温160℃→180℃(20℃/min)→220℃(8℃/min,保持2min)→250℃(2min)，检测器温度280℃。

3.核磁共振分析：称取彻底干燥的糖样20mg用1mLD₂O溶解，冷冻干燥交换3次，将活泼氢用氘置换。用0.7mLD₂O溶解后置于核磁管，¹HNMR和¹³CNMR光谱分别在AVANCE-500MHz核磁共振仪的500MHz和125MHz条件下，25℃测定。¹HNMR的化学位移以HOD信号在25℃下为δ4.7ppm为参照。2DNMR光谱图用标准Bruker软件制作，包括¹H/¹H同核相关谱(¹H-¹H COSY)、全相关谱(TOCSY)、异核单量子相干谱(HSQC)和核质子进动效应增强谱(NOESY)。

4.透射电子显微镜观察：将糖样配成1mg/mL溶液，按重量比1:1，加入SDS溶液，80℃水溶2h然后将溶液逐步稀释至5μg/mL，再80℃水浴2h，并不断搅拌。取一滴滤液滴到由铜网支持的多孔碳膜(200网眼，中镜科仪)，空气中自然干燥，用透射电子显微镜(电压80KV)观察分子的形态学。

实验结果：合欢花多糖AJP的高效体积排阻色谱结果如图1所示。结果显示在5.945min仅有1个峰出现，该峰峰型尖锐且对称，说明AJP均一性好，成分单一。采用FTIR检测特征官能团，可以确定纯化样品AJP的物质成分，结果如图2所示。从图中可以看到，在3410cm^-1，2900cm^-1，1640cm^-1和1050cm^-1出现4个吸收峰，它们分别是-OH伸缩振动吸收峰，C-H伸缩震动峰，C＝O吸收峰和C-O-C震动峰，它们代表糖类物质的特征官能团，说明AJP为糖类物质。根据葡萄糖标准曲线(y＝0.0174x+0.01145，R²＝0.999)，计算得出AJP的糖含量为98.10±2.03％。经190-800nm全波谱扫描，AJP不含有蛋白质和核酸类物质。根据标准葡聚糖制作分子质量标准曲线，得出方程y＝-4x+6.31(R²＝0.99)，根据AJP的HPSEC出峰时间5.945min，计算得出AJP分子质量为550kDa。

多糖AJP经硫酸完全水解后，将水解物进行三甲基硅醚化衍生，将衍生物经过GC分析，从而得到AJP的单糖组成成分，结果如图3所示。根据标准单糖衍生物的GC结果，AJP由阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸组成，其摩尔比为1.10:1.01:1。AJP的热重分析(TGA)结果如图4所示。DTG曲线是TGA曲线的一阶微商，可以使结果更直观。从图中可以看出，第一个失重台阶出现在50-150℃以内，主要是吸附水的蒸发，伴随少量糖样的损失。第二个台阶出现在220-340℃范围内，失重率超过50％，这是由于AJP在这个温度时结构发生了剧烈的分解和解聚。

表2 AJP的¹H和¹³C的化学位移

图5是AJP的核磁共振图，根据核磁共振图得到AJP的¹H和¹³C的化学位移，如表2所示。由表2所示化学位移，得出AJP由→2)-β-D-GalAp-(1→，→2)-β-D-Galp-(1→和→2)-β-D-Araf-(1→糖苷键组成。图6是AJP的透射电镜图，结果显示AJP是无分支结构的多糖。

