CN117512032B - 低分子量hg型果胶的制备方法及其构象表征 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种低分子量HG型果胶的制备方法及其构象表征，包括以下步骤：步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶，所得果胶通过精细结构解析，利用多糖建模软件构建三维结构模型，表征构象。本发明利用水热法联合分级醇沉法提取果胶粗多糖，可在不破坏果胶分子结构的基础上获得分子量较小的果胶粗多糖，继而通过两步定向酶解有效破坏果胶分子结构，获得高纯度且均一的HG型果胶。

Description

低分子量HG型果胶的制备方法及其构象表征
技术领域
本发明涉及天然产物领域。更具体地说，本发明涉及一种低分子量HG型果胶的制备方法及其构象表征。
背景技术
植物源酸性多糖是目前应用和来源最广、制备和结构鉴定最为复杂的多糖，在近些年的食品和药用科学研究中的地位凸显。果胶是植物细胞壁的主要成分之一，分布广泛，被认为是自然界中结构最为复杂的酸性杂多糖，已被世界卫生组织食品添加剂联合委员会批准的一种食品添加剂，植物细胞壁富含果胶，尤其是同型半乳糖醛酸聚糖（HG）型果胶和鼠李半乳糖醛酸聚糖-I（RG-I）型果胶。HG型果胶主要以高含量的半乳糖醛酸构成，而RG-I型果胶是具有严格交替的鼠李糖和半乳糖醛酸序列的果胶片段。此外，还有少量的鼠李半乳糖醛酸聚糖-II（RG-II）型果胶，且主链侧链结构极为复杂，因此目前的研究以HG型果胶和RG-I型果胶为主。
近年来，学者们通过化学法、酶解法等从果蔬原料果胶中提取果胶寡糖，使其产生分子量较低且富含RG的结构片段，从而提高果胶的生物活性和生物利用率，关于HG型果胶的制备方法以淀粉酶酶解法为主，所得产物结构不均一，导致其精细结构鉴定较为困难，故亟待提供一种低分子量HG型果胶的制备方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种低分子量HG型果胶的制备方法，其利用水热法联合分级醇沉法提取果胶粗多糖，通过两步定向酶解有效破坏果胶分子结构，获得高纯度且均一的HG型果胶，为果胶杂多糖的结构鉴定及构象表征提供参考。
为了实现本发明的这些目的和其它优点，提供了一种低分子量HG型果胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶。
优选的是，果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8-16 h，然后粉碎并过600-800 µm筛，再置于压力为0.37 mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
优选的，采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至2-4，再升温至40-80℃并保温2-6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30-50。
优选的，分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30-45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为50-60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为65-80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析36-72h，得到果胶粗多糖。
优选的，采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入果胶粗多糖中酶解，酶解4-20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶四种酶的用量均为100-300 U/mL果胶粗多糖。
优选的，采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解在0.02-0.5 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，并向体系中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1-2 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75-85%的液体，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶两种酶的用量均为0.2-1.0 U/mL一级酶解多糖。
优选的，一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000-10000 r·min-1转速离心10-20 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
优选的，二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力400-600 Mpa，温度40-65℃。
本发明另外还提供了一种低分子量HG型果胶的构象表征，采用分光光度计测定果胶半乳糖醛酸含量及果胶酯化羧基的含量，分析低分子量HG型果胶的酯化度；使用高效体积排阻色谱联合十八角度激光散射仪，以氯化钠为洗脱液测定低分子量HG型果胶的分子量及其分布；采用高效阴离子色谱仪，测定低分子量HG型果胶的中性糖组成和含量；采用傅立叶变换红外光谱仪分析低分子量HG型果胶中官能团类型；采用小角度X射线散射技术分析低分子量HG型果胶的空间构象参数；采用高场核磁共振仪分析的糖链化学结构；表征低分子量HG型果胶的空间构象。
