CN114874352B - 一种红参hg型果胶的制备方法和结构表征方法 - Google Patents
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Abstract
本发明关于多糖制备与结构表征技术领域，尤其涉及一种红参HG型果胶的制备方法和结构表征方法。本发明提供的制备方法依次通过总多糖的提取，淀粉酶酶解，柱层析，透析截留制得红参HG型果胶，所得红参HG型果胶通过HPSEC、UHPLC‑UV、GC‑MS、IR以及NMR的结合以实现结构表征。本发明不仅可以制得高纯度、均一的红参果胶类多糖，还为高纯度HG型果胶的制备、结构表征提供了新的启发。
Description
技术领域
本发明关于多糖制备与结构表征技术领域，尤其涉及一种红参HG型果胶的制备方法和结构表征方法。
背景技术
植物体内富含多种多糖类成分，这些多糖是各种单糖通过糖苷键的方式结合在一起而成，其中以淀粉类多糖和酸性的果胶类多糖含量最高，而具有酸性多糖结构单元的果胶类多糖具有明显的药理活性。果胶类多糖根据组成的差异，可以分为HG型果胶(Homogalacturonans)、RG-I型果胶(Rhamngalacturonan I)和RG-II型果胶(Rhamngalacturonan II)。HG型果胶主要以高含量的GalA构成，且GalA含量超过60％，聚合度范围约在70-100；RG-I型果胶是具有严格交替的Rha和GalA序列的果胶片段。RG-II型果胶由于其含量极为稀少，且主链侧链结构极为复杂，因此目前的研究以HG型果胶和RG-I型果胶为主。红参中富含多糖，获得高纯度的红参HG型果胶并对其进行结构表征，为进一步深入研究以及相关产品的开发具有积极意义。但目前关于红参HG型果胶的制备方法未见报道。而果胶类多糖在组成上含有多羧基的主链，同时具有多分支的侧链，单糖组成相对复杂，常规的检测方法往往难以准确表征其结构。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种红参HG型果胶的制备方法和结构表征方法。该制备方法能够从红参中获得HG型果胶，可用于进一步分析研究；该结构表征方法通过配合使用HPSEC、UHPLC-UV、GC-MS、IR以及NMR，能够准确进行红参HG果胶的结构表征。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
第一方面，本发明提供了一种红参HG型果胶的制备方法，具体包括以下步骤：
S1、以水提醇沉的方法提取分子量≥3500Da的红参总多糖；
S2、将所述红参总多糖用淀粉酶酶解，得到酶解液；
S3、以弱阴离子交换纤维素为固定相，依次以水和0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M的NaCl水溶液为洗脱溶剂，对所述酶解液进行柱层析，分别收集用不同洗脱溶剂得到的洗脱液；
S4、以盐酸调节所述洗脱液的pH值为中性，浓缩后透析获得分子量≥3500Da的样品，得到所述红参HG型果胶。
据文献报道，红参中富含多种多糖类成分，其中总多糖中以大量的淀粉类多糖为主。为了获取高纯度的酸性多糖，本发明提供的上述制备方法首先通过淀粉酶酶解的方式对总多糖样品进行处理，对非目标成分的淀粉类多糖进行去除，获得非淀粉类多糖；然后利用弱阴离子交换纤维素作为固定相，结合特定浓度的洗脱溶剂和洗脱顺序，能够从红参中制得红参HG型果胶。每种洗脱液中红参HG型果胶类型、纯度和含量不同，可分别进行分离、纯化，以得到高纯度的红参HG型果胶。
结合第一方面，S1中以水提醇沉的方法提取红参总多糖的操作为：将红参以水提取，得水提液；向所述水提液中加入乙醇至乙醇含量为75％～85％(v/v)，沉淀后将所得沉淀干燥，以水复溶后加入Sevage试剂(即氯仿：正丁醇＝4：1(v/v))，混合后离心，将上清液用截留分子量为3500Da的透析袋透析，将截留液干燥，得红参总多糖。
可选地，以水提取的方式为超声提取。提取温度优选采用60～80℃，超声提取频率优选采用35～45kHz。
优选地，所述乙醇含量为80％(v/v)。
优选地，用于复溶的水的体积与所述Sevage试剂的体积比为4.5～5.5：1，优选采用5：1。
结合第一方面，S3中所述弱阴离子交换纤维素为DEAE纤维素DE-52。利用DEAE纤维素DE-52对红参中非淀粉类多糖进行分离、纯化，能够获得较高纯度的糖醛酸类化合物。
