CN1853618A - 溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，以下列四个溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物之一种或一种以上的混合物为活性成份，I为：双－(2，3－二溴－4，5－二羟基卞基)－醚；II为：2，2’，3，3’－四溴－4，4’，5，5’－四羟基二苯甲烷；III为：2，2’，3－三溴－3’，4，4’，5－四羟基－6’－乙氧甲基二苯甲烷；IV为：3－溴－4，5－双－(2，3－二溴－4，5－二羟基卞基)－邻苯二酚。本发明证明了PTP1B可作为筛选治疗糖尿病治疗药物的新的作用靶点，也证实了溴酚类化合物是理想的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂，是潜在的治疗和预防糖尿病及肥胖症的药物。

Description

溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及一种用作蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂的溴酚类化合物(和它们的药学上可接受的盐、酯、醚和其它明显的化学等价物)及其制备和应用。这些化合物及它们的衍生物是蛋白质酪氨酸磷酸酯酶的抑制剂，能够用于治疗和预防糖尿病及肥胖症。

背景技术

蛋白质酪氨酸磷酸化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，细胞通过蛋白质酪氨酸磷酸化可调节信号转导。酪氨酸磷酸化是一个可逆的动态过程，受作用相反的一对酶即蛋白质酪氨酸激酶(PTK)和蛋白质酪氨酸激酶(PTP)所调节。PTK，PTP及各自相应底物共同组成一个信号网络，调节体内细胞生长、分化、代谢、细胞周期、细胞间通讯、细胞迁移及基因转录、离子通道活动、免疫应答等过程。这些信号网络的任何环节出现不协调，都有可能导致异常的酪氨酸磷酸化，最终引起包括癌症和糖尿病在内的多种疾病的发生。

由于多种PTK与疾病的发生和疾病的发展有关，因此常作为新的药物发现的靶点。很多针对特定PTK的小分子抑制剂，已处于不同的临床开发阶段。尽管PTP也是信号传导途径中的组成成份，但直到最近，人们才逐渐认识到它在人类健康中的重要性。生物化学和遗传学研究表明，PTP在信号途径中具有双向作用，在多种哺乳动物组织和细胞的生理活动中扮演重要角色。更重要的是，PTP功能失调会导致体内的病理改变，因此，可以将PTP作为一种新的靶点，用以开发具特异性作用模式的药物。

最近完成的人类基因组初步序列分析结果发现，人类共有112种PTP。迄今为止，很多PTP的晶体结构得以确定。PTP1B是第一个被鉴定的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶(Protein tyrosine phosphatase)。遗传学及生化研究表明，PTP1B可作为胰岛素信号的负调控因子，参与糖代谢。II型糖尿病的主要表现是严重的胰岛素抵抗和胰岛素受体信号受损，PTP1B活性的增高可能是它的一个致病因素。进一步的研究表明，在PTP1B摘除鼠的骨骼肌和肝脏中，胰岛素受体的自身磷酸化增加，而且对胰岛素的敏感性也提高。无PTP1B鼠的肥胖倾向明显降低，而且免患饮食诱导性肥胖症。另外也发现，PTP1B功能缺乏的小鼠发育良好，且具有正常的繁殖能力，癌症的发生率也未见提高。因此，PTP1B作为胰岛素信号的负调控因子，其小分子抑制剂可能是有效的抗糖尿病和肥胖症制剂，而且不产生副作用。这些研究结果为开发以PTP1B为靶点的治疗药物提供了理论依据。

松节藻科(Rhodomelaceae)海藻富含溴酚类物质，广泛分布于中国、日本、朝鲜半岛及大西洋北岸。关于其中的溴酚类化合物的报道，早期的研究较多，主要涉及了溴酚化合物的抗微生物活性、抗附生作用和抗拒食性。松节藻Rhodomela confervoides为红藻门松节藻科松节藻属海藻，广泛分布于我国北方沿海。二十世纪六十年代人们对同属海藻Rhodomela larix中的溴酚类化合物进行了系统研究，在随后的20余年里，很少有该属海藻化学成份的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种作为蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂的溴酚类化合物及其制备，，以及能够用于治疗和预防糖尿病及肥胖症的用途。