优选的是，低分子量HG型果胶构象表征的方法包括以下步骤：
A1、计算低分子量HG型果胶的酯化度、分子量、中性糖含量、分子链线性度及支链结构域的贡献率、多分散指数、分子链的链长和链宽及空间构象参数，空间构象参数包括平均回旋半径、流体力学半径、非均向性构型、构象类型指数、持续长度、特征比；
A2、将步骤A1中的参数输入建模软件POLYS，结合低分子量HG型果胶糖链化学结构，并利用存储在 MONOBANK 数据库中和GLYCLINK 数据库中的单糖和糖苷键的结构信息，构建低分子量HG型果胶的三维结构模型，表征低分子量HG型果胶的空间构象。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明利用水热法联合分级醇沉法提取果胶粗多糖，可在不破坏果胶分子结构的基础上获得分子量较小的果胶粗多糖；本发明通过一级定向酶解，可实现精准分离果胶中的HG组分，将其进行二级定向酶解，可进一步降低HG组分的分子量；本发明将一级酶解后的HG组分进行超滤分级，截留分子量控制在10 kDa，可获得均一性良好的HG型果胶；以适用于其他富含果胶的果蔬副产物为原料，通过本发明的方法制备的低分子量HG型果胶经多元分析检测手段，可获得精细结构信息和空间构象模型。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的制备流程图；
图2为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的分子量分布图；
图3为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的离子色谱图；
图4为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的傅里叶红外谱图；
图5为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的小角X射线散射图；
图6为本发明其中一个技术方案所述的HG型果胶的氢谱图，其中，一个对应于实施例1，另一个对应于对比例2；
图7为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的AFM图，对应于实施例1所制备的低分子量HG型果胶；
图8为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的AFM图，对应于对比例2所制备的HG型果胶；
图9为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的3D分子结构模型，对应于实施例1所制备的低分子量HG型果胶；
图10为本发明其中一个技术方案所述的低分子量HG型果胶的3D分子结构模型，对应于对比例2所制备的HG型果胶；
图11为本发明其中一个技术方案所述的HG型果胶的制备过程中超滤分级操作图；
图12为本发明其中一个技术方案所述的HG型果胶的摩尔质量分布图，对应于实施例1，对比例1和对比例3。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
以下通过具体实施例来对本发明的方案进行说明。
以下实施例中所采用的试剂：
鼠李半乳糖醛酸水解酶（R-Gase）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afase）、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶（endo-A）、β-D-半乳糖苷酶（β-Gase）、β-(1→4)-D-半乳聚糖内切酶（endo-G）购于爱尔兰Megazyme公司。内切聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）、果胶甲基酯酶（PME）及糖标准品：D-半乳糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖购于Sigma-Aldrich（中国）公司。盐酸、乙酸钠、无水乙醇、三氟乙酸等购于国药集团化学试剂有限公司。3500Da透析袋购于美国联合碳化（Viskase）。
以上实施例中所采用的其他试剂和药品如无特殊说明，均为从商业途径获得的实验室常用试剂和药品。
以下实施例中所采用的主要仪器设备：
ULT1386-3-V41 超低温冰箱（赛默飞科技有限公司）、ALPHA1-4Lplus 真空冷冻干燥设备（德国CHRIST公司）、JYL-C010研磨机（九阳股份有限公司）、BK-B26恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、RCTbasic 加热型磁力搅拌（德国IKA公司）、3K15高速冷冻离心机（德国Sigma公司）、ALP CL-40L高压灭菌锅（广东东南科创科技有限公司）、高性能尺寸排阻色谱（美国Wyatt技术公司）、ICS-3000高效阴离子色谱（美国赛默飞世尔公司）、ALPCL-40LUV-1800紫外可见光分光光度计（Shimadzu公司）、TENSOR-27傅里叶变换红外光谱（德国Bruker公司）、SAXSpoint 2.0小角X射线散射仪（AntonPaar商贸有限公司）、Bruker AvanceIII-500核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）、NX-10 原子力显微镜，（韩国Park Systems仪思通科技）。