优选地，依次以水和0.05M、0.1M、0.2M的NaCl水溶液为洗脱溶剂，其中以水和0.05M、0.1M的NaCl水溶液洗脱时，洗脱溶剂的体积为5倍树脂床体积(BV)，然后以0.2M的NaCl水溶液、以3倍树脂床体积洗脱，收集以最后一倍树脂床体积洗脱所得洗脱液。经过该洗脱过程，在以最后一倍树脂床体积洗脱所得洗脱液中，可获得高纯度的、均一的红参HG型果胶。
第二方面，本发明提供了一种按上述制备方法制得的红参HG型果胶的结构表征方法，具体包括：
用HPSEC-MALLS-RID(高效凝胶排阻色谱法-多角度激光光散射检测器-示差折光检测器)分析红参HG型果胶的分子量分布；将所述红参HG型果胶经完全水解、衍生化制成衍生化单糖，用UHPLC-UV(液相-紫外法)对所述衍生化单糖进行检测；将所述红参HG型果胶制成甲基化衍生物，用GC-MS(气相色谱-质谱)进行检测；利用IR(红外光谱)、NMR(核磁共振)对所述红参HG型果胶进行分析；结合HPSEC-MALLS-RID、UHPLC-UV、GC-MS、IR和NMR的分析结果，得到红参HG型果胶的结构表征结果。
该方法通过使用HPSEC、UHPLC-UV、GC-MS、IR以及NMR对所获取的酸性多糖的特征信息进行采集，通过数据对比分析可实现纯化多糖的表征。
结合第二方面，所述HPSEC-MALLS-RID中的HPSEC色谱条件为：色谱柱为TSK G4000PWXL，流动相为150mmol/L的甲酸铵溶液，柱温箱温度为30℃，流速为0.6mL/min，进样体积为30μL，示差折光检测器温度为40℃。
优选地，所述HPSEC-MALLS-RID中MALLS中的参数设置为：检测波长：650～670nm；激光角度范围：6～10个，15°～170°；折光指数增量(dn/dc)：0.1380mL/g。优选参数为：检测波长：660nm；激光角度范围：8个，23°～155°；折光指数增量：0.1380mL/g。
结合第二方面，水解所述红参HG型果胶的方法可采用以下操作：将所述红参HG型果胶溶于水，加入三氟乙酸水溶液，加热水解。
可选地，三氟乙酸水溶液的浓度为4.0M，加入至三氟乙酸终浓度为2.0M。
优选地，加热水解的温度为100～120℃，更优选为110℃。
优选地，水解时间为1.5h～2.5h，进一步优选为2h。
结合第二方面，衍生的方法可采用以下操作：将水解后的产物溶于水中，加入氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，加热反应后加入盐酸溶液中和，通过萃取去除1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮。
优选地，氢氧化钠溶液的浓度为0.6M，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液的浓度为0.5M，盐酸溶液的浓度为0.3M
优选地，萃取所用溶剂为三氯甲烷或二氯甲烷。
结合第二方面，所述UHPLC-UV液相-紫外中的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A为50mM醋酸铵(AA)水溶液，流动相B为乙腈(ACN)，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
流速：0.28～0.32mL/min；
柱温：25～30℃。
优选地，所述色谱柱为Waters CORTECS UPLC C18+，规格为2.1×100mm,1.6μm。在本发明的色谱条件下，采用该色谱柱可达到更好的分离度、峰型以及色谱峰出峰个数。
优选地，所述柱温为28℃。在本发明的色谱条件下，柱温为28℃时可获得更多的出峰个数以及更好分离度。
优选地，所述流速为0.3mL/min。
可选地，样品盘温度为10℃，进样量为2μL。
结合第二方面，将所述红参HG型果胶制成甲基化衍生物的操作包括：将所述红参HG型果胶溶于水中，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐水溶液进行衍生化，反应结束后，加入咪唑水溶液充分混合后，加入硼氢化钠(NaBH4)或硼氘化钠(NaBD4)进行还原反应，反应结束后淬灭反应，用截留分子量为3500Da的透析袋透析，将截留液干燥，进行甲基化、酸水解、还原和乙酰化。1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐水溶液的浓度优选为80～120mg/mL，反应温度为室温。咪唑水溶液的浓度优选为1.8～2.2M。以硼氢化钠和硼氘化钠作为还原剂可以产生不同质量数的质谱碎片，可用于鉴定Gal或者GalA。硼氢化钠和硼氘化钠的浓度优选为25～35mg/mL。还原反应结束后，可采用冰醋酸淬灭反应。酸性多糖经过羧基还原后，进一步进行甲基化反应、水解、还原、乙酰化等一系列反应后，使原本的多糖链状结构发生一系列加成、水解、衍生等过程，使之可以被气化，进而实现在GC-MS上的分离与检测。
