CN110522776B - 一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用 - Google Patents

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用，本发明方法包括粉碎、有机溶剂提取、浓缩、硅胶柱层析、大孔吸附树脂洗脱以及干燥等步骤。该方法简单、易于操作，所得有效部位中杂质明显减少，UPLC检测结果显示药效物质的含量达70％以上，符合国家五类新药规定的50％的含量标准。本发明还对所得有效部位进行了药效学研究，结果显示该有效部位对多种肿瘤细胞均具有抗增殖活性，提示其在抗肿瘤药物或保健品中具有良好的应用前景。

Description

一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用，属于医药生物技术领域。
背景技术
黄槿(Hibiscus tiliaceus)属锦葵科(Malvaceae)木槿属(Hibiscus)，是一种具有重要生态、药用和观赏价值的半红树植物，广泛分布于中国、越南、柬埔寨、缅甸、印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾及老挝等热带地区，我国主产于海南、广西、台湾、广东、福建等省，现已广泛种植栽培。据《全国中草药汇编》记载，黄槿具有清热止咳、解毒消肿等功效，在海南沿海居民地区作为药物用于毒蛇咬伤、痈疮肿毒、支气管炎等。因其既能在潮间带生存，并可在海滩上成为优势种，又能在陆地环境自然繁殖的两栖木本植物，具有重要的生态功能和独特的生境适应性，导致黄槿含有大量的结构新颖，特异性强，具有显著药用的活性分子。
1980年，国外学者从黄槿中发现报道了12个Furanosteroid族倍半萜类化合物。近40年间，国外学者对黄槿中该类化合物的报道较少。而国内学者对黄槿的化学成分研究较为肤浅，仅从中得到少量三萜、甾体类、苯丙素、黄酮、酰胺类等化学成分。在药理活性研究方面，国外的研究报道较少，而国内仅简单的针对黄槿提取物进行筛选，发现黄槿具有抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗氧化等药理活性。在有效成分的提取工艺方面，尚且缺乏一种可同时提取多种有效成分的方法。
发明内容
本发明提供一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法及应用。
本发明采取的技术方案如下：
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)取黄槿药材树干，粉碎；
(2)使用有机溶剂加热回流或冷浸提取；所述有机溶剂为二氯甲烷或丙酮；
(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为0.9～1.2g/ml，得总浸膏；
(4)取所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶柱层析，以石油醚为洗脱剂，得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；
(5)使用大孔吸附树脂洗脱，以体积分数70～90％的乙醇溶液为洗脱剂，收集洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。
优选的，二氯甲烷-甲醇的体积比为(38～42):1。
优选的，所述大孔吸附树脂为D101、D201和D411型大孔吸附树脂，三者质量比为(4～5):1:(1～2)。
优选的，回流时间为6～12h，回流提取3次，冷浸提取时间为24h，冷浸提取3次。
优选的，步骤(5)中，去除体积分数70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集体积分数80～90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液；洗脱速度为1.8～2mL/min，洗脱时间1.5～2h。
本发明分析确定，通过本发明方法所得黄槿中抗肿瘤有效部位的主要成分为Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C，三者的化合物结构如下所示：
Figure BDA0002216285140000021
检测结果显示：有效部位中Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C的质量比为(4.2～5.8)：(2.1～3.7)：(70.3～77.6)。
本发明还对所得黄槿有效部位进行药效学研究，结果显示该有效部位对肝癌细胞、腹水瘤细胞、肺腺癌细胞、宫颈癌细胞或胃腺癌细胞等具有抑制作用，特别是对小鼠肝癌细胞H22具有明显抑制作用，提示本发明有效部位具有抗肿瘤活性。
基于药效学研究结果，本发明所得有效部位可在制备预防或治疗肿瘤疾病的药物中应用，或在制备预防肿瘤疾病的保健品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
A.采用本发明方法，经过一系列的提取富集工艺步骤获得显著抗肿瘤活性的有效部位。所得有效部位中杂质明显减少，UPLC检测结果显示药效物质的含量达70％以上，符合国家五类新药规定的50％的含量标准。
B.本发明的黄槿有效部位原料来源丰富、价廉，制备方法简单，采用低极性溶剂充分萃取，使黄槿中的抗肿瘤活性物质富集，易于操作，成本低廉。
C.该有效部位在预防或治疗肿瘤疾病药物或保健品中具有重要用途。
附图说明
图1：黄槿有效部位和黄槿提取物的UPLC检测结果图。
图2：各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤形态体积的影响结果图。
图3：各组样品对H22荷瘤小鼠瘤重的影响结果图。
图4：各组样品对H22荷瘤小鼠肿瘤增殖率的影响结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)取黄槿药材树干，阴干，去除杂木；将黄槿药材切成小段，粉碎成0.5～2cm；
(2)使用有机溶剂(二氯甲烷)加热回流6～12h，回流提取3次；
(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为0.9g/ml，得总浸膏；
(4)取所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚为洗脱剂，洗脱3个柱体积得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；
(5)使用大孔吸附树脂(D101)洗脱，分别以70％乙醇溶液和90％乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱3个柱体积)，去除70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。
实施例2：
一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，包括以下步骤：
(1)取黄槿药材树干，阴干，去除杂木；将黄槿药材切成小段，粉碎成0.5～2cm；
(2)使用有机溶剂(丙酮)冷浸提取24h，提取3次；
(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为1.2g/ml，得总浸膏；
(4)将所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶(200-300目)柱层析，以石油醚为洗脱剂，洗脱10个柱体积得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇(40:1)为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；
(5)使用大孔吸附树脂洗脱(D101)，分别以70％乙醇溶液和80％乙醇溶液为洗脱剂(每种洗脱剂洗脱5个柱体积)，去除70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集80％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位。
实施例3
实施例3与实施例2的主要区别是：
步骤(5)中，进行大孔吸附树脂洗脱时，色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为4:1:2)。
实施例4
实施例4与实施例2的主要区别是：
步骤(5)中，进行大孔吸附树脂洗脱时，色谱柱中依序装填D101、D201和D411型大孔吸附树脂(质量比为5:1:1)。
对比例1
将黄槿替换为白木，制备方法与实施例1相同。
取实施例制备所得有效部位，以及对比例1制备所得提取物，进行UPLC检测，结果见图1和表1。
表1
Figure BDA0002216285140000051
UPLC检测结果显示，通过富集工艺制备后，有效部位中杂质明显减少，有效成分的含量显著提高，达70％以上。其中，有效部位中Hibiscone B含量为2.1～3.7％，HibisconeC含量为70.3～77.6％，Hibiscone A含量为4.2～5.8％。
试验例1：黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体外细胞实验
取实施例制备所得有效部位，以及对比例1制备所得提取物，参考文献报道的MTT法进行抗肿瘤细胞毒活性试验，结果见表2。
表2黄槿有效部位与白木提取物抗肿瘤细胞毒活性
Figure BDA0002216285140000052
Figure BDA0002216285140000061
结果显示：本发明所得有效部位可抑制肿瘤细胞增殖，其中，对H22细胞表现出最强的抗增殖活性，且对H22细胞的抗增殖活性(IC50＝7.4～8.1μg/ml)优于对MGC细胞的抗增殖活性(IC50＝31.9～42.2μg/ml)，体现出一定的选择性。
试验例2：黄槿有效部位抗肿瘤活性药效学研究-体内动物实验
一、实验材料
实验动物：ICR小鼠，体重18～22g，雌雄各半；
细胞株：小鼠肝癌细胞H22；
去甲斑蝥素，华北制药股份有限公司，批号：FAX1607002，人每次口服5～15mg，每日3次；
1640培养基，胎牛血清，GIBCO。
二、实验方法
H22细胞经液氮中取出，离心弃去上层冻存液，加完全1640培养基重悬细胞，CO2培养箱中37℃，CO2浓度5％培养。传代3次后，离心收集细胞，使用生理盐水重悬细胞细胞计数仪测定细胞密度，加入适量生理盐水稀释细胞密度为100万个/mL，进行小鼠腹腔传代，每只小鼠腹腔注射0.2毫升每只。5～7天后，处死小鼠，取腹水离心，重复上述体内传代过程3次(第一次实验，受寒假影响，体内传代2次)。取小鼠腹水离心收集细胞，生理盐水重悬调节密度为1000万个/mL。每只小鼠腋下靠近背部皮下注射0.2mL。次日开始给药，连续给药10天。
三、给药剂量
小鼠分为模型组、阳性对照组和受试药(实施例1所得有效部位)高、中、低剂量组。模型组给予等体积赋形剂，第一次实验使用食用油溶解药物，第二次实验使用0.5％羧甲基纤维素钠。阳性对照药给药小鼠去甲斑蝥素，2片研磨碎，加CMC-Na混悬体积50毫升。每只小鼠给予0.2毫升每10克体重，相当于人每日口服30mg。受试药物给药剂量为0.1、0.07、0.035、0.0175g/kg。
四、实验结果
结果见图2-4，结果显示：黄槿提取物有效部位在35～100mg/kg剂量范围内能够明显抑制肿瘤增殖作用，且70～100mg/kg剂量范围内相对肿瘤增殖率≤40％，符合国家抗肿瘤药物活性指标。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (7)