实施例1、实施例3-4的制备流程如图1所示，实施例1、实施例3-4的HG型果胶的制备过程中超滤分级操作图如图11所示；
<实施例1>
低分子量HG型果胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶。
果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8 h，然后粉碎并过800 µm筛，再置于压力为0.37mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至2，再升温至60℃并保温4 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30。
分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析72 h，得到果胶粗多糖。
采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为2 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解5 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用Sephadex G-25凝胶色谱柱（洗脱剂为0.25 M氯化钠溶液）和Q-Sepharose阴离子交换柱（洗脱剂为4 M氢氧化钠溶液）纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为1U/mL。
采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.2 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为2 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.8 U/mL，果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.4 U/mL。
一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000 r·min-1转速离心10 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力500 Mpa，温度55℃。
<实施例2>
低分子量HG型果胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶。
果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8 h，然后粉碎并过600 µm筛，再置于压力为0.37mbar、温度为25℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至2，再升温至40℃并保温2 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30。
分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为50%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为65%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析3 h，得到果胶粗多糖。
采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为1 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解4 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为0.5 U/mL。
采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.02 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为1 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.2 U/mL。
一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000 r·min-1转速离心10 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力400 Mpa，温度40℃。
<实施例3>
低分子量HG型果胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶。
果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻12 h，然后粉碎并过700 µm筛，再置于压力为0.37mbar、温度为30℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至3，再升温至60℃并保温4 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:40。