优选地，所述甲基化的方法为：将截留液干燥后的产物以DMSO溶解，加入NaOH解离羟基，再加入碘甲烷进行甲基化反应，反应完成后加水终止反应，再以二氯甲烷萃取，获得甲基化产物。
优选地，所述酸水解的方法为：将所述甲基化产物以三氟乙酸水溶液溶解，加热进行水解反应，反应完成后干燥，获得酸水解产物。三氟乙酸水溶液的浓度优选为1.8～2.2M，水解反应温度优选为115～125℃，反应时间优选为80～100min。
优选地，所述还原的方法为：向所述酸水解产物中加入氨水溶液和NaBD4水溶液进行还原反应，反应结束后加酸终止反应，将反应液干燥，获得还原产物。其中氨水溶液的浓度优选为1.8～2.2M，NaBD4水溶液的浓度优选为0.8～1.2M，反应结束后加入冰乙酸终止反应。
优选地，所述乙酰化的方法为：向所述还原产物中加入乙酸酐，加热反应，反应结束后加水终止反应，再以二氯甲烷萃取，获得红参HG型果胶的甲基化衍生物。
结合第二方面，所述GC-MS的色谱条件为：色谱柱为BPX70气相色谱柱(0.22mm×25m，0.25μm)，进样口温度为240℃，进样量为1μL，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃，保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3min。
所述GC-MS的质谱条件为：离子源为电子轰击离子源，在全扫描(SCAN)模式下进行检测，质量扫描范围m/z 30～600。
结合第二方面，所述结构表征方法还包括红外(IR)分析和核磁(NMR)分析。
本发明的有益效果在于：本发明通过先以淀粉酶酶解，再以特定固定相、洗脱溶剂及洗脱顺序进行柱层析，能够制备得到红参HG型果胶。本发明提供的结构表征方法通过HPSEC、UHPLC-UV、GC-MS、IR以及NMR的配合以及相应检测方法中的样品处理方式，能够准确地实现该红参HG型果胶的结构表征。并且由结构表征的结果可见，本发明制备方法能够制得高纯度、均一的糖醛酸类化合物。所得糖醛酸类化合物可进一步用于药理活性研究。同时，本发明提供的红参HG型果胶的制备方法和结构表征方法还为高纯度HG型果胶的制备、结构表征提供了新的启发。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1中红参多糖酶解与纯化酸性多糖的分离流程图；
图2是本发明实施例2中RG0203的HPSEC-MALLS-RID色谱图；
图3是本发明实施例2中RG0203的HPSEC色谱图；
图4是本发明实施例2中UHPLC-UV分析9种混合单糖标准品和RG0203PMP衍生物的单糖组成的结果；
图5是本发明实施例2中RG0203甲基化衍生物的GC图；
图6是本发明实施例2中RG0203的红外光谱图；
图7是本发明实施例2中RG0203的1H NMR图；
图8是本发明实施例2中RG0203的13C NMR图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
植物体内的多糖中，具有酸性多糖结构单元的果胶类多糖往往具备明显的药理活性。目前对于果胶类多糖的研究主要集中在HG型果胶和RG-I型果胶。
红参是一种富含多糖的中药，通过对红参HG型果胶的针对性研究，有利于进一步了解红参的药理活性、作用机制，并有利于红参相关产品的开发。因此，获得高纯度的红参HG型果胶并对其进行结构表征。但现有技术中并未记载如何获得高纯度的红参HG型果胶，并且，果胶类多糖的单糖组成复杂，难以通过常规的检测方法对其结构进行表征。
本发明通过大量试验研究，获得一种红参HG型果胶的制备方法，能够制得高纯度的红参HG型果胶。该制备方法包括以下步骤：
S1、以水提醇沉的方法提取分子量≥3500Da的红参总多糖；
S2、将所述总多糖用淀粉酶酶解，得到酶解液；
S3、以弱阴离子交换纤维素为固定相，依次以水和0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M的NaCl水溶液为洗脱溶剂，对所述酶解液进行柱层析，分别收集用不同洗脱溶剂得到的洗脱液；
S4、以盐酸调节所述洗脱液的pH值为中性，浓缩后透析获得分子量≥3500Da的样品，即得到红参HG型果胶。
