CN111195277A - 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途 - Google Patents

一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN111195277A
CN111195277A CN201811372683.8A CN201811372683A CN111195277A CN 111195277 A CN111195277 A CN 111195277A CN 201811372683 A CN201811372683 A CN 201811372683A CN 111195277 A CN111195277 A CN 111195277A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhododendron molle
diterpene
effective
silica gel
rhododendron
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201811372683.8A
Other languages
English (en)
Inventor
阮克锋
梁爽
张继全
房鑫
冯怡
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
SHANGHAI ZHANGJIANG ENGINEERING RESEARCH CENTER OF MODERN PREPARATION TECHNOLOGY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Original Assignee
SHANGHAI ZHANGJIANG ENGINEERING RESEARCH CENTER OF MODERN PREPARATION TECHNOLOGY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by SHANGHAI ZHANGJIANG ENGINEERING RESEARCH CENTER OF MODERN PREPARATION TECHNOLOGY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE filed Critical SHANGHAI ZHANGJIANG ENGINEERING RESEARCH CENTER OF MODERN PREPARATION TECHNOLOGY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
Priority to CN201811372683.8A priority Critical patent/CN111195277A/zh
Publication of CN111195277A publication Critical patent/CN111195277A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/45—Ericaceae or Vacciniaceae (Heath or Blueberry family), e.g. blueberry, cranberry or bilberry
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/15—Preparation or pretreatment of starting material involving mechanical treatment, e.g. chopping up, cutting or grinding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/33—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones
    • A61K2236/333—Extraction of the material involving extraction with hydrophilic solvents, e.g. lower alcohols, esters or ketones using mixed solvents, e.g. 70% EtOH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/30—Extraction of the material
    • A61K2236/39—Complex extraction schemes, e.g. fractionation or repeated extraction steps
