CN112961258B - 一种红参均一性多糖及其提取方法与应用 - Google Patents

一种红参均一性多糖及其提取方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种红参均一性多糖及其提取方法与应用，以红参为原材料，粗提取红参粗多糖；对红参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到红参多糖RGRP‑1；对红参多糖RGRP‑1，采用SephacrylTMS‑300High Resolution柱层析技术提取得到红参均一性多糖RGRP‑1b，红参均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。

Description

一种红参均一性多糖及其提取方法与应用
技术领域
本发明涉及均一性多糖提取领域，特别是一种红参均一性多糖及其提取方法与应用。
背景技术
红参是一种历史悠久的传统中药，近年来，红参的多种生物学活性被广泛研究，主要包括抗炎、心血管效应、减缓细胞衰老、抗氧化和体外抗肿瘤活性。红参是具有很高药用价值的植物，分布于中国长白山和小兴安岭东南部的山区森林地区。红参已在许多国家(例如中国，韩国和日本)用作药用植物数千年。此外，它还包括人参皂苷，聚乙炔，多酚化合物和多糖等多种化学成分，每种成分都是构成免疫调节，抗氧化剂和消炎功能的基本活性成分
红参多糖(Radix Ginseng Rubra polysaccharides,RGRP)是红参的主要生物学活性物质之一，，RGRP的研究逐渐增多，通常包括RGRP的提取分离纯化和生物活性的研究。研究表明许多免疫类多糖可以通过激活免疫细胞，特别是抗原呈递细胞来发挥免疫调节作用。抗原呈递细胞表面有大量的Toll样受体(TLR)，可以识别抗原并激活细胞内信号通路，在先天和适应性免疫反应中至关重要，参与了一些中药多糖的抗肿瘤活性。
传统的多糖的分离提取方法包括水提醇沉法以及酶提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法、超高压提取技术微波辅助提取法和双水相萃取等新技术,对其分离原理、处理方式和效果都不相同。
在公开为CN101250234A，名为“一种红参的制备方法”的发明专利中通过取红参或经过70％--100％乙醇溶液提取后的红参药渣，加入溶剂进行提取，得提取液；提取液浓缩，得浓缩液；浓缩液加入75-100％乙醇溶液至适量进行醇沉，得沉淀；沉淀干燥，得红参多糖提取物；
在公开为CN101550197B，名为“一种从红参醇废料种中回收人参多糖的方法”的发明专利中通过将红参根经热水提取，乙醇沉淀，去除蛋白，冷冻干燥得红参多糖；对比文件1和对比文件2中的不足在于：没有用柱层析方法进一步的分离纯化，提取的红参多糖不是均一性多糖，纯度低，未能检测出其分子量和单糖组成；
在“红参多糖的分离纯化及结构分析”中，将红参经水煮醇沉，除蛋白，柱层析后得到相应多糖片段，其不足之处在于：红参多糖不是均一性多糖，没有进行红参多糖生物活性进行探索。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种红参均一性多糖。
本发明的第二目的是提供一种红参均一性多糖的提取方法。
本发明的第三目的是探讨红参均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种红参均一性多糖，所述均一性多糖RGRP-1b的分子量为10.165kDa，其单糖组成包括有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸。
进一步，所述均一性多糖RGRP-1b的总多糖含量为：98.37％，蛋白含量为：1.13％，所述单糖组成包括有阿拉伯糖6.31％、半乳糖9.50％、葡萄糖83.15％、半乳糖醛酸1.04％。
进一步，具体步骤如下：
1)以红参为原材料，粗提取红参粗多糖；
2)对红参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到红参多糖RGRP-1；
3)对红参多糖RGRP-1，采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取得到红参均一性多糖RGRP-1b。
进一步，步骤1)中所述粗提取红参粗多糖的具体方法如下：
1-1)水提：将原料红参粉碎，得到红参粉末；在热水提取反应杯中加入150～250份红参粉末，再加入1500～2500份蒸馏水Ⅰ，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入1200～2000份蒸馏水Ⅱ，置于75℃～85℃水浴中搅拌1.5～2.5h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到红参水溶性粗提取物；