实施例4细胞毒检测及抗炎症作用研究

实验方法：细胞(RAW264.7)培养使用DMEM培养基，含10％血清和1％双抗。在37℃和5％二氧化碳培养箱中培养48h左右，使用细胞刮刀进行继续传代培养。96孔板培养细胞后，使用MTT法检测AJP对RAW264.7的细胞毒性，设置600，300，150，75，25和1μg/mL六个AJP质量浓度。使用1μg/mL脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞产生炎症，建立炎症模型。实验安排空白组，阴性对照组(LPS组)，阳性对照组(地塞米松DXMS组)和样品组(75μg/mL AJP组和150μg/mL AJP组)，每组设置3个平行样。6孔板中培养RAW264.7细胞24h后，更换各组相应的培养基继续培养24h。按照Eastep Super总RNA提取试剂盒(Promega公司)说明书提取各组细胞内总RNA，按照反转录试剂盒进行cDNA的反转录，qPCR Master Mix试剂盒(Promega公司)进行实时荧光定量PCR，扩增条件为95℃15sec，60℃30sec，72℃30sec(45个循环)。以持家基因GAPDH为内参基因，2^-ΔΔCT法计算TNF-α、IL-6、COX-2和iNOS的mRNA的相对表达量。

实验结果：为了研究AJP的抗炎效果，首先寻找其对RAW264.7细胞的无毒孵育浓度，以确保后续抗炎实验的准确进行。实验结果显示，添加75μg/mL或150μg/mL的AJP对RAW264.7细胞生长没有细胞毒性，因此选择上述2个浓度进行后续研究。为了建立炎症模型，添加1μg/mL脂多糖进入RAW264.7细胞，并以此作为阴性对照组(LPS)。如图7所示，与未添加脂多糖的空白组相比，阴性对照组TNF-α(P<0.0001)、IL-1β(P<0.0001)、COX-2(P<0.0001)和iNOS(P<0.05)的mRNA相对表达量均显著增加，说明几种炎症模型构建成功。设置阳性对照组(DXMS)，添加75μg/mL地塞米松与脂多糖共同孵育RAW264.7细胞，样品组则包括75μg/mL和150μg/mL两个质量浓度的AJP，抗炎结果如图7。阳性对照组和样品组均能显著降低炎症因子TNF-α的mRNA相对表达量(P<0.001)，75和150μg/mL样品组的抑制率分别为86.77％和71.31％。经显著性分析得出，两个样品组与阳性对照组对TNF-α表达抑制率无显著差异(P>0.05)。AJP对IL-1β的mRNA相对表达量无显著抑制作用。75和150μg/mL的AJP都能显著降低脂多糖诱导的RAW264.7细胞中COX-2的mRNA相对表达量(P<0.01)，抑制率分别为75.38％和68.14％。75μg/mL AJP不能降低炎症细胞中iNOS基因的表达水平，150μg/mL AJP能显著降iNOS的mRNA相对表达量(P<0.05)，抑制率为27.99％，且与阳性对照组的抑制效果无显著差异(P＝0.187)。

炎症因子的过量表达与很多中枢系统疾病相关，如脑出血病人发病后，细胞会释放趋化因子、炎性因子和一氧化氮等有毒物质，从而加剧损伤神经元。阿尔兹海默病(AD)患者体内趋化因子(TNF-α)和炎性因子含量增多，TNF-α具有神经毒性，也能增加斑块沉积。经以上研究发现，合欢花多糖能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中的TNF-α，COX-2和iNOS炎症因子的mRNA相对表达量(P<0.001)，具有神经元保护作用。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

Claims (8)

1.一种合欢花多糖，其特征在于，所述多糖为均一杂多糖，无分支结构，其重均分子量为550kDa，由摩尔比为1.10:1.01:1的阿拉伯糖，半乳糖和半乳糖醛酸组成，糖苷键组成是→2)-β-D-GalAp-(1→，→2)-β-D-Galp-(1→和→2)-β-D-Araf-(1→，合欢花多糖降解温度为220-340℃；

所述的合欢花多糖，制备方法包括如下步骤：

（1）将合欢花的花蕾部分充分晒干，采用酸辅助热水提取法提取，离心得到上清液即为粗提液；所述的酸辅助热水提取法为物料与水质量比1:65，pH值1.45，90℃水浴，提取150min；

（2）将步骤（1）所得的粗提液浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱放置15 h，离心后取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，反复冻融5次，将溶解液冷冻干燥得到一级粗提物；