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/51—Concentration or drying of the extract, e.g. Lyophilisation, freeze-drying or spray-drying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/53—Liquid-solid separation, e.g. centrifugation, sedimentation or crystallization
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/50—Methods involving additional extraction steps
    • A61K2236/55—Liquid-liquid separation; Phase separation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法，该制备工艺为将羊踯躅(Rhododendron molle G.Don)果实、花或根等药用部位粉碎成粗粉，乙醇提取后，浓缩，进行离心或过滤，取上清液依次经过大孔树脂和正相硅胶柱色谱，即得羊踯躅二萜有效部位，以闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI计总含量计算＞50%；本发明还公开了羊踯躅二萜有效部位在制备抗类风湿关节炎药物中的用途，采用II型胶原诱导型关节炎模型、二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型、醋酸扭体法镇痛模型、热板法镇痛模型，证实该药物具有明显的抗类风湿关节炎作用，为临床提供了一种新的药物选择。

Description

一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途
技术领域：
本发明属于中药化学领域，涉及一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途，特别是涉及一种利用乙醇提取、离心、大孔树脂和正相硅胶分离纯化制备羊踯躅二萜有效部位的工艺，并且对其进行抗类风湿关节炎药物用途的研究。
背景技术：
羊踯躅是杜鹃花科植物，别名闹羊花、八厘麻、山芝麻根、巴山虎等，我国传统中药，始载于《神农本草经》，《本草纲目》、《梁假瀛集验良方》等医药书中均有记载，羊踯躅的果实、根和花均可入药，民间常用羊踯躅治疗类风湿关节炎。现代药理学研究表明，羊踯躅根提取物具有镇痛活性、明显抑制佐剂型关节炎的作用、抑制免疫反应等作用。
羊踯躅含有二萜、黄酮及其他类化合物，其中二萜类成分是目前研究的热点。课题组前期采用II型胶原诱导型关节炎模型、体外细胞模型 (T、B淋巴细胞增殖实验、滑膜细胞实验、RAW264.7细胞实验)、抗炎镇痛动物实验模型 (二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型、醋酸扭体法镇痛模型)，对以闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI为代表的二萜类成分以及羊踯躅各极性部位的抗类风湿关节炎活性进行评价，结果表明以闹羊花毒素III为代表的二萜类成分是羊踯躅治疗类风湿关节炎的主要成分。
但是羊踯躅果实、花或根等药用部位毒性均较大，且其是二萜类成分的含量没有合适的质量控制标准，因此，羊踯躅的临床使用受到了极大限制。因羊踯躅根、花、果实均可入药，前期含量测定结果表明，果实中二萜类成分含量是根、花中的10倍左右，对分析方法、制备工艺、得率等因素综合考虑，从羊踯躅果实中制备羊踯躅二萜有效部位更优，本发明可从羊踯躅果实、花或根等部位中获得治疗类风湿关节炎的羊踯躅二萜有效部位，为羊踯躅临床使用与新药开发提供药效物质基础。
发明内容：
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种羊踯躅二萜有效部位的制备工艺方法。该工艺在于提供一种简便可行、提取效率高、分离纯化效果明显、得率高的利用提取、离心、大孔树脂和正相硅胶柱色谱制备羊踯躅二萜有效部位的分离纯化方法。
本发明要解决的技术问题之二在于提供采用上述制备工艺方法制得的羊踯躅二萜有效部位。
本发明要解决的技术问题之三在于提供上述羊踯躅二萜有效部位在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
本发明的技术问题是通过如下技术方案实现的。
在本发明的一方面，提供一种羊踯躅二萜有效部位的制备工艺方法，包括如下步骤：