1.一种黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取黄槿药材树干，粉碎；
(2)使用有机溶剂加热回流或冷浸提取；所述有机溶剂为二氯甲烷或丙酮；
(3)过滤得到黄槿总提取液，减压浓缩至流体膏状物密度为0.9～1.2g/ml，得总浸膏；
(4)取所得总浸膏，使用硅胶干法拌样，待有机溶剂挥发干后，磨细，使用硅胶柱层析，以石油醚为洗脱剂，得到石油醚部位，再使用二氯甲烷-甲醇为洗脱剂，洗脱3～10个柱体积至红色变浅为止，收集洗脱液；
(5)使用大孔吸附树脂洗脱，以体积分数70～90％的乙醇溶液为洗脱剂，去除体积分数70％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，收集体积分数80～90％乙醇溶液洗脱后的洗脱液，减压浓缩，真空冷冻干燥，获得干粉状有效部位；所述大孔吸附树脂为D101、D201和D411型大孔吸附树脂，三者质量比为(4～5):1:(1～2)；
有效部位的主要成分为Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C，Hibiscone A、Hibiscone B和Hibiscone C的质量比为(4.2～5.8)：(2.1～3.7)：(70.3～77.6)。
2.根据权利要求1所述的黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征在于，二氯甲烷-甲醇的体积比为(38～42):1。
3.根据权利要求1所述的黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征在于，回流时间为6～12h，回流提取3次，冷浸提取时间为24h，冷浸提取3次。
4.根据权利要求1所述的黄槿中抗肿瘤有效部位的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，洗脱速度为1.8～2mL/min，洗脱时间1.5～2h。
5.黄槿中抗肿瘤有效部位，其特征在于，通过权利要求1-4任一项所述的制备方法制得。
6.权利要求5所述的黄槿中抗肿瘤有效部位在制备治疗肿瘤疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、腹水瘤、肺腺癌、宫颈癌或胃腺癌。
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