对于上述制备方法制得的红参HG型果胶，本发明实施例还提供一种红参HG型果胶的结构表征方法，具体包括：
用HPSEC-MALLS-RID分析红参HG型果胶的分子量分布；将红参HG型果胶经完全水解、衍生化制成衍生化单糖，用UHPLC-UV对所述衍生化单糖进行检测；将所述红参HG型果胶制成甲基化衍生物，用GC-MS进行检测；利用IR、NMR对所述红参HG型果胶进行分析；结合HPSEC-MALLS-RID、UHPLC-UV、GC-MS、IR和NMR的分析结果，得到红参HG型果胶的结构表征结果。
以下通过具体实施例来对本发明的方案进行说明。
以下实施例中所采用的试剂：
1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(二亚胺)，咪唑，二甲基亚砜(DMSO)，硼氘化钠(NaBD4)，二氯甲烷，三氟乙酸(TFA)，氨水，冰乙酸，氢氧化钠，乙酸酐均为市售分析纯。甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷、正丁醇、无水乙醇，购自天津康科德科技有限公司；醋酸铵(AA)购自美国Fisher公司；甲酸铵购自上海阿拉丁生化科技有限公司；三氟乙酸(TFA)购自上海麦克林生化科技有限公司；超纯水和纯水由Milli-Q纯化水系统(美国Millipore公司)制得；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)购自天津津科生物科技有限责任公司；八种单糖对照品-甘露糖(D-Mannose，Man)、鼠李糖(L-Rhamnose，Rha)、葡萄糖(D-Glucose，Glc)、半乳糖(D-Glactose，Gal)、木糖(D-Xylose，Xyl)、阿拉伯糖(D/L-Arabinose，Ara)、葡萄糖醛酸(D-Glucuronic acid，GlcA)、半乳糖醛酸(D-Galacturonicacid monohydrate，GalA)、碘、碘化钾、α-淀粉酶(35U/mg，E.C.：3.2.1.1.)购自上海迈瑞尔化学技术公司；岩藻糖(Fuc，L-Fucose)购自上海诗丹德生物技术有限公司。
以下实施例中所采用的其他试剂和药品如无特殊说明，均为从商业途径获得的实验室常用试剂和药品。
以下实施例中所采用的主要仪器设备：
3500Da透析袋：美国联合碳化(Viskase)；高效凝胶排阻色谱-多角度激光光散射检测器-示差折光检测器(high-performance size exclusion chromatography-multiangle laser light scattering-refractive index detector，HPSEC-MALLS-RID)：包括LC-20AD HPSEC系统，配备RID-20A检测器(日本岛津公司)和DAWN 8HELEOS MALLS检测器(美国Wyatt技术公司)；Agilent 1290超高效液相色谱仪：美国Agilent公司；气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，Agilent 7890A-5977B)；Bruker Avance III-600核磁共振波谱仪(瑞士布鲁克公司)；Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪(Thermo Scientific公司)。
实施例1
本实施例提供了一种红参HG型果胶的制备方法。
1、非淀粉类多糖的制备
将红参药材进行打碎成粗颗粒，然后用粉碎机进一步进行粉碎，过60目筛，取4kg粉末加入10倍量水后置于70℃水浴的超声提取机中，在40kHz(400W)超声提取1h，提取液冷却至室温后，使用离心机以4000rpm转速离心20min后，收集上清液并加入4倍量(v/v)无水乙醇(慢加快搅)至样品中醇含量为80％(v/v)，醇沉后的样品静置过夜。取醇沉约24h后的样品使用离心机以4000rpm转速离心5min后，收集沉淀并于60℃烘箱中进行干燥，干燥粉末加入30倍量水搅拌至完全溶解后加入Sevage试剂为5：1(v/v)，充分搅拌、震荡约1h后，使用离心机以4000rpm转速离心10min后，收集上清液(弃去下层沉淀)，并使用截留分子量为3500Da的透析袋透析三天，每隔8h换水一次，取透析后大于3500Da的截留液进行冷冻干燥，得红参总多糖。
取红参总多糖粉末5g，加入纯水500mL，充分搅拌使其完全溶解后，于搅拌状态下加入α-淀粉酶300mg(终浓度约21U/mL)，溶液置于37℃水浴条件下搅拌酶解16h。酶解反应结束后，使用KI-I2溶液检测，溶液颜色无变化，将酶解液100℃沸水浴30min，并收集酶解液14000rpm离心10min，所获得的上清液准备用于分离。