A. 提取：取羊踯躅(Rhododendron molle G. Don)果实、花或根等药用部位，粉碎成粗粉，用50%-100% 乙醇溶液回流提取后，将提取液浓缩到0-20% 乙醇浓度即得浓缩液；
B. 离心或者过滤：将浓缩液静置8-12h后进行离心或者过滤，取上清液或滤液备用；
C. 大孔树脂柱色谱：将所得上清液上大孔树脂柱，吸附完毕后用纯水洗杂质，再用乙醇水溶液洗脱，得羊踯躅二萜有效部位洗脱液；将洗脱液浓缩至恒重，得羊踯躅二萜有效部位浓缩膏；
D. 正相硅胶柱色谱：将羊踯躅二萜有效部位浓缩膏拌硅胶，将拌好的样品上样，采用二氯甲烷：甲醇体系进行洗脱，得羊踯躅二萜有效部位。
进一步地，步骤A中，所述羊踯躅的药用部位为羊踯躅的果实、根或花。所述乙醇用量为所述羊踯躅的5-10倍，提取温度为50-100℃，提取次数为1-4次，时间为1-3小时。
进一步地，步骤B中，所述离心条件为转速是4000-7000 rpm，离心时间是8-14min；所述过滤条件为经过300-400目滤网进行过滤。
进一步地，步骤C中，所述大孔树脂类型可以是LSA-12S、AB-8、D-101等常用大孔树脂类型，其中以LSA-12S最优，大孔树脂柱的参数有：上样量为1-1.5kg羊踯躅生药量 /kg大孔树脂，上样流速为2-4 倍柱体积每小时，洗脱流速为2-4 倍柱体积每小时，径高比为1:5-1:10，洗脱溶剂为3-7倍柱体积纯水，5-10倍柱体积20-50% 乙醇溶液。
进一步地，步骤D中，所述正相硅胶粒径大小是100-200目，正相硅胶柱的参数有：羊踯躅二萜有效部位浓缩膏和拌样硅胶质量比为1:2-1:4，羊踯躅二萜有效部位浓缩膏和硅胶柱硅胶质量比为1:30-1:70 (所述硅胶柱硅胶是上正相硅胶柱后，硅胶柱中的正相硅胶)，径高比为1:5-1:10，洗脱溶剂为12-15倍柱体积30:1-20:1二氯甲烷：甲醇溶液，12-15倍柱体积15:1-10:1二氯甲烷：甲醇溶液，合并闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI溶液，即得羊踯躅二萜有效部位。
在本发明的第二方面，提供上述制备工艺方法制得的羊踯躅二萜有效部位。
更为重要的，所述羊踯躅二萜有效部位中闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI总含量大于50%，并且闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI的质量比为0.3:1～3:1。
在本发明的第三方面，提供该羊踯躅二萜有效部位在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
本发明采用的抗类风湿关节炎实验包括II型胶原诱导型关节炎模型、二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型、醋酸扭体法镇痛模型、热板法镇痛模型，证实该药物具有明显的抗类风湿关节炎作用，为临床提供了一种新的药物选择。
本发明的制备工艺和用途具有如下优点：
本发明为首次从羊踯躅中制备得到羊踯躅二萜有效部位，以闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI为指标性成分，其中两者总含量大于50%，且闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI的含量容易控制。本制备工艺采用提取、离心、大孔树脂、正相硅胶柱色谱的分离纯化方法，本工艺高效、经济、环保、过程简单，便于工业化生产。
本发明在整体动物层面和细胞层面对羊踯躅二萜有效部位进行抗类风湿关节炎活性研究，结果表明：羊踯躅二萜有效部位活性优于闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI单体，并且其制备工艺更简单、毒性更小、得率更高，同时，羊踯躅二萜有效部位同羊踯躅果实、根、花直接使用比较，具有有效成分明确、质量可控、高效低毒等优点。总之，羊踯躅二萜有效部位在抗类风湿关节炎用途上具有非常大的优势。
附图说明
图1 是本发明实施例6中羊踯躅二萜有效部位HPLC-ELSD 液相色谱图；图1中，色谱峰1代表闹羊花毒素III，色谱峰2代表闹羊花毒素VI；
图2 是本发明实验例1中羊踯躅二萜有效部位对类风湿关节炎 (CIA) 大鼠体重的影响；图2中，DFRM 代表羊踯躅二萜有效部位，***表示与空白组比较P<0.001；###表示与模型组比较P<0.001；##表示与模型组比较P<0.01；
图3 是本发明实验例1中羊踯躅二萜有效部位对类风湿关节炎 (CIA) 大鼠关节炎指数的影响示意图；图3中，DFRM 代表羊踯躅二萜有效部位，***表示与空白组比较P<0.001；###表示与模型组比较P<0.001；##表示与模型组比较P<0.01；