申请人在对山东沿海海藻抗肿瘤活性筛选中发现，松节藻提取物具有较强的细胞毒活性和抗菌活性，表明其体内可能存在某种具有重要生物活性的物质，于是采集了这种海藻，进行了一系列的分离纯化及多种活性跟踪筛选。经活性筛选研究表明，松节藻提取物除具有较强的肿瘤细胞毒和抗菌活性外，还在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制模型试验中表现惊人的活性，这就提示说松节藻中存在高活性的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂。进一步分离纯化，从中得到4个溴酚化合物，分别为：I式为：双-(2，3-二溴-4，5-二羟基卞基)-醚(Bis(2，3-dibromo-4，4-dihydroxybenzyl)ether；II式为：2，2’，3，3’-四溴-4，4’，5，5’-四羟基二苯甲烷(2，2’，3，3’-tetrabromo-4，4’，5，5’-tetrahydroydiphenyl methane)；III式为：2，2’，3-三溴-3’，4，4’，5-四羟基-6’-乙氧甲基二苯甲烷(2，2’，3-tribromo-3’，4，4’，5-tetrahydroxy-6’-ethyloxymethyldiphenylmethane)；IV式为：3-溴-4，5-双-(2，3-二溴-4，5-二羟基卞基)-邻苯二酚(3-bromo-4，5-bis(2，3-dibromo-4，5-dihydroxubenzyl)-pyrocatechol)。其中后两者为新化合物。

溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，以上列四个溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物(盐、酯、醚和其它等价化合物)之一种或一种以上的混合物为活性成份，上列四个溴酚类化合物的结构式如下：

上述溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物的任一单体或其混合物可作为蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂，可用于制备治疗和预防糖尿病或肥胖症的医学药物中；其可与医药上可接受的药物载体混合制成片剂、胶囊剂、口服液、栓剂、注射剂等各类制剂。

上述溴酚类化合物可从海洋红藻松节藻中(Rhodomela confervoides)分离获得(上述溴酚类化合物以混合物形式存在)；也可以利用化学方法人工合成其单体、混合物及它们的衍生物。

从海洋红藻松节藻中分离获得上述溴酚类化合物的具体操作过程为：

1.采集松节藻原料，风干后，用95％乙醇提取三次，每次72小时；提取液40℃下减压干燥，得到乙醇提取物；提取物溶于水中，用乙酸乙脂萃取，得到乙酸乙酯相和水相；乙酸乙脂相减压干燥后进行硅胶柱分离，先用石油醚洗脱，然后在洗脱液中逐渐增加丙酮的含量，一直到两者的比例为1∶1，然后改用氯仿∶甲醇(5∶1)洗脱，逐渐增加甲醇的量，一直到纯甲醇。

2.石油醚∶丙酮为1∶1洗脱部分，放置后有大量结晶体析出，将晶体滤出，母液凝胶柱分离，制备型液相纯化后得化合物I，经结构鉴定为：双-(2，3-二溴-4，5-二羟基卞基)-醚(Bis(2，3-dibromo-4，4-dihydroxybenzyl)ether)。

3.氯仿∶甲醇(5∶1)洗脱部分，进一步硅胶柱分离，用氯仿∶甲醇为10∶1洗脱，薄层跟踪鉴别，得到一纯化合物2，经结构鉴定为：2，2’，3，3’-四溴-4，4’，5，5’-四羟基二苯甲烷(2，2’，3，3’-tetrabromo-4，4’，5，5’-tetrahydroydiphenyl methane)。

4.氯仿∶甲醇为3∶1洗脱部分，进一步硅胶柱层析，然后纯结晶去除晶体，母液用制备型高效液相分离得到化合物3，经结构鉴定为一新的化合物：2，2’，3-三溴-3’，4，4’，5-四羟基-6’-乙氧甲基二苯甲烷(2，2’，3-tribromo-3’，4，4’，5-tetrahydroxy-6’-ethyloxymethyldiphenylmethane)。

5.氯仿∶甲醇为3∶1的第二个部分，进一步硅胶柱层析及Bio-BeadsSX(200～400目)色谱分离，然后用制备型液相分离获得化合物4，经结构鉴定为一新的化合物：3-溴-4，5-双-(2，3-二溴-4，5-二羟基卞基)-邻苯二酚(3-bromo-4，5-bis(2，3-dibromo-4，5-dihydroxubenzyl)-pyrocatechol)。

6.体外抑制蛋白质酪氨酸磷酸酯酶活性试验：PTP1B是从大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白。采用紫外底物PNPP，观察上述不同化合物对重组酶的活性抑制，以初步评价化合物的药用效果。PTP1B水解底物PNPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收，因此可以直接检测410nm处吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制作用。试验结果提示这些化合物有极强的抑制PTP1B活性，即有促进胰岛素受体磷酸化、增强胰岛素敏感性的作用。

本发明所述溴酚类化合物的体外抑制PTP1B酶试验及体内降糖试验研究表明，上述化合物不论是单体或它们的混合物均表现明显的体外抑制PTP1B活性及体内降低模型高血糖动物血糖水平，为证明可将该类化合物用于治疗和预防糖尿病及肥胖症提供了坚实的理论和试验基础。通过本发明，不仅充分证明了PTP1B可作为筛选治疗糖尿病治疗药物的新的作用靶点，也证实了松节藻中的溴酚类化合物是理想的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂，是潜在的新的治疗和预防糖尿病及肥胖症的药物。