1-2)乙醇沉淀：取冷却后的红参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，并不断搅拌，静置于4℃环境，沉淀16～24h，离心，取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白：取10～20份沉淀物Ⅰ，用25～50份蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌8～12Min，再4000rpm离心处理3～5min，取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；
1-4)透析浓缩冷冻干燥：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋，在纯水中透析36～48h，然后在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得红参粗多糖。
进一步，步骤1-1)中水浴温度为80℃、水浴时间为2小时、红参粉末200份、蒸馏水Ⅰ2000份、蒸馏水Ⅱ1600份；
步骤1-2)中沉淀时间24h；
步骤1-3)中电动搅拌时间10min、离心时间5min、沉淀物Ⅰ10份、蒸馏水Ⅲ25份；
步骤1-4)中透析袋截留分子量为3500Da、透析时间48h。
进一步，步骤2)中所述采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取红参多糖的具体步骤如下：
2-1)预处理：向柱中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置18～24h；用0.4～0.6mol/L的HCl洗1-2个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为30～50min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90min～130min；
2-2)取0.3～0.4份红参粗多糖，溶于25～30份蒸馏水Ⅳ中，以速度3～4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6～8mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液RGRP-1。
2-4)对于洗脱液RGRP-1，选取截留分子量为3000～4000Da的透析袋，使RGRP-1在纯水中透析36-48h，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参多糖RGRP-1。
进一步，步骤2-1)中静置时间为24h、HCl浓度0.5mol/L、速度6mL/min、时间35min，DEAE SepharoseTM Fast Flow层析柱的内径为3.5cm、长度为40cm；
步骤2-2)中上样速度为4mL/min、洗脱速度6mL/min、红参粗多糖0.3份、蒸馏水Ⅳ25份；
步骤2-4)中透析袋截留分子量为3500Da、透析时间48h。
进一步，步骤3)中所述采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取红参均一性多糖的具体步骤如下：
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水1～3ml，将SephacrylTMS-300High Resolution加入柱管中，静置18～24h；用PBS平衡液洗1～2个柱体积，速度为0.5～1mL/min，时间为200～500min；在用蒸馏水洗1～2个柱体积，速度为0.5～1mL/min，时间为200～500min；
3-2)取0.025～0.035份红参多糖RGRP-1，溶于1～1.5份蒸馏水Ⅴ中，以0.5～1mL/min上样；用蒸馏水洗脱40管，3mL/管，速度1mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b；
3-3)用示差检测器分别检测洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b的折光度，选取单峰的洗脱液RGRP-1b。
3-4)针对单峰洗脱液RGRP-1b，选取截留分子量为3000Da～4000Da的透析袋分别透析，在纯水中透析36h～48小时，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，通过旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参均一性多糖RGRP-1b。
进一步，步骤3-1)中，静置时间为24h、平衡液2个柱体积，平衡速度0.5mL/min、平衡时间260min，SephacrylTMS-300High Resolution层析柱的内径为1.2cm、长度为80cm；
步骤3-2)中上样速度为0.5mL/min、红参多糖RGRP-1为0.03份、蒸馏水Ⅵ为1份；