图4 是本发明实验例1中羊踯躅二萜有效部位对类风湿关节炎 (CIA) 大鼠细胞因子水平的影响示意图；图4中，1代表空白对照组；2代表模型组；3 代表雷公藤多苷片组；4 代表闹羊花毒素III；5 代表闹羊花毒素VI；6-8 分别代表DFRM 低、中、高剂量组；***表示与空白组比较P<0.001；**表示与空白组比较P<0.01；###表示与模型组比较P<0.001；##表示与模型组比较P<0.01；
图5 是本发明实验例1中羊踯躅二萜有效部位对类风湿关节炎 (CIA) 大鼠组织病理学的影响示意图；
图6 是本发明实验例2中二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症实验结果示意图；图6中，1 代表空白对照组；2 代表醋酸地塞米松；3 代表DFRM 低剂量；4 代表DFRM 中剂量；5 代表DFRM高剂量；与空白对照组相比：**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；
图7 是本发明实验例3中醋酸扭体法镇痛实验结果示意图；图7中，1 代表空白对照组；2 代表醋酸地塞米松；3 代表DFRM 低剂量；4 代表DFRM 中剂量；5 代表DFRM 高剂量；与空白对照组相比：**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；
图8 是本发明实验例4中热板法镇痛实验结果示意图；图8中，30 min阈值：1 代表空白对照组；2 代表盐酸吗啡组；3 代表DFRM 低剂量组；4 代表DFRM 中剂量组；5 代表DFRM 高剂量组；6-10为各组45 min阈值；11-15为各组60 min阈值；16-20为各组90 min阈值；与空白对照组相比：**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；
图9 是本发明实验例5中T淋巴细胞增殖实验结果示意图；图9中，与CD3/28antibodies诱导组比较，*P<0.05，**P<0.01；
图10是本发明实验例5中 B淋巴细胞增殖实验结果示意图；图10中，与 LPS 诱导组，比较*P<0.05，**P<0.01。
具体实施方式：
如前所述，本发明旨在提供一种简便可行、质量可控、经济环保的羊踯躅二萜有效部位制备工艺。以下将结合实例内容进行具体描述。
特别需要指明的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明未注明具体条件者，均按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用原料、所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
取羊踯躅 (Rhododendron molle G. Don) 干燥果实 200 g，加8倍体积70%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，提取温度为60℃，合并提取液，浓缩到10%乙醇浓度后静置12小时，进行离心，离心条件为4000 rpm，离心8 min，取上清液上大孔树脂柱，上样量为1.3 kg羊踯躅果实/ kg大孔树脂，上样流速为2倍柱体积每小时，洗脱流速为4倍柱体积每小时，径高比为1:10，依次用纯水洗脱5倍柱体积，30%乙醇洗脱7倍柱体积，收集含二萜的样品浓缩得羊踯躅二萜有效部位浸膏，将浸膏同正相硅胶拌样，浸膏和拌样正相硅胶质量比为1:2，上正相硅胶柱，浸膏和柱中正相硅胶质量比为1:30，径高比为1:7，依次用二氯甲烷：甲醇=20:1、二氯甲烷：甲醇=10:1各洗脱12倍柱体积，根据TLC点板情况，将含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI明显点的溶液合并，浓缩，干燥至恒重，即得羊踯躅二萜有效部位。
实施例2
取羊踯躅 (Rhododendron molle G. Don) 干燥果实 7 kg，加10倍体积95%乙醇加热回流提取2次，每次3小时，提取温度为80℃，合并提取液，浓缩到无乙醇味后静置8小时，进行离心，离心条件为7000 rpm，离心14 min，取上清液上大孔树脂柱，上样量为1 kg 羊踯躅果实/ kg大孔树脂，上样流速为4倍柱体积每小时，洗脱流速为2倍柱体积每小时，径高比为1:7，依次用纯水洗脱3倍柱体积，20%乙醇洗脱10倍柱体积，收集含二萜的样品浓缩得羊踯躅二萜有效部位浸膏，将浸膏同正相硅胶拌样，浸膏和拌样正相硅胶质量比为1:4，上正相硅胶柱，浸膏和柱中正相硅胶质量比为1:70，径高比为1:10，依次用二氯甲烷：甲醇=30:1、二氯甲烷：甲醇=15:1各洗脱15倍柱体积，根据TLC点板情况，将含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI明显点的溶液合并，浓缩，干燥至恒重，即得羊踯躅二萜有效部位。