具体实施方式

本发明可通过下列实施例进一步证实：

实施例1：溴酚化合物的提取

取风干后的松节藻15kg，用95％乙醇室温浸泡提取3次，每次72小时；减压回收溶剂后，将提取物(723g)悬浮于蒸馏水(1.5L)中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，先用石油醚-丙酮(100∶0～1∶1)和氯仿-甲醇(100∶0～0～100)梯度洗脱，薄层色谱检查合并相同部分。氯仿∶甲醇5∶1洗脱部分、氯仿∶甲醇3∶1洗脱部分、石油醚∶丙酮2∶1洗脱部分、石油醚∶丙酮1∶1洗脱部分分别经过硅胶柱反复层析得化合物I(1082mg)、II(1171mg)、III(2644mg)、IV(776mg)。

实施例2：溴酚类化合物体外抑制蛋白质酪氨酸磷酸酯酶活性试验：

PTP1B：为大肠杆菌中表达并纯化的GST融合蛋白；

底物：PNPP

阳性参照物：正钒酸钠(2μM)

试验原理：PTP1B水解底物PNPP的磷脂得到的产物在410nm处有很强的光吸收，因此可以直接检测410nm处吸收的变化以观察酶的活性变化以及化合物对其的抑制作用。

试验方法：取上述4种溴酚类化合物，分别用磷酸盐缓冲液配制200μM和20μM2个供试品溶液。

表1： 体外抑制蛋白质酪氨酸磷酸酯酶活性试验

样品编号	PTP1B抑制率％(200μM)	PTP1B抑制率％(20μM)	IC50
				1	102.9	59.7	1.5μM
2	84	62.1	2.4μM
				3	108.6	98.8	0.84μM
4	90.6	75.4	1.7μM

试验结果表明：样品在抑制蛋白质酪氨酸磷酸酯酶活性方面明显高于传统的蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂正钒酸盐。

实施例3  松节藻总溴酚化合物的体内降低血糖试验

动物：昆明种小白鼠40只。

模型：链脲霉素所致小鼠糖尿病模型

具体操作如下：

取体重20～24g昆明种小白鼠40只，分为正常对照组、供试品1(4.0g/kg)、供试品2(2.0g/kg)组。正常对照组腹腔注射生理盐水，其余各组腹腔注射链脲素(130mg/kg)，48小时后从小鼠眼眶静脉取血，分离血清，测定血清葡萄糖水平。然后给药组每天灌胃给药1次，正常对照组和模型组给予等体积蒸馏水，连续10天。于第11天禁食16小时后，从小鼠眼眶静脉丛取血，离心取血清，按临床试剂盒方法测定血糖水平，结果见表2。

表2 松节藻总溴酚化合物对链脲素所致糖尿病小鼠血糖的影响(X±S，n＝10)

		血糖浓度mmol/L
				组别	剂量	给药前	给药后
对照组		3.52±1.22	3.68±1.39
				模型组		23.36±6.88	9.85±5.23**
剂量1	2.0g/kg	23.74±7.41	6.42±1.25*
				剂量2	4.0g/kg	23.19±5.33	7.38±2.01*

与对照组比较：**P＜0.001；与模型组比较：*P＜0.05

由表2可见，与模型组比较，松节藻总溴酚化合物大小剂量组对链脲霉素所致的糖尿病小鼠血糖升高具有明显的抑制作用，具有较好的降血糖治疗作用。

Claims (5)

1.溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，其特征在于：以下列四个溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物之一种或一种以上的混合物为活性成份，四个溴酚类化合物的结构式如下：

2.按照权利要求1所述溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述四个溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物的任一单体或混合物用于制备治疗和预防糖尿病或肥胖症的医学药物中。

3.按照权利要求2所述溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述四个溴酚类化合物及其药学上可接受的衍生物可与医药上可接受的药物载体混合制成片剂、胶囊剂、口服液、栓剂或注射剂。

4.按照权利要求1所述溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，其特征在于：所述溴酚类化合物是从海洋红藻中分离获得。

5.按照权利要求4所述溴酚类化合物在蛋白质酪氨酸磷酸酯酶抑制剂中的应用，其特征在于：溴酚类化合物从海洋红藻中分离的具体操作过程如下，

取风干后的松节藻，用95％乙醇室温浸泡提取；减压回收溶剂后，将提取物悬浮于蒸馏水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取；乙酸乙酯萃取物进行硅胶柱层析，先用石油醚—丙酮体积比100∶0～1∶1和氯仿—甲醇体积比100∶0～0∶100梯度洗脱，薄层色谱检查合并相同部分；氯仿∶甲醇5∶1洗脱部分、氯仿∶甲醇3∶1洗脱部分、石油醚∶丙酮2∶1洗脱部分、石油醚∶丙酮1∶1洗脱部分分别经过硅胶柱反复层析得权利要求1中化合物I、II、III和IV。