2、酸性多糖的制备
2.1填料预处理：
取DE-52(保存于20％v/v乙醇)加纯水充分淘洗至无醇味，将洗好的填料转移至DE-52柱
中，以纯水继续进行洗脱，冲洗10BV后，更换为0.5M的氢氧化钠溶液冲洗2BV将填料交换为OH-型，后继续使用纯水冲洗直至洗脱液的pH值约为7后，开始上样；
2.2分离和纯化：
将样品缓慢倒入填充好的玻璃开口柱中，待上次样品全部进入柱床后充分吸附2h后，开始分别使用纯H2O/0.05M/0.1M/0.2M/0.3M/0.4M/0.5M，每个浓度收集5BV，分别收集。洗脱液加入HCl调节pH值为中性、浓缩后使用3500Da透析袋进行透析、冻干，制备得到酸性多糖样品，样品制备流程如图1所示。
实施例2
本实施例提供了一种红参HG型果胶的结构表征方法。将实施例1中以0.2M的NaCl水溶液为洗脱溶剂、第三次以树脂床体积洗脱所得洗脱液制得的样品(即图1中虚线框标出的样品。以下采用代称RG0203)作为本实施例结构表征的供试品。
1、结构表征
1.1基于HPSEC-MALLS-RID的分子量标定
样品溶液的配制：称取实施例1制得的RG0203约5mg，加水配制成5mg/mL，14000rpm离心10min后并使用0.22μm滤膜过滤后，作为供试品溶液；
采用LC-20AD HPSEC系统，配置RID-20A检测器和DAWN 8HELEOS MALLS检测器对供试品溶液中的红参HG型果胶进行数据采集和分析，色谱条件：色谱柱为TSK G4000 PWXL，流动相为150mmol/L的甲酸铵溶液，柱温箱温度设置为30℃，流速为0.6mL/min，进样体积为30μL，示差折光检测器温度为40℃，MALLS中的参数设置检测波长：660nm；激光角度范围：8个，23°-155°；折光指数增量(dn/dc)：0.1380mL/g；将供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。ASTRA软件(Version 6.1.1.17,Wyatt Technology Corp.)控制数据采集并用于数据分析。在进行LS 5(90°)基线校正后，测定供试品溶液中的RG0203的分子量和相关参数。RG0203的HPSEC-MALLS-RID色谱图如图2所示，RG0203的HPSEC色谱图如图3所示。图2给出了MALLS的LS与dRI的检测信息，同时液相系统自带的RI检测器提供了样品的示差折光信号。通过软件处理可以获得纯化的RG0203样品的重均分子量(Mw)：1.664×104Da，数均分子量(Mn)：1.066×104Da，以及分散系数(PDI，即Mw/Mn)：1.561，证明RG0203样品为均一的多糖成分。
1.2基于UHPLC-UV的单糖组成分析
水解单糖的制备：精密称取实施例1制得的RG0203粉末1.0mg，溶解在500μL去离子水中，配制成2mg/mL的果胶溶液，并使用离心机以14000rpm离心10min。取200μL离心后的溶液并加入200μL TFA(4.0M，使TFA终浓度为2.0M)并在110℃条件下加热水解2h。于60℃水浴条件下除去TFA的残留物(水浴过程中通过加入甲醇的方式提高提高蒸干速度)。
PMP衍生：干燥后的样品加入200μL超纯水，充分涡旋使其完全溶解，在溶液中加入50μL 0.6M氢氧化钠溶液和100μL 0.5M PMP甲醇溶液。将反应溶液混合，并置于70℃条件下加热反应30min。反应结束后通过加入100μL的0.3M HCl溶液对反应液进行中和。进而使用400μL三氯甲烷萃取未反应的PMP。混合10s后，小心去除底部的三氯甲烷层。重复上述操作3次，取上层水相稀释10倍后用即为供试品溶液(即RG0203 PMP衍生物)，准备用于单糖组成分析。
单糖对照品按上述PMP衍生的方法直接衍生化。
UHPLC-UV液相-紫外检测参数如下：
实验设备采用Agilent 1290超高效液相色谱仪；流动相采用50mM AA-水(A)/ACN(B)，样品盘温度为10℃；色谱柱温度设置为28℃；流速为0.3mL/min；进样量：2μL；色谱柱：Waters CORTECS UPLC C18+(2.1×100mm,1.6μm)；洗脱梯度条件如下：0→7.0min：15-17％(B)；7.0→15.0min：17％(B)；15.0→16.0min：17-95％(B)；16.0→19.0min：95％(B)；19.0→20.0min：95-15％(B)；20.0→25.0min：15％(B)。