实施例3
取羊踯躅 (Rhododendron molle G. Don) 干燥果实 12 kg，加5倍体积70%乙醇加热回流提取4次，每次1小时，提取温度为50℃，合并提取液，浓缩到无乙醇味后静置10小时，用300目筛进行过滤，取滤液上大孔树脂柱，上样量为1.5 kg 羊踯躅果实/ kg大孔树脂，上样流速为3倍柱体积每小时，洗脱流速为3倍柱体积每小时，径高比为1:5，依次用纯水洗脱7倍柱体积，50%乙醇洗脱5倍柱体积，收集含二萜的样品浓缩得羊踯躅二萜有效部位浸膏，将浸膏同正相硅胶拌样，浸膏和拌样正相硅胶质量比为1:3，上正相硅胶柱，浸膏和柱中正相硅胶质量比为1:50，径高比为1:5，依次用二氯甲烷：甲醇=20:1、二氯甲烷：甲醇=15:1各洗脱15倍柱体积，根据TLC点板情况，将含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI明显点的溶液合并，浓缩，干燥至恒重，即得羊踯躅二萜有效部位。
实施例4
取羊踯躅 (Rhododendron molle G. Don) 干燥根 200 g，加8倍体积70%乙醇加热回流提取3次，每次2小时，提取温度为70℃，合并提取液，浓缩到无乙醇味后静置9小时，用400目筛进行过滤，取滤液上大孔树脂柱，上样量为1.5 kg 羊踯躅根/ kg大孔树脂，上样流速为2倍柱体积每小时，洗脱流速为4倍柱体积每小时，径高比为1:7，依次用纯水洗脱5倍柱体积，30%乙醇洗脱7倍柱体积，收集含二萜的样品浓缩得羊踯躅二萜有效部位浸膏，将浸膏同正相硅胶拌样，浸膏和拌样正相硅胶质量比为1:2，上正相硅胶柱，浸膏和柱中正相硅胶质量比为1:30，径高比为1:10，依次用二氯甲烷：甲醇=20:1、二氯甲烷：甲醇=15:1各洗脱15倍柱体积，根据TLC点板情况，将含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI明显点的溶液合并，浓缩，干燥至恒重，即得羊踯躅二萜有效部位。
实施例5
取羊踯躅 (Rhododendron molle G. Don) 干燥花 200 g，加10倍体积50%乙醇加热回流提取1次，每次3小时，提取温度为100℃，合并提取液，浓缩到20%乙醇浓度后静置11小时，进行离心，离心条件为3000 rpm，离心6 min，，取滤液上大孔树脂柱，上样量为1kg 羊踯躅花/ kg大孔树脂，上样流速为1倍柱体积每小时，洗脱流速为1倍柱体积每小时，径高比为1:10，依次用纯水洗脱7倍柱体积，50%乙醇洗脱5倍柱体积，收集含二萜的样品浓缩得羊踯躅二萜有效部位浸膏，将浸膏同正相硅胶拌样，浸膏和拌样正相硅胶质量比为1:3，上正相硅胶柱，浸膏和柱中正相硅胶质量比为1:50，径高比为1:7，依次用二氯甲烷：甲醇=20:1、二氯甲烷：甲醇=15:1各洗脱13倍柱体积，根据TLC点板情况，将含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI明显点的溶液合并，浓缩，干燥至恒重，即得羊踯躅二萜有效部位。
实施例6 实施例1-5制得的羊踯躅二萜有效部位含量测定结果
本发明采用高效液相色谱-蒸发光散射 (HPLC-ELSD) 法测定闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI的含量，具体方法为：Welch Materials C18色谱柱 (5μm，4.6mm´250mm)，流动相为乙腈 (B)-0.3%甲酸水 (D) 体系，洗脱梯度如下：0-5min，1%B，99%D；6-80min，5%B，95%D；81-100min，100%B，0%D；101-110min，1%B，99%D，流速为 1.0 mL•min-1，检测波长为 278nm，柱温为 30℃，进样量为 50μL，选择蒸发光散射检测器，温度 55℃，气体流量 1.6 L/min，增益值 2。实施例1-5制得的羊踯躅二萜有效部位含量检测结果见表1，羊踯躅二萜有效部位HPLC-ELSD 液相色谱图见图1。
表1 实施例1-5制得的羊踯躅二萜有效部位含量检测结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
以下通过药理实验对本发明羊踯躅二萜有效部位的用途作进一步的阐述：
实验例1. 羊踯躅二萜有效部位对类风湿关节炎 (CIA) 大鼠治疗作用
首先建立Ⅱ型胶原诱导关节炎的动物模型，做预治实验，表2是给药分组及给药剂量。
表2 给药分组及给药剂量
Figure DEST_PATH_IMAGE002
A. CIA 大鼠体重变化
CIA大鼠体重变化见图2，结果表明：与空白对照组比较，模型组有显著差异，表明造模成功；与模型组比较，各给药组有显著差异，提示药物有一定的治疗作用。
B. CIA大鼠关节炎指数