步骤3-4)中，透析袋截留分子量为3500Da、透析时间48h。
进一步，所述的红参均一性多糖在肝癌免疫调节抗肿瘤方面的应用。
由于采用了上述技术方案，本发明具有如下的优点：
1、本发明首先以红参为原材料，采用传统的水提醇沉法提取红参粗多糖，接着将提取的红参粗多糖通过两次柱层析分离纯化，得到两个片段的红参均一性多糖，且具有较强的免疫活性。
2、本发明通过柱层析方法进行进一步的分离纯化，从红参中提取纯化得到的红参多糖是均一性多糖，且纯度高，且为中性糖，并检测出其分子量和单糖组成。本发明提取的红参多糖具有独有分子量和成分，通过试验证明：红参均一性多糖在免疫调节方面的发挥作用。
本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书和权利要求书来实现和获得。
附图说明
本发明的附图说明如下。
图1为本发明的多糖提取流程图；
图2为DEAE SepharoseTM Fast Flow洗脱曲线；
图3为SephacrylTMS-300High Resolution洗脱曲线和为凝胶渗透色谱结果图；
图4为离子色谱色谱结果图；
图5为红外光谱图；
图6为红参均一性多糖RGRP-1b甲基化结果图；
图7为红参均一性多糖RGRP-1b 1H NMR光谱图；
图8为红参均一性多糖RGRP-1b 13C光谱图；
图9为实施例6中RGRP-1b对巨噬细胞释放NO的影响实验结果图；
图10为实施例6中RGRP-1b对巨噬细胞产生TNF-α的影响实验结果图；
图11为实施例6中RGRP-1b对巨噬细胞产生IL-6的影响实验结果图；
图12为实施例6中RGRP-1b对巨噬细胞产生IL-12的影响实验结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：红参均一性多糖的提取，如图1所示。
1)以红参为原材料，粗提取红参粗多糖；
1-1)水提：将原料红参粉碎，得到红参粉末；在热水提取反应杯中加入200份红参粉末，再加入2000份蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入1600份蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到红参水溶性粗提取物；
1-2)乙醇沉淀：取冷却后的红参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，并不断搅拌，静置于4℃环境，沉淀24h，离心，取沉淀物Ⅰ；
1-3)去除蛋白：取10份沉淀物Ⅰ，用25份蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10min，再4000rpm离心处理3min，取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；
1-4)透析浓缩冷冻干燥：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3500Da的透析袋，在纯水中透析48h，然后在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得红参粗多糖。
2)对红参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到红参多糖RGRP-1；
2-1)预处理：向柱中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM FastFlow加入柱管中，静置h；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90min～130min；
2-2)取0.3份红参粗多糖，溶于25份蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3；
2-3)使用苯酚-硫酸法检测洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液RGRP-1，如图2所示。
2-4)对于洗脱液RGRP-1，选取截留分子量为3500Da的透析袋，使RGRP-1在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参多糖RGRP-1。
3)对红参多糖RGRP-1，采用SephacrylTMS-300High Resolution柱层析技术提取得到红参均一性多糖RGRP-1b。
3-1)预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水2ml，将SephacrylTMS-300HighResolution加入柱管中，静置h；用PBS平衡液洗1个柱体积，速度为0.5mL/min，时间为260min；在用蒸馏水洗1个柱体积，速度为0.5mL/min，时间为260min；