结果如图4所示：组成RG0203的单糖包括Rha(3.6％)、GalA(67.5％)、Glc(4.2％)、Gal(6.7％)、Ara(10.5％)以及极少量的Fuc(1.6％)，参照现有资料中关于HG(GalA＞60％，聚合度约为70-100)的定义，确定RG0203为一种HG型果胶。除主要的GalA外，其它杂多糖的含量和比例亦满足RG0203为HG型果胶的性质。
用上述方法对实施例1中制备得到的非淀粉类多糖和酸性多糖RG0203样品进行单糖组成分析，其中非淀粉类多糖的中的单糖组成仍以Glc为主(约占80％)，而经过DE-52离子交换柱纯化后的酸性多糖RG0203中的单糖组成以GalA为主(约占60％)，进一步说明了RG0203样品的酸性多糖性质。
1.3甲基化衍生物的制备和GC-MS分析
1.3.1羧基还原：
精密称取RG0203 10mg，加入1mL水将样品完全溶解，进而加入衍生化试剂碳二亚胺(1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐)1mL(100mg/mL)，室温搅拌反应2h。
于反应液中加入1mL咪唑水溶液(2.0M)后，充分混合并平均分为两份，于两份溶液中分别加入1mL的30mg/mL的NaBH4和NaBD4，继续搅拌还原反应3h；
3h后，加入100μL冰醋酸淬灭反应，并转移至3500Da透析袋中加水透析48h，透析结束后进行冻干，准备进行甲基化反应。
1.3.2甲基化反应：
向1.3.1得到的冻干样品中加入500μL DMSO搅拌至样品完全溶解。于溶液中加入1mg NaOH粉末，孵育30min后加入50μL碘甲烷反应1h。加入1mL水终止反应并加入2mL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。用水对二氯甲烷相重复萃取3次。吸取下层二氯甲烷相并蒸干，获得甲基化产物。
1.3.3酸水解：
于甲基化产物中加入100μL 2.0M TFA充分搅拌溶解，并于121℃水解反应90min。并于30℃条件下进行蒸干，获得酸水解产物。
1.3.4还原：
向酸水解产物中加入50μL 2.0M的氨水溶液、加入50μL 1.0M NaBD4，混匀，室温条件下还原反应2.5h，得还原产物。于反应液中加入20μL冰乙酸终止反应，氮气吹干，吹干后继续加入250μL甲醇洗两次，氮气吹干，得到还原产物。
1.3.5乙酰化：
还原后的样品中加入乙酸酐250μL，涡旋混匀，100℃反应2.5h。反应液中加入1mL水静置10min以终止反应。于反应液中加入500μL二氯甲烷，涡旋混匀，离心，弃水相。用水对二氯甲烷相重复萃取3次。吸取下层二氯甲烷相，即为红参HG型果胶的甲基化衍生物。即为供试品，上机检测。
1.3.6数据采集：
色谱参数：色谱系统为Agilent气相色谱系统(Agilent 7890A)，色谱柱为Trajan公司的BPX70 GC columns(0.22mm×25m,0.25μm)，进样口温度为240℃，进样量为1μL，分流比10：1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140℃，保持2.0min，以3℃/min程序升温至230℃，保持3.0min。
质谱参数：质谱系统采用的是美国Agilent公司的四极杆质谱检测系统(Agilent5977B)，配有电子轰击离子源(EI)和Mass Hunter工作站。采用电子轰击离子源(EI)，分析物在全扫描(SCAN)模式下进行检测，质量扫描范围(m/z)：30～600。
通过与CCRC标准光谱数据库进行对比可以判断糖基化位点，通过GC的峰面积比可以判断含有不同链接方式的单糖组成的比例，但由于该过程可能存在一定误差，因此单糖组成结果的比例要与“1.2基于UHPLC-UV的单糖组成分析”进行综合分析。
甲基化衍生产物的GC-MS结果如图5和表1所示，通过与CCRC标准库进行对比可以判断出各种单糖的糖苷键链接位点，结果显示RG0203含有的主要以：α(1→4)糖苷键的GalA构成的主链，其中夹杂有3位和6位发生其它单糖取代的情况；含量约为10％的Gal夹杂于GalA的侧链上；而端基糖则以Rha、Ara、Glc、Gal以及少量的GalA为主。由此可以确定，RG0203中含有多种类型糖苷键以及多种单糖组成。根据GC的计算各单糖含量比分别为Rha(1.85％)、GalA(72.07％)、Glc(4.65％)、Gal(12.35％)、Ara(8.19％)以及极少量的GlcA(0.89％)。将该结果与“1.2基于UHPLC-UV的单糖组成分析”的结果对比可发现，两种结果中均以GalA的含量最高，均大于60％(分别是67.5％和72.07％)，说明RG0203为一种HG型果胶。其中PMP柱前衍生化法未检测到GlcA(GC-MS法证明其含量极低)，而GC-MS法未检测到Fuc(PMP柱前衍生化法证明其含量极低)。