关节炎指数评分见表3，由于前爪患病症状不明显，所以记两只后抓的症状，总分为8分。CIA大鼠关节炎指数结果见图3，结果表明：与空白对照组比较，模型组有显著差异，表明造模成功；与模型组比较，羊踯躅二萜有效部位高剂量和闹羊花毒素 VI 有明显的治疗作用，同雷公藤多苷作用相当，同时，羊踯躅二萜有效部位中剂量也表现较强的治疗作用。
表3 关节炎指数表
Figure DEST_PATH_IMAGE003
C. CIA大鼠细胞因子水平
CIA大鼠细胞因子水平结果见图4，结果表明： 与空白对照组比较，模型组有显著差异，表明造模成功；与模型组比较，羊踯躅二萜有效部位高剂量对促炎性细胞因子 (IL-1β、IL-6、TNF-α) 有明显的抑制作用，可能与其缓解和抑制关节炎大鼠发病的机制有关。同时，各给药组对抗炎性细胞因子 (IL-10) 作用不大。
D. CIA大鼠组织病理学检查
CIA大鼠组织病理学检查结果见图5，结果表明：空白组大鼠关节软骨面完整且光滑，滑膜无肿胀；模型组大鼠有明显的滑膜增生及炎性细胞浸润，关节软骨破坏明显；阳性药雷公藤组大鼠滑膜较为正常，基本没有炎性细胞浸润、关节间隙变窄；与模型组相比，羊踯躅二萜有效部位高剂量组滑膜较为完整，炎性细胞浸润较少，关节软骨破坏明显改善，中剂量组炎性细胞浸润有明显改善，有少量软骨破坏，低剂量组滑膜增生不明显，但软骨有少量破坏，另外闹羊花毒素VI组和闹羊花毒素III组相比模型组滑膜破坏有明显改善。
实验例2. 羊踯躅二萜有效部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症实验治疗作用
实验分组和给药剂量见表4，按照给药体积 0.2 ml/10 g 灌胃给药，l天1次，连续5天，末次给药60 min后在小鼠右耳的前后两面涂抹 30 μl 的二甲苯致炎，30 min 后颈椎脱臼处死动物，立即沿耳廓基线剪下双耳，用直径 8mm 打孔器分别在两耳片同一部位(沿耳缘)打孔，在电子天平上称重。
A. 评价方法
肿胀度 (mg) = 右耳重 — 左耳重
肿胀抑制率 = ( 模型组 — 给药组 ) /模型组× 100%
结果见表4和图6，结果表明：羊踯躅二萜有效部位高剂量具有明显的抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀的作用。
表4 羊踯躅二萜有效部位对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 ( ± s，n=10)
Figure DEST_PATH_IMAGE004
与空白对照组相比：**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001
实验例3. 羊踯躅二萜有效部位对醋酸扭体法镇痛实验治疗作用
实验分组和给药剂量见表5，按照给药体积0.2 ml/10 g灌胃给药，l天1次，连续5天，末次给药60 min后，按照0.1 mL/10 g给药剂量腹腔注射 0.9% 冰醋酸溶液。观察并记录小鼠15 min内扭体次数。
表5 羊踯躅二萜有效部位对醋酸扭体法镇痛实验的影响 ( ± s，n=10)
Figure DEST_PATH_IMAGE005
与空白对照组相比：**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001
结果见表5和图7，结果表明：羊踯躅二萜有效部位高、中、低剂量具有较强的镇痛作用，明显减少扭体次数。,
实验例4. 羊踯躅二萜有效部位对热板法镇痛实验治疗作用
实验分组和给药剂量见表6，水温 (55.0±0.1) ℃，记录小鼠从放入金属盒至出现舔后足反应所需时间 (s)，小于 5 s 或大于 30 s 或跳跃的都弃之不用。取筛选合格的雌性小鼠60只，随机分为5组，分组为模型组，阳性药组，羊踯躅二萜有效部位给药组高、中、低剂量3组。将每只小鼠正常痛阈值各测 2 次，每次间隔 10 min，取其平均值为给药前正常痛阈值。给药除阳性对照组皮下注射盐酸吗啡溶液 2 d 外，其他与实施例2中相同，分别于末次给药后 30、60、90、120 min 测定小鼠痛阈值，如果用药后放入金属盒内60 s仍无反应，即将小鼠取出，以免时间太长把脚烫伤，其痛阈值按 60 s 计算。
表6 羊踯躅二萜有效部位对热板法镇痛实验的影响 ( ± s，n=12)
Figure DEST_PATH_IMAGE007
结果见表6和图8，结果表明：羊踯躅二萜有效部位高剂量具有较强的镇痛作用，能够明显增加小鼠热板法的阈值。
实验例5. 羊踯躅二萜有效部位对 T 、B淋巴细胞增殖的影响
实验分组和给药剂量见表7。
表7 实验分组和给药剂量
Figure DEST_PATH_IMAGE009
A. 各给药组对 T 淋巴细胞增殖的影响