3-2)取0.03份红参多糖RGRP-1，溶于1份蒸馏水Ⅴ中，以0.5mL/min上样；用蒸馏水洗脱40管，3mL/管，速度1mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b；
3-3)用示差检测器分别检测洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b的折光度，选取单峰的洗脱液RGRP-1b，如图3所示。
3-4)针对单峰洗脱液RGRP-1b，选取截留分子量为3500Da的透析袋分别透析，在纯水中透析48小时，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，通过旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参均一性多糖RGRP-1b。
实施例2：鉴定红参均一性多糖RGRP-1b的分子量和纯度
1、实验材料
实施例1中条件所制得的红参均一性多糖RGRP-1b、NaNO3、NaN3、窄分布聚乙二醇(PEG)
2、实验方法
将RGRP-1b上样后用HPGPC系统(日本岛津LC20凝胶渗透色谱仪；日本TOSOH公司TSKgel GMPWXL水相凝胶色谱柱)分析，用示差检测器(日本Shimadz公司，RID-20a)记录结果。流动相为0.1N NaNO3+0.06％NaN3水溶液，流动相流速0.6mL/min，柱温35℃。标准样品为窄分布聚乙二醇(PEG)，采用窄分布PEG做标准曲线，使用相对校正法，测试完成后用葡聚糖的参数做普适校正。
3、实验结果
结果如图2至图4所示，结果显示RGRP-1b为单一的对称峰，表明其为均一的多糖，分子量大小分别为10.165kDa。
实施例3：检测红参均一性多糖的单糖组成及红外吸收情况
1、实验材料
实施例1中条件所制得的红参均一性多糖RGRP-1b、甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、N-乙酰-氨基葡萄糖、葡萄糖、N-乙酰-氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖对照品、PMP-甲醇、TFA、氯仿、磷酸二氢钾溶液、氢氧化钠溶液、乙腈、NaOH、HCl
2、实验方法
对照品溶液的配置：取干净的15ml EP管，加入8ml无菌水，依次加入岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸各100mg，溶解后用容量瓶定容至10ml，配制成10mg/ml的标准液母液。将上述混标母溶液先稀释100倍，制备成100μg/ml工作液，将取上述溶液按照以下梯度稀释，装入1.5mL的EP管中。
样品的配置：取干净的色谱瓶，精确称量多糖样品5mg(±0.05mg)，加入配置好的TFA酸溶液，121℃加热2小时。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复甲醇清洗2-3次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。
(取经配置处理好的样品上清液)取样品上清液，色谱系统采用的是ThermoICS5000+离子色谱系统(ICS5000+，(Thermo Fisher Scientific，USA)，采用DionexTMCarboPacTMPA10(250*4.0mm，10um)液相色谱柱，进样量为20uL。流动相A(H2O)，流动相B(100mM NaOH)，柱温为30℃，利用电化学检测器对单糖组分进行分析检测。
红外光谱吸收操作过程：采用250nm波长检测，通过红外光谱检测红参均一性多糖的红外吸收情况，样品和KBr约以1:100的比例混合研磨均匀，取100mg混合样品进行压片，压力为10MPa。首先以空白KBr压片作为参比采集背景，然后采集样品的红外光谱。红外仪器是美国尼高力公司的Nicolet iS10，波数范围400-4000cm-1，分辨率4cm-1，室温进行。
3、实验结果
表1红参均一性多糖RGRP-1b的单糖组成检测结果
Figure BDA0002954490400000081
单糖组成检测结果：如表1和图4所示，红参均一性多糖RGRP-1b的单糖组成摩尔比为：阿拉伯糖6.31％、半乳糖9.5％、葡萄糖83.15％、葡萄糖醛酸1.04％。
红外光谱吸收结果：如图5所示，在3400cm-1附近的吸收峰是因O-H伸缩振动；在2927.84cm-1和1415.35cm-1附近的吸收峰与C-H的伸缩和弯曲振动有关；RGRP-1b图中1631.93cm-1处的吸收带表示C＝C的伸缩振动；
RGRP-1b在1152.44cm-1处的吸收峰暗示吡喃糖的存在，1026.75cm-1表示C-O-H的变形振动，表示富含葡萄糖，在1200-1000cm-1区域内的信号归于C-O-C的伸缩振动，证明他们有吡喃糖环，1000-520cm-1之间的很多峰暗示有吡喃糖环上的β糖苷键；此外RGRP-1b在763.24cm-1代表为D-吡喃葡萄糖衍生物。