表1RG0203的甲基化反应产物的信号归属
*相对摩尔量＝峰面积/分子量；
*相对摩尔比(％)＝相对摩尔量/各组分相对摩尔量总和；
1.4IR分析
按照2020版《中国药典》第四部通则部分采用KBr固体压片法：取约2mg经40℃真空干燥后的RG0203样品，使用Nicolet iS50傅里叶变换红外光谱仪进行红外信号的采集。具体参数为：分辨率-4.000；采样增益-1.0；动镜速度-0.4747；光阑-100.00；检测器-DTGSATR；分束器-KBr；光源-红外光源；样品扫描次数和背景扫描次数均为16次，记录色谱图。如图6所示。
根据红外谱图和与文献进行对比可知：RG0203存在特征吸收峰，3370cm-1附近均存在很强的糖环上羟基伸缩振动吸收峰，在2932cm-1附近存在较弱的糖环上亚甲基的C-H伸缩振动吸收峰，在1739cm-1附近存在GalA的羧基发生甲酯化C＝O的伸缩振动吸收峰，在1610cm-1附近存在GalA中-COOH的C＝O非对称伸缩振动，在1409cm-1附近主要存在-COOH的C-O伸缩振动，1235cm-1附近存在O-H的变角振动，以及1000-1200cm-1糖环上C-O-C伸缩振动，815-835cm-1处附近(830cm-1)为吡喃糖的α-端基C-H变角振动吸收峰，920cm-1处存在吡喃糖的β-端基C-H变角振动吸收峰。红外信号归属如表2所示。
表2RG0203的红外信号归属
根据红外光谱中1739cm-1和1610cm-1处的震动吸收峰面积来计算GalA的甲酯化度(DM，甲酯化的羧基数目/羧基基团总数×100％)，使用Origin软件进行峰面积拟合并计算峰面积，进而计算出DM＝A(1739cm-1)/[A(1739cm-1)+A(1610cm-1)]×100％，经计算，RG0203甲酯化度为33.03％，且R2为0.9917，表明拟合度良好。
1.5NMR分析
取RG0203约10mg，加D2O(D原子含量为99.9％，含0.05％3(3-甲基硅烷)磷酸酯)溶解至约20mg/mL，14000rpm离心10min后，转移至核磁管中，使用Bruker Avance III-600核磁共振波谱仪采集样品的1H、13C、DEPT135以及二维相关谱图(1H-1H COSY，1H-13C HSQC，1H-13C HMBC)。检测结果采用MestReNova科学软件进行处理。
RG0203的Mw为1.664×104Da，其分子量相对较大，导致NMR中的C、H信号裂分不清晰、信号强度差等情况，导致数据归属比较困难，综合IR、GC-MS实验结果对RG0203样品中的特征C信号进行了归属，结果如下：在RG0203的13C-NMR谱图中，177.948ppm处为未被酯化的α(1→4)-GalA的C-6位置的吸收峰，173.713ppm处为甲酯化的α(1→4)-GalA的C-6位置的吸收峰；同时，在化学位移为55.794ppm处为甲酯化GalA的C-6位置连接的OCH3吸收峰；在化学位移为23.122ppm处为GalA的C-2或者C-3处OAc的CH3信号；在化学位移为19.702ppm处为Rha的C-6位置CH3吸收峰；其余含量较低的糖信号归属见表3，RG0203样品的1H和13C色谱图见图7和图8。
表3RG0203的信号归属(δppm)
综合多种分析技术对RG0203的结构进行表征，确定了该红参HG型果胶的结构是具有：α(1→4)糖苷键的GalA构成的主链，其中夹杂有3位和6位发生其它单糖取代的情况；含量约为10％的Gal夹杂于GalA的侧链上；而端基糖则以Rha、Ara、Glc、Gal以及少量的GalA为主。同时主链上的GalA存在羧基发生甲酯化的情况，2位和3位存在乙酰化的现象。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种红参HG型果胶，其特征在于，所述红参HG型果胶的重均分子量为1.664×104Da，数均分子量为1.066×104Da，单糖及对应的摩尔百分比为鼠李糖3.6%、半乳糖醛酸67.5% 、葡萄糖4.2%、半乳糖6.7%、阿拉伯糖10.5%以及岩藻糖1.6%。