分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为38%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为55%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为72%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析54 h，得到果胶粗多糖。
采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为2 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解12 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为1 U/mL。
采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.25 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为2 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1.5 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去80%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.6 U/mL。
一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以9000 r·min-1转速离心15 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力500 Mpa，温度53℃。
<实施例4>
低分子量HG型果胶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶。
果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻16 h，然后粉碎并过800 µm筛，再置于压力为0.37mbar、温度为35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至4，再升温至80℃并保温6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1: 50。
分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析72 h，得到果胶粗多糖。
采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为2.5 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为1.5 U/mL。
采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.5 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为2.5 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解2 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去85%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为1.0 U/mL。
一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以10000 r·min-1转速离心20 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力600 Mpa，温度65℃。
<对比例1>
采用酸热提取从果蔬加工副产物中提取HG型果胶，不同的是：在醇沉时使用75%乙醇沉淀获得的果胶粗多糖，其他步骤同实施例1。
<对比例2>
采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶，不同的是：将步骤一获得的果胶粗多糖直接进行二级定向酶解，其他步骤同实施例1。
<对比例3>
采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶，不同的是：将获得的一级酶解多糖直接进行二级定向酶解，其他步骤同实施例1。
<对比例4>
采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶，不同的是：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，回收超滤渗余物，即得到HG型果胶，其他步骤同实施例1。
<结构表征方法>
1、半乳糖醛酸的测定
准确称取10.0 mg果胶样品，依次加入8.0 mL浓硫酸和4.0 mL蒸馏水，水解1 h。吸取0.6 mL水解液和0.6 mL蒸馏水，转到放置于冰浴的具塞玻璃管中，加入3.6 mL溶于浓硫酸（98%）的四硼酸钠溶液。将具塞玻璃管在100℃油浴中加热5 min，之后流水冲洗玻璃管迅速降温。向体系中加入60.0 μL对苯基苯酚溶液（0.1667 g的3-苯基苯酚溶于0.5%NaOH中，定容至100 mL，避光保存）；空白样品为0.6 mL蒸馏水中加入60.0 μl 0.5%NaOH溶液，在漩涡振荡器上充分混合1 min显色。利用UV-1800紫外分光光度计于520 nm处测定D-半乳糖醛酸标品、空白样品和果胶样品的吸光值。采用浓度梯度为40～240 mg/L半乳糖醛酸标品制作标准曲线，测定果胶样品的半乳糖醛酸含量。