实施例4：红参均一性多糖RGRP-1b甲基化分析
1、实验材料
实施例1中条件所制得的红参均一性多糖RGRP-1b、二甲亚风、氢氧化钠、碘甲烷、二氯甲烷、三氟乙酸、氨水、硼氘化钠、乙酸酐、乙酸
2、实验方法
准确称取待测样品1mg，加入500μlDMSO溶解。加入50μl120mg·ml-1DMSO/NaOH溶液，孵育30min。加入10μl碘甲烷溶液，反应10min；再加10μl碘甲烷溶液，反应10min；加10μl碘甲烷溶液，反应1h。加入1ml水和500μl DCM，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次。吸取下层DCM相并蒸干。加入100μl 2M TFA，121℃反应90min。30℃蒸干。加入50μl 2M氨水，50μl1M NaBD4，混匀，室温下反应2.5h。加入20μl乙酸终止反应，氮气吹干，
加入1ml水静置10min。加入500μl DCM，涡旋混匀，离心，弃水相。重复水洗3次。取下层DCM相，上机检测。
上机检测本次实验的分析仪器为安捷伦公司(Agilent Technologies Inc.CA,UAS)的7890A-5977B气质联用仪。色谱系统采用的是Agilent气象色谱系统(Agilent7890A；Agilent Technologies，USA)，根据化合物的性质，进样量为1μl，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3min。
3、实验结果
表2 RGRP-1b甲基化结果
Figure BDA0002954490400000101
如表2和图6所示，RGRP-1b共由9种连接方式分别为:t-Ara(f)t-Glc(p)、5-Ara(f)、4-Gal(p)、4-Glc(p)、6-Gal(p)、3,4-Glc(p)、4,6-Glc(p)、3,6-Gal(p)。相对摩尔比(％)为：1.840、18.778、1.008、2.548、64.154、1.750、0.670、8.416、0.837。
实施例5：红参均一性多糖RGRP-1b的一维核磁(1H and 13C)谱
1、实验材料
实施例1中条件所制得的红参均一性多糖RGRP-1b、核磁管、重水(D2O)。
2、实验方法
样品溶液的配制：称取RGRP-1b 30mg溶解于500uL D2O中，装入核磁管中上机检测。
实验过程：将核磁管先后上机检测。1H谱温度：298K，扫描次数：64次；13C谱：298K，扫描次数12244次(10小时)。
3、实验结果
NMR提供了碳水化合物的详细结构信息，包括α-或β-端基异构体构型，键模式和糖单元序列。进行了1D NMR研究，以了解纯化的多糖的结构。基于单糖组成和甲基化分析的结果，通过1D NMR光谱进一步研究了RGRP-1的结构。如图7所示，RGRP-1b的1H NMR光谱显示，存在三个主要峰和四个其他峰在异头物区域(4.4-5.6ppm)出现峰，这意味着存在七种葡糖残基。δH 4.4–5.5ppm处的异头质子和δC 95-110ppm处的异头碳的共振信号证实了RGRP-1b中同时存在α和β构型。在核磁共振波谱的低场区δ170-180中没有明显的碳信号，表明RGRP-1的多糖是中性多糖；
如图8所示，在RGRP-1b中，残基的异头质子的化学位移为5.34、5.30、4.91、4.43、5.02、4.59、5.18ppm，且相应的13C信号共振为99.58、99.72、98.55、103.34、103.34、107.38、104.3、108.76ppm。其中，残基5.34、5.30、4.91、5.02、5.18ppm异头氢的化学位移大于5.00，表明它们是α-吡喃糖环。残基4.43和4.59的异头氢的化学位移小于5.00，表明为β-吡喃糖环。
实施例6：红参均一性多糖在免疫调节的实验
1、实验材料：
实施例1中条件所制得的红参均一性多糖RGRP-1b、细胞因子ELISA检测试剂盒、一氧化氮检测试剂盒、胰酶、青-链霉素、巨噬细胞、胎牛血清、细胞培养基
2、实验方法：
样品溶液的配制：称取RGRP-1b10mg溶解于2mL DMEM中，制得浓度为5mg/mL的溶液。ADM的浓度为0.4mg/mL。
实验过程：将巨噬细胞RAW264.7铺板于24孔板中(5×104cells/ml)，待细胞贴壁后将不同浓度的RGRP-1b加入不同的孔中，作用24h后，收集培养基上清，2000rpm离心10分钟，使用NO检测试剂盒和ELISA试剂盒按操作说明书分别检测NO、TNF-α、IL-6、IL-12的含量。
3、实验结果：
1、检测RGRP-1b对巨噬细胞NO分泌的影响：
如图9所示，结果显示浓度为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL的RGRP-1b能促进巨噬细胞生成NO。
2、检测RGRP-1b对巨噬细胞释放TNF-α、IL-6、IL-12的影响：