将 CD3+T 细胞 5*105个/孔/100ul 接种于 96 孔板中，加入确定好浓度的样品，采用CD3/28 antibodies (2 μg/ml, Peprotech, Rocky Hill, NJ) 刺激 T cell receptors(TCRs) 促进 T 细胞增殖。培养 48h。结束培养时每孔加 5 ul CCK-8，37℃ 放置 4h，酶标仪于 450nm 处测定 OD 值。
B. 各给药组对 B 淋巴细胞增殖的影响
CD19+B 细胞 5*105个/孔/100ul 接种于 96 孔板中，加入确定好浓度的样品，采用LPS（终浓度1 ug/ml） 促进 B 细胞增殖。培养 48h。结束培养时每孔加 5 ul CCK-8，37℃放置 4h，酶标仪于 450nm 处测定OD值。
实验结果见图9和图10，结果表明：羊踯躅二萜有效部位和闹羊花毒素III 中剂量(0.3mg/ml、0.03mg/ml) 和高剂量 (1mg/ml、0.1mg/ml) 抑制T、B淋巴细胞增殖的效果明显，与同剂量阳性药 (雷公藤多苷片、甲氨蝶呤) 作用相当。
同时，闹羊花毒素III 部位、闹羊花毒素VI和羊踯躅果实70%乙醇提取物高剂量(1mg/ml、0.1mg/ml、1mg/ml) 抑制T、B淋巴细胞增殖的作用较强。样品闹羊花毒素 VI 部位的抑制作用一般。

Claims (10)

1.一种羊踯躅二萜有效部位的制备工艺方法，其特征在于，包括如下步骤：
A. 提取：取羊踯躅的药用部位，粉碎成粗粉，用 50%-95% 乙醇溶液回流提取后，将提取液浓缩到0-20% 乙醇浓度即得浓缩液；
B. 离心或者过滤：将浓缩液静置8-12h后进行离心或者过滤，取上清液或滤液备用；
C. 大孔树脂柱色谱：将上清液上大孔树脂柱，吸附完毕后用纯水洗杂质，再用乙醇水溶液洗脱，得羊踯躅二萜有效部位洗脱液；将其浓缩至恒重，得羊踯躅二萜有效部位浓缩膏；
D. 正相硅胶柱色谱：将羊踯躅二萜有效部位浓缩膏拌硅胶，将拌好的样品上样，采用二氯甲烷：甲醇体系进行洗脱，得羊踯躅二萜有效部位。
2.根据权利要求1所述制备工艺方法，其特征在于，步骤A中，所述羊踯躅的药用部位为羊踯躅的果实、根或花。
3.根据权利要求1所述的制备工艺方法，其特征在于，步骤A中，所述乙醇用量为所述羊踯躅质量的5-10倍，提取温度为50-100℃，提取次数为1-4次，时间为1-3小时。
4.根据权利要求1所述的制备工艺方法，其特征在于，步骤B中，所述离心条件为转速是3000-7000 rpm，离心时间是6-14 min；所述过滤条件为经过300-400目滤网进行过滤。
5.根据权利要求1所述的制备工艺方法，其特征在于，步骤C中，所述大孔树脂类型是LSA-12S、AB-8或D-101常用大孔树脂类型，大孔树脂柱的参数：上样量为1-1.5kg羊踯躅生药量 / kg大孔树脂，上样流速为1-4 倍柱体积每小时，洗脱流速为1-4 倍柱体积每小时，径高比为1:5-1:10，洗脱溶剂为3-7倍柱体积纯水，5-10倍柱体积20-50% 乙醇溶液。
6.根据权利要求1所述的制备工艺方法，其特征在于，步骤C中，所述大孔树脂类型是LSA-12S。
7.根据权利要求1所述的制备工艺方法，其特征在于，步骤D中，所述正相硅胶粒径大小是100-200目，正相硅胶柱的参数有：羊踯躅二萜有效部位浓缩膏和拌样硅胶质量比为1:2-1:4，羊踯躅二萜有效部位浓缩膏和硅胶柱硅胶质量比为1:30-1:70，径高比为1:5-1:10，洗脱溶剂为10-15倍柱体积30:1-20:1二氯甲烷：甲醇溶液，10-15倍柱体积15:1-10:1二氯甲烷：甲醇溶液，合并含闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI溶液，即得羊踯躅二萜有效部位。
8.根据权利要求1-7任一项所述制备工艺方法制得的羊踯躅二萜有效部位。
9.根据权利要求8所的羊踯躅二萜有效部位，其特征在于，该羊踯躅二萜有效部位中闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI总含量大于50%，并且闹羊花毒素III和闹羊花毒素VI的质量比为0.3-3:1。
10.根据权利要求8所述的羊踯躅二萜有效部位在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。
CN201811372683.8A 2018-11-19 2018-11-19 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途 Pending CN111195277A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811372683.8A CN111195277A (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811372683.8A CN111195277A (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111195277A true CN111195277A (zh) 2020-05-26