2.一种权利要求1所述的红参HG型果胶的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1、以水提醇沉的方法提取分子量≥3500 Da的红参总多糖；
S2、将所述红参总多糖用淀粉酶酶解，得到酶解液；
S3、以弱阴离子交换纤维素为固定相，依次以水和0.05 M、0.1 M、0.2 M、0.3 M、0.4 M、0.5 M的NaCl水溶液为洗脱溶剂，对所述酶解液进行柱层析，分别收集用不同洗脱溶剂得到的洗脱液；所述弱阴离子交换纤维素为DEAE纤维素DE-52；
S4、以盐酸调节所述洗脱液的pH值为中性，浓缩后透析获得分子量≥3500 Da的样品，得到所述红参HG型果胶。
3.根据权利要求2所述的红参HG型果胶的制备方法，其特征在于，S1中以水提醇沉的方法提取红参总多糖的操作为：将红参以水提取，得水提液；向所述水提液中加入乙醇至乙醇含量为75%~85% v/v，沉淀后将所得沉淀干燥，以水复溶后加入Sevage试剂，混合后离心，将上清液用截留分子量为3500 Da的透析袋透析，将截留液干燥，得红参总多糖。
4.根据权利要求2所述的红参HG型果胶的制备方法，其特征在于，依次以水和0.05 M、0.1 M、0.2 M的NaCl水溶液为洗脱溶剂，其中以水和0.05 M、0.1 M的NaCl水溶液洗脱时，洗脱溶剂的体积为5倍树脂床体积，然后以0.2 M的NaCl水溶液、以3倍树脂床体积洗脱，收集以最后一倍树脂床体积洗脱所得洗脱液。
5.权利要求1所述的红参HG型果胶的结构表征方法，其特征在于，用HPSEC-MALLS-RID分析红参HG型果胶的分子量分布；将所述红参HG型果胶经完全水解、衍生化制成衍生化单糖，用UHPLC-UV对所述衍生化单糖进行检测；将所述红参HG型果胶制成甲基化衍生物，用GC-MS进行检测；利用IR、NMR对所述红参HG型果胶进行分析；结合HPSEC-MALLS-RID、UHPLC-UV、GC-MS、IR和NMR的分析结果，得到红参HG型果胶的结构表征结果；
所述水解的方法为：将所述红参HG型果胶溶于水，加入三氟乙酸水溶液，加热水解；
所述衍生的方法为：将水解后的产物溶于水中，加入氢氧化钠溶液和1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液，加热反应后加入盐酸溶液中和，通过萃取去除1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮；
所述UHPLC-UV液相-紫外中的色谱条件为：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；
流动相A为50 mM醋酸铵水溶液，流动相B为乙腈，进行线性梯度洗脱，所述线性梯度洗脱的程序如下：
流速：0.28~0.32 mL/min；
柱温：25~30 ℃。
6.根据权利要求5所述的红参HG型果胶的结构表征方法，其特征在于，所述HPSEC-MALLS-RID中的HPSEC色谱条件为：色谱柱为TSK G4000 PWXL，流动相为150 mmol/L的甲酸铵溶液，柱温箱温度为30 ℃，流速为0.6 mL/min，进样体积为30 µL，示差折光检测器温度为40 ℃；和/或
所述HPSEC-MALLS-RID中MALLS中的参数设置为：检测波长：650~670 nm；激光角度范围：6~10个，15°~170°；折光指数增量（dn/dc）：0.1380 mL/g。
7.根据权利要求5所述的红参HG型果胶的结构表征方法，其特征在于，将所述红参HG型果胶制成甲基化衍生物的操作包括：将所述红参HG型果胶溶于水中，加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐水溶液进行衍生化，反应结束后，加入咪唑水溶液充分混合后，加入硼氢化钠或硼氘化钠进行还原反应，反应结束后淬灭反应，用截留分子量为3500 Da的透析袋透析，将截留液干燥，进行甲基化、酸水解、还原和乙酰化。
8.根据权利要求7所述的红参HG型果胶的结构表征方法，其特征在于，所述GC-MS的色谱条件为：色谱柱为BPX70气相色谱柱，规格为0.22 mm × 25 m，0.25 μm，进样口温度为240 ℃，进样量为1 μL，分流比10:1，载气为高纯氦气；柱温箱的初始温度为140 ℃，保持2.0 min，以3 ℃/min程序升温至230 ℃，保持3 min；和/或
所述GC-MS的质谱条件为：离子源为电子轰击离子源，在全扫描模式下进行检测，质量扫描范围m/z 30~600。
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