（3）取（2）中获得的一级粗提物溶解于蒸馏水，Sevag法脱蛋白6次，加入4倍体积无水乙醇，沉淀冷冻干燥后得到二级粗提物；

（4）取步骤（3）中获得的二级粗提物500mg溶解于15mL蒸馏水，上DEAE-Sepharose CL-6B柱，洗脱步骤为二步法，首先经蒸馏水以60mL/h的速度洗脱1500 mL，此步不收集洗脱液，再使用600 mL 蒸馏水和600 mL 1 M NaCl 溶液进行直线梯度洗脱，此步使用自动部分收集器收集360 mL到720 mL的流出液，将收集到的流出液用截留分子量3500-5000的透析袋透析，用自来水和蒸馏水各透析20h，将透析液浓缩后冷冻干燥，得到合欢花初级多糖；

（5）取步骤（4）获得的初级多糖100 mg溶于3 mL蒸馏水，上Sephacryl S-400 HR柱，使用0.2 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，调节流速为0.5 mL/min，每24 min收集一管，每管收集12 mL，收集40-60管洗脱液，经截留分子量3500-5000的透析袋透析，将透析液浓缩和冷冻干燥后得所述合欢花多糖。

2.如权利要求1所述的合欢花多糖在制备与炎症相关的中枢系统疾病药物中的用途，其特征在于，所述的合欢花多糖降低TNF-α和COX-2两种炎症因子的mRNA相对表达量。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的中枢系统疾病为阿尔兹海默病。

4.一种合欢花多糖制备方法，包括如下步骤：

（1）将合欢花的花蕾部分充分晒干，采用酸辅助热水提取法提取，离心得到上清液即为粗提液；所述的酸辅助热水提取法为物料与水质量比1:65，pH值1.45，90℃水浴，提取150min；

（2）将步骤（1）所得的粗提液浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱放置15 h，离心后取沉淀，用蒸馏水溶解沉淀，反复冻融5次，将溶解液冷冻干燥得到一级粗提物；

（3）取（2）中获得的一级粗提物溶解于蒸馏水，Sevag法脱蛋白6次，加入4倍体积无水乙醇，沉淀冷冻干燥后得到二级粗提物；

（4）取步骤（3）中获得的二级粗提物500mg溶解于15mL蒸馏水，上DEAE-Sepharose CL-6B柱，洗脱步骤为二步法，首先经蒸馏水以60mL/h的速度洗脱1500 mL，此步不收集洗脱液，再使用600 mL 蒸馏水和600 mL 1 M NaCl 溶液进行直线梯度洗脱，此步使用自动部分收集器收集360 mL到720 mL的流出液，将收集到的流出液用截留分子量3500-5000的透析袋透析，用自来水和蒸馏水各透析20h，将透析液浓缩后冷冻干燥，得到合欢花初级多糖；

（5）取步骤（4）获得的初级多糖100 mg溶于3 mL蒸馏水，上Sephacryl S-400 HR柱，使用0.2 mol/L的NaCl溶液作为洗脱液，调节流速为0.5 mL/min，每24 min收集一管，每管收集12 mL，收集40-60管洗脱液，经截留分子量3500-5000的透析袋透析，将透析液浓缩和冷冻干燥后得所述合欢花多糖。

5.如权利要求4所述的一种合欢花多糖制备方法，其特征在于：步骤（2）中粗提液用60℃旋转蒸发仪减压浓缩40倍。

6.如权利要求4所述的一种合欢花多糖制备方法，其特征在于：步骤（4）中DEAE-Sepharose CL-6B柱的规格为直径4.6cm×高33cm，透析袋的截留分子量3500。

7.如权利要求4所述的一种合欢花多糖制备方法，其特征在于：步骤（5）中SephacrylS-400 HR柱规格为直径2.6 cm×高85 cm，透析袋的截留分子量3500。

8.如权利要求4-7任一项所述制备方法制备得到的合欢花多糖。

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