如10所示，结果显示：浓度为200μg/mL-400μg/mL的RGRP-1b都能促进巨噬细胞生成TNF-α。
如图11所示，浓度为100μg/mL-400μg/mL的RGRP-1b都能促进巨噬细胞生成IL-6(差异有统计学意义)。
如图12所示，浓度为200-400μg/mL的RGRP-1b能促进巨噬细胞生成IL-12。
最后应当说明：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，而未脱离本发明精神和范围的任何修改或者等同替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (2)

1.一种红参均一性多糖，其特征在于，所述均一性多糖RGRP-1b的分子量为10.165kDa，其单糖组成包括有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸；
所述均一性多糖RGRP-1b的总多糖含量为：98.37%，蛋白含量为：1.13%，所述单糖组成包括有阿拉伯糖6.31%、半乳糖9.50%、葡萄糖83.15%、半乳糖醛酸1.04%；
所述的一种红参均一性多糖的提取方法，具体步骤如下：
1）以红参为原材料，粗提取红参粗多糖；
1-1）水提：将原料红参粉碎，得到红参粉末；在热水提取反应杯中加入200份红参粉末，再加入2000份蒸馏水Ⅰ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅰ；残渣中再加入1600份蒸馏水Ⅱ，置于80℃水浴中搅拌2h，过滤收集提取液Ⅱ；合并提取液Ⅰ和提取液Ⅱ，离心去除沉淀，在旋转蒸发仪上减压浓缩，得到红参水溶性粗提取物；
1-2）乙醇沉淀：取冷却后的红参水溶性粗提取物，加入4倍体积的无水乙醇，并不断搅拌，静置于4℃环境，沉淀24h，离心，取沉淀物Ⅰ；
1-3）去除蛋白：取10份沉淀物Ⅰ，用25份蒸馏水Ⅲ溶解，加入其体积五分之一的sevag试剂，电动快速搅拌10min，再4000rpm离心处理3min，取上清液Ⅰ重复加入其体积五分之一的sevag试剂搅拌离心处理，直到蛋白除尽，得到上清液Ⅱ；
1-4）透析浓缩冷冻干燥：取上清液Ⅱ，选取截留分子量为3500Da的透析袋，在纯水中透析48h，然后在旋转蒸发仪上减压浓缩，并在冻干机内冷冻干燥，制得红参粗多糖；
2）对红参粗多糖提取物，采用DEAE SepharoseTM Fast Flow柱层析技术提取得到红参多糖RGRP-1；
2-1）预处理：向柱中加入用于防止气泡的蒸馏水5ml，将DEAE SepharoseTM Fast Flow加入柱管中，静置18～24h ；用0.5mol/L的HCl洗1个柱体积，速度为6mL/min，时间为35min；再用超纯水平衡3～5个柱体积，速度为6～8mL/min，时间为90min～130min；
2-2）取0.3份红参粗多糖，溶于25份蒸馏水Ⅳ中，以速度4mL/min上样，分别用水、0.15mol/L和0.3mol/L的NaCl洗脱40管，8mL/管，速度6mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3；
2-3）使用苯酚-硫酸法检测洗脱液RGRP-1、洗脱液RGRP-2和洗脱液RGRP-3的吸光度，选取吸光度为单峰的洗脱液RGRP-1；
2-4）对于洗脱液RGRP-1，选取截留分子量为3500Da的透析袋，使RGRP-1在纯水中透析48h，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参多糖RGRP-1；
3）对红参多糖RGRP-1，采用SephacrylTMS-300 High Resolution柱层析技术提取得到红参均一性多糖RGRP-1b；
3-1）预处理：向柱管中加入用于防止气泡的蒸馏水2ml，将SephacrylTMS-300 HighResolution加入柱管中，静置18～24h；用PBS平衡液洗1个柱体积，速度为0.5mL/min，时间为260min；再用蒸馏水洗1个柱体积，速度为0.5mL/min，时间为260min；
3-2）取0.03份红参多糖RGRP-1，溶于1份蒸馏水Ⅴ中，以0.5mL/min上样；用蒸馏水洗脱40管，3mL/管，速度1mL/min，分别得到洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b；
3-3）用示差检测器分别检测洗脱液RGRP-1a和洗脱液RGRP-1b的折光度，选取单峰的洗脱液RGRP-1b；
3-4）针对单峰洗脱液RGRP-1b，选取截留分子量为3500Da的透析袋分别透析，在纯水中透析48小时，其间隔4h换一次水，收集透析袋内的液体，通过旋转蒸发浓缩后冻干，保存于-20℃环境，得到红参均一性多糖RGRP-1b。
2.如权利要求1所述的红参均一性多糖在制备肝癌免疫调节抗肿瘤药物中的应用。
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