2、酯化度的测定
准确称取20.0 mg果胶样品并加入8 mL蒸馏水，超声10 min，然后加入3.2 mLNaOH（2 mmol/L），放入20℃恒温震荡培养箱中保温1 h。加入3.2 mL HCl（2 mmol/L），在25℃下中和15 min，加入磷酸缓冲溶液定容至25 mL。吸取1.0 mL水解产物，加入1.0 mL乙醇氧化酶（1.0 U/mL），在25 ℃下酶解15 min，然后加入2.0 mL戊二酮溶液，在58℃下孵育15min。冷却并涡旋混合后，利用UV-1800紫外分光光度计于412 nm处测定标品和果胶样品的吸光值。量取633.38 µl甲醇用0.0975 mmol/L磷酸缓冲溶液定容到50 mL制备储备溶液，采用浓度梯度为1～20 μg/mL甲醇标准溶液制作标准曲线。测定果胶样品的甲酯化度，甲酯化度表示为甲醇与半乳糖醛酸物质的量之比。
3、中性糖的测定
准确称量果胶样品10.0 mg，加入4.0 mL 2.0 mmol/L 三氟乙酸，在110 ℃水解1.5 h，使用氮吹干燥样品，用蒸馏水定容到10 mL。之后过0.45 μm MF-Millipore®滤膜，采用高效阴离子交换色谱结合脉冲安培检测（HPAEC-PAD）对中性糖定量分析。色谱条件如下：用100 mmol/L NaOH平衡系统5 min，随后用4.0 mmol/L NaOH平衡5 min，采用CarboPacPA20柱（Dionex）通过4.0 mmol/L NaOH洗脱液进行分离洗脱，设置温度30 ℃，流速0.5 mL，进样量10.0 μL。采用浓度梯度为0.01～5.0 mg/L的中性糖混标（D-糖醛酸、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖）制作标准曲线，测定果胶的中性糖组成及含量。
4、分子量的测定
采用高性能尺寸排阻色谱（HPSEC）结合多角度激光散射和示差折射光检测器测定果胶样品的分子量。准确称量5.0 mg果胶样品，溶解于0.25 mmol/L NaCl溶液（流动相）中，过0.22 μm MF-Millipore®滤膜，通过定量环手动进样200 μL，流速设置为0.5 mL/min。使用ASTRA 5.3.4软件（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA, USA）计算和分析果胶样品的重均分子质量（Mw）、数均分子量（Mn）和多分散性指数（Mw/Mn），设置折射率增量（dn/dc）为0.135mL/g。
5、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）
使用光谱级溴化钾粉末、果胶样品按99:1的比例混合研磨后成粉，通过压片机进行压片。以溴化钾粉末压片进行光谱扫描作为背景空白。利用傅里叶变换红外光谱，在4000～400 cm-1范围内，以4 cm-1的分辨率测定果胶多糖的透射率，明确果胶官能团结构。
6、小角X射线散射（Small-angle X-ray scattering, SAXS）
将果胶样品按1%（w/v）溶解在蒸馏水中，在连续搅拌下放置过夜确保完全溶解。随后，在3500 r/min下进行离心15 min以去除任何不溶性物质。吸取100 μL上清液密封在1.5mm孔径的石英玻璃毛细管中，排空气泡，以水作为空白样品作为背景散射，在25℃下进行SAXS测量。设置样本到检测器的距离为540.74 mm，扫描时间为900 s。使用Anton PaarSaxsan软件进行数据分析。平均回旋半径（Rg）和流体力学半径（Rc）分别表示聚合物中心到其质心的平均距离和果胶的弯曲程度，分别按照公式1-1和1-2计算：
（1-1）
（1-2）
式中：I(0)是0度角的强度；动量传递定义为q = 4πsin(θ)/ λ，其中θ为散射角，λ为X射线束波长（λ = 0.154 nm）。
计算非均向性构型ρ（Rg/ Rc）。其中，ρ指数＜ 0.775、1.5～1.8和＞2分别表示果胶构象为紧密的球状、柔软的无规则线状和伸展形态；利用HPSEC-MALLS-RI-VS系统分析果胶的多分散指数（Mw/Mn）和特性粘度（η）；运用 Mark-Houwink 方程（[η]=kMα）计算构象类型指数α，并结合 Kratky-Porod 的蠕虫状链模型计算果胶的持续长度（Lp）和特征比。
7、原子力扫描电镜（AFM）
将果胶样品溶解于去离子水中，在25 °C下搅拌，制备10 μg/mL的果胶溶液。用移液枪吸取10 μL果胶溶液滴在云母片上，均匀铺展，使之自然干燥。采用Si3N4探针，设置弹簧力常数为0.2 N/m，共振频率为10 kHz，以半自动高速敲击模式进行扫描，并由配备硅悬臂的XEI-70 AFM进行分析。扫描频率设定为2.0 Hz，扫描面积为2.5 × 2.5 μm，扫描分辨率为256 × 256点。采用Nanoscope Analysis 软件进行图片处理，测量果胶分子链的链长与链度。
8、核磁共振氢谱（1H NMR）
将果胶样品（10 mg/mL）溶解在含有0.1 μL丙酮的氘代水（99.96%）中，并将600.0μL转移到5 mm NMR管中。经5 min的温度平衡后，使用水信号预饱和的标准脉冲序列在55°C下测量1H NMR光谱。在脉冲角为90°的1024次扫描后，将光谱数据收集到16.4 K的数据点中, 混合时间为10 ms，扫描宽度为10504.2 Hz，采集时间为3.0 s，弛豫延迟为4.0 s。在Topspin软件（3.2版，Bruker）中进行自动相位、基线校正和异头峰识别，并使用Mestrenova（10.0.1版，MestreLab Research）量化所有峰的面积，测定果胶的糖苷键的类型和糖残基分布。