Family

ID=70741605

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811372683.8A Pending CN111195277A (zh) 2018-11-19 2018-11-19 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111195277A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114634537A (zh) * 2022-04-12 2022-06-17 云南省药物研究所 金叶子二萜的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788291A (zh) * 2015-03-25 2015-07-22 青岛华仁技术孵化器有限公司 闹羊花分离的二萜类化合物的抗肿瘤药物及方法用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104788291A (zh) * 2015-03-25 2015-07-22 青岛华仁技术孵化器有限公司 闹羊花分离的二萜类化合物的抗肿瘤药物及方法用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHAO-NONG CHEN ET AL: "Diterpenoids from the Flowers of Rhododendron molle", 《J. NAT. PROD.》 *
姜北等: "《白族惯用植物药》", 31 March 2014, 中国中医药出版社 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114634537A (zh) * 2022-04-12 2022-06-17 云南省药物研究所 金叶子二萜的制备方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Numata et al. Antitumor components isolated from the Chinese herbal medicine Coix lachryma-jobi
CN110540504B (zh) 巨大戟烷型二萜的制备方法及其在制药中的用途
CN108129295B (zh) 一类松香烷型二萜衍生物与其药物组合物和用途
CN112089743B (zh) 一种免疫抑制药物及中亚苦蒿提取物在制备治疗自身免疫相关疾病的药物中的应用
CN111195277A (zh) 一种羊踯躅二萜有效部位及其制备工艺方法和用途
CN103977391B (zh) 一种小柴胡胶囊的制备方法及应用
CN103804334B (zh) 从毛菊苣中提取c15h18o5方法及其用途
CN110522776B (zh) 一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用
CN112250655B (zh) 两种新的环状二苯基庚烷类化合物及其制备方法和用途
CN110590892B (zh) 一种从废弃栝楼果瓤中分离得到的具有抗肿瘤活性的三萜化合物及其应用
CN111150754B (zh) 板栗花提取物在制备食品或抗炎药物中的应用
CN101537027A (zh) 暗消藤抗肺癌活性提取物及其化合物的制备工艺
CN107936130B (zh) 一种雪上一枝蒿多糖及提取方法以及应用
CN108840891B (zh) 杜仲叶中综合提取桃叶珊瑚苷、绿原酸和杜仲胶的工艺
CN111925404A (zh) 一种木脂素类化合物的制备方法与应用
CN108619179A (zh) 老鹳草提取物及其医药用途
CN104288220A (zh) 一种富含肌醇和芦丁的槐米提取物及其制备方法
CN111484411B (zh) 艾叶抗炎有效成分的提取方法和应用
CN114133422B (zh) 一种葫芦烷三萜类化合物及其制备方法和应用
CN115716812B (zh) 瑞香狼毒中的没药烷型倍半萜类化合物及其应用
CN104173413B (zh) 雷公藤叶总萜在制备抗类风湿关节炎药物中的应用
CN108159195A (zh) 一种尖尾枫提取物、制备方法及其应用
CN110787196B (zh) 锡叶藤及其提取物在制备治疗和/或预防酒精性肝损伤药物方面的应用
CN117771237B (zh) 一种松香烷型二萜化合物的用途和制备方法
CN110393712B (zh) 从大麻叶泽兰中提取的抗肿瘤有效部位及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200526