9、结构建模
整合上述方法测得的果胶结构数据，包括半乳糖醛酸含量、酯化度、中性糖组成及含量、分子量、官能团结构、构象参数、糖苷键的类型和糖残基分布等，通过计算机建模软件POLYS 2.0（丹麦，哥本哈根），并利用存储在MONOBANK和GLYCLINK 数据库中的相关单糖和糖苷键几何结构信息，构建果胶的三维结构模型。
<表征结果>
本申请适用于富含果胶的果蔬原料及其副产物， 本申请以山楂为例，提供了一种HG型山楂果胶的构象表征方法。将山楂采用实施例1、对比例1-4的制备方法所获得的HG型果胶作为本申请构象表征的果胶样品。
经高性能尺寸排阻色谱（HPSEC）结合多角度激光散射和示差折射光检测器分析，实施例1的分子量分布如图2所示，可见唯一的分子量洗脱峰，说明纯度较高；
实施例1、 对比例1、对比例2、对比例3、对比例4所述制备的果胶经分子量的测定和小角X射线散射得到果胶结构参数，结果参数如表1所示：
表1 所制备的果胶结构参数
注：Mw，重均分子量；Mn，数均分子量；Mw/Mn，多分散系数；DE，甲酯化度；Rg，回旋半径；Rc，流体力学半径。
实施例1中制得的HG型果胶的重均分子量（Mw）为8.61×102g/mol，显著低于对比例1（4.38×106g/mol）和对比例2～对比例4（1.80～3.39×104g/mol）。数均分子量（Mn）呈现相同的趋势。多分散系数（Mw/Mn）是表征分子量分布的分散程度，实施例1中制得的HG型果胶的多分散系数为1.203，显著低于Mw/Mn最高值（对比例1，6.181），其次为对比例2（2.218）、对比例3（2.513）、对比例4（1.52）。以上结果实施例1制得的HG型果胶的分子量显著低对比例1、对比例2、对比例3和对比例4，且分子量分布相比其他对比例较为集中。
这是因为对比例1中，不再依次使用分级醇沉法，而只截留75%乙醇沉淀获得的粗多糖，导致其分子量相对比实施例1较高，聚合物分散不均匀，Mw/Mn值较高；对比例2中，因为不采用鼠李半乳糖醛酸水解酶（R-Gase）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-Afase）、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶（endo-A）、β-D-半乳糖苷酶（β-Gase）、β-(1→4)-D-半乳聚糖内切酶（endo-G）复合糖苷酶对果胶协同进行一级定向酶解，导致其相对比实施例1分子量较高，且果胶的支链未被酶解去除，除了HG结构域还有RG结构域分布，导致Mw/Mn值较高；对比例3中，因为不再使用超滤分级对一级定向酶解出产物进行进一步筛选分离，导致其相对比实施例1分子量较高，聚合物分散不均匀，Mw/Mn值较高；对比例4中，因为不再进行内切多聚半乳糖醛酸酶（endo-PG）和果胶甲基酯酶（PME）二级定向酶解对一级定向酶解出产物进行进一步酶解，导致其相对比实施例1分子量较高，相比对比例1～3分子量最低。
其中，实施例1、对比例1、对比例3所制备的果胶的摩尔质量分布如图12所示，由摩尔分子量分布图得出，在洗脱10.5～13.0 min可以看到对比例1和对比例3制得的HG型果胶的洗脱峰，而实施例1中制得的HG型果胶洗脱峰向更长的洗脱时间移动，即表示洗脱出低分子量物质，说明实施例1中制得的HG型果胶中含有较多低分子量的组分。此外，在14.5min左右观察到实施例1制得样品的的洗脱峰，其分子量约为1×104g/mol，且分子量为2×103g/mol的组分占样品的70%以上，表明样品中存在低聚半乳糖醛酸，由于半乳糖醛酸的分子量为194.14 g/mol，所以本发明制得的主要成分HG型果胶的聚合度小于10。
表1还显示，实施例1中制得的HG型果胶的甲酯化度（DE）为69.88%，对比例4制得的样品的DE为84.09%，显著高于实施例1和对比例1、2、3，DE值分别为76.76%、70.18%、79.44%。
实施例1所制备的HG型果胶的傅里叶红外光谱图如图4所示，由图4可以看出在1147、1103和1020 cm−1处均有多糖特征吸收峰，且在1740～1750 cm−1ν（C=O）发现有强吸收的窄峰而1600～1630 cm−1ν（COO-）谱带强度降低，测定HG型果胶的酯化度为75%。
经小角X射线散射（SAXS）测试，如图5所示，结合表1中的构象参数可知，相比于对比例1～4，实施例1中制得的低分子量HG型果胶的较小的平均回旋半径（Rg）为6.01 nm，流体力学半径（Rc）为3.50 nm，表明更紧凑和弯曲的构象。
实施例1、对比例2所制备的HG型果胶的氢谱图如图6所示，实施例1所制备的HG型果胶的AFM图如图7所示，对比例2所制备的HG型果胶的AFM图如图8所示，实施例1所制备的HG型果胶的3D分子结构模型如图9所示，对比例2所制备的HG型果胶的3D分子结构模型如图10所示。对比实施例1、对比例2的氢谱图、AFM图、3D分子结构模型可知，实施例1制得的HG型果胶，半乳糖醛酸含量较高，中性糖含量极低，通过AFM观测的纳米结构表现为规则的线状，3D结构模型呈现长的线性结构，连接复杂的小区域支链结构；而对比例2制得的果胶，未经过糖苷酶RGase、α-Afase、endo-A、β-Gase、endo-G协同定向酶解，RG-I是主要的结构域，且大量中性糖附着在RG-I主链上，2D结构以支链为主，通过AFM观测的纳米结构表现为网络状，3D结构模型呈现较短的线性结构和长链交叉点。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (7)

1.低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、采用酸热提取结合分级醇沉法从果蔬加工副产物中提取果胶粗多糖；
步骤二、将果胶粗多糖先采用复合糖苷酶进行一级定向酶解，得到一级酶解多糖，将一级酶解多糖采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解，经纯化得到低分子量HG型果胶；
采用复合糖苷酶进行一级定向酶解的方法为：向果胶粗多糖中加入蒸馏水，配置成浓度为1-2.5 %（w/v）的果胶粗多糖溶液；将鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶加入到果胶粗多糖溶液中酶解，酶解4-20 h后使用无水乙醇进行沉淀，并使用凝胶色谱柱和阴离子交换柱纯化，得到一级酶解多糖，其中，鼠李半乳糖醛酸水解酶、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-(1→5)-L-阿拉伯聚糖内切酶、β-D-半乳糖苷酶、β- (1→4)-D-半乳聚糖内切酶在果胶粗多糖溶液中的终浓度均为0.5-1.5 U/mL；
采用内切果胶酶和果胶甲酯酶进行二级定向酶解的方法为：将一级酶解多糖溶解于0.02-0.5 mol /L乙酸钠缓冲溶液中，配置成浓度为1-2.5 %（w/v）的一级酶解多糖溶液；向一级酶解多糖溶液中加入内切多聚半乳糖醛酸酶和果胶甲基酯酶，置于50℃条件下酶解1-2 h，得到二级酶解多糖，二级酶解多糖经真空浓缩除去75-85%的溶剂，冻干并研磨，得到低分子量HG型果胶，其中，内切多聚半乳糖醛酸酶、果胶甲基酯酶在一级酶解多糖溶液中的终浓度均为0.2-1.0 U/mL；
一级酶解多糖在进行二级定向酶解前先进行预处理，预处理的方法为：将一级酶解多糖采用截流分子量10 kDa的超滤膜进行分级，然后再置于离心机中以8000-10000 r·min-1转速离心10-20 min，回收超滤渗余物，进行二级定向酶解。
2.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，果蔬加工副产物在进行酸热提取前先进行预处理，预处理的方法为：将果蔬加工副产物先置于在-80℃的条件下冷冻8-16 h，然后粉碎并过600-800 µm筛，再置于压力为0.37 mbar、温度为25-35℃的条件下进行低温真空冷冻干燥，得到冻干果蔬粉，最后再进行酸热提取。
3.如权利要求1所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，采用酸热提取法的处理方法为：向果蔬加工副产物中加入去离子水混合，然后使用浓度为2mol/L的盐酸溶液调节pH至2-4，再升温至40-80℃并保温2-6 h，过滤，得到第一滤液并浓缩，得到果蔬预处理物，再将果蔬预处理物进行分级醇沉，其中，果蔬加工副产物与去离子水的比例为1:30-50。
4.如权利要求2所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，分级醇沉的方法为：在搅拌的条件下向果蔬预处理物中加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为30-45%，静置12 h，取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为50-60%，静置12 h，再取上层清液并在搅拌的条件下加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数为65-80%，静置12 h，取沉淀物，将沉淀物装入截留分子量为3500 Da的透析袋中并置于去离子水中，在24℃条件透析36-72 h，得到果胶粗多糖。
5.如权利要求4所述的低分子量HG型果胶的制备方法，其特征在于，二级定向酶解采用超高压灭酶，灭酶的条件为：压力400-600 Mpa，温度40-65℃。
6.如权利要求1-5任一项所述的低分子量HG型果胶的制备方法所制备的低分子量HG型果胶的构象表征方法，其特征在于，采用分光光度计测定果胶半乳糖醛酸含量及果胶酯化羧基的含量，分析低分子量HG型果胶的酯化度；使用高效体积排阻色谱联合十八角度激光散射仪，以氯化钠为洗脱液测定低分子量HG型果胶的分子量及其分布；采用高效阴离子色谱仪，测定低分子量HG型果胶的中性糖组成和含量；采用傅立叶变换红外光谱仪分析低分子量HG型果胶中官能团类型；采用小角度X射线散射技术分析低分子量HG型果胶的空间构象参数；采用高场核磁共振仪分析的糖链化学结构；表征低分子量HG型果胶的空间构象。
7.如权利要求6所述的低分子量HG型果胶的构象表征方法，其特征在于，低分子量HG型果胶空间构象表征的方法包括以下步骤：
A1、计算低分子量HG型果胶的酯化度、分子量、中性糖含量、分子链线性度及支链结构域的贡献率、多分散指数、分子链的链长和链宽及空间构象参数，空间构象参数包括平均回旋半径、流体力学半径、非均向性构型、构象类型指数、持续长度、特征比；
A2、将步骤A1中的参数输入建模软件POLYS，结合低分子量HG型果胶糖链化学结构，并利用存储在 MONOBANK 数据库中和GLYCLINK 数据库中的单糖和糖苷键的结构信息，构建低分子量HG型果胶的三维结构模型，表征低分子量HG型果胶的空间构象。
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