KR101140753B1

KR101140753B1 - 악액질 치료에서 라노스테인 및 복령 추출물의 용도

Info

Publication number: KR101140753B1
Application number: KR1020100040724A
Authority: KR
Inventors: 항칭 린
Original assignee: 신파 티엔리 파머슈티컬 컴퍼니 리미티드 (항저우)
Priority date: 2009-05-02
Filing date: 2010-04-30
Publication date: 2012-05-03
Also published as: EP2246047B1; CN101874807A; CN101874807B; JP2010260859A; US8658629B2; EP2246047A1; KR20100119845A; US20100279992A1; WO2010127557A1; JP5313201B2

Abstract

본 발명은 악액질을 치료하기 위한 조성물, 특히 암 악액질을 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 이 조성물은 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 함유한다. 라노스테인 화합물의 적절한 원료는 대사산물들로부터의 복령 추출물, 균핵 또는 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 발효 생성물이다. 복령 추출물은 추출물이 중량으로 1-60%의 라노스테인 화합물들 함유하고 세코라노스테인이 없다.

Description

악액질 치료에서 라노스테인 및 복령 추출물의 용도{USE OF LANOSTANE AND PORIA EXTRACT IN TREATING CACHEXIA}

본 발명은 소모성 질환(악액질 및 식욕 감퇴) 및 특히 암에 의해 유발된 악액질의 예방 및/또는 치료를 위한 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 성분으로서 라노스테인 화합물을 포함한다. 라노스테인 화합물의 적절한 원료는 복령(poria) 추출물이다. 또한, 라노스테인 화합물은 동충하초(Cordyceps sinensis), 장지 버섯(Antrodia cinnamomea) 또는 영지(Ganoderma lucidum)로부터 얻을 수 있다.

악액질은 건강하지 않은 피곤한 상태이고, 질환들 및 내분비 시스템과 면역시스템의 변화에 의한 식욕 감퇴에 의해 주로 유발되어, 소모증, 근육 및 내장 단백질의 감소를 일으키고, 마지막으로 체중의 감소를 일으킨다.

악액질은 만성 질환 또는 중증을 가진 환자들에서 발견되는 증상이다. 암 환자들 중에서 특히 위암 또는 췌장암을 가진 환자들의 경우, 약 70% 환자가 이런 증상을 나타낼 것이다. 암의 말기에서, 80% 환자들이 어떤 종류의 암이든 악액질을 나타낼 것이다. 악액질은 환자에 대한 음식량을 증가시키고 영양물 섭취를 강화시켜도, 환자의 체중의 감소를 막거나 종료시키는 방법이 없는 것을 특징으로 한다. 호르몬성 식욕 강화제(hormonal appetite enhancer)(메지스트롤, 메드로옥시프로게스테론 아세테이트)가 치료에 주로 사용되나, 어떤 사람은 이것이 체중의 일시적 증가만을 일으키고(물과 지방만 증가), 신체 근육의 증가가 없고 활성 능력과 신체 능력에 대한 개선이 없는 것을 지적하였다. 반대로, 혈전, 부종, 출혈 및 고혈압 등과 같은 일부 약물 부작용들이 발견된다.

이화 소모증(Catabolic wasting) 또는 악액질은 지방과 골 근육의 자발적인 진행성 소모, 영양분 이입을 증가시키는 난치성 체중 감소, 휴식대사량(REE)의 증가, 단백질 합성의 감소, 탄수화물 대사의 변화(코리 사이클 활성 증가), 단백질 용매를 통한 ATP-유비퀴틴 프로테아좀 경로(ATP-ubiquitin dependent proteasomes pathway)의 과다 대사 및 지방 용매를 통한 지방 조직의 과다대사를 특징으로 하는 증상이다(Body JJ, Curr Opin Oncol 11: 255 - 60, 1999, Muscaritoli M, et al: Eur J Cancer 42:31 - 41, 2006). 일반적으로, 환자는 적어도 5% 또는 5 파운드 체중 감소가 있을 때까지 악액질로 진단되지 않을 것이다. 암 환자들 중 적어도 절반은 특정 수준의 이화 소모증을 경험하며, 폐, 췌장 및 위장관 악성 질환의 경우에 더 높은 공격 비율이 발견된다(Dewys WD, et al: Am J Med 69: 491 - 7, 1980). 상기 증상은 AIDS와 같은 면역결핍질환을 가진 환자들 및 박테리아 및 기생충 질환, 류마티스 관절염, 창, 간, 폐 및 심장과 관련된 만성 질환을 가진 환자들에서 발견된다. 악액질은 또한 노화 상태 또는 신체 손상 또는 화상의 결과일 수 있는 식욕 감퇴와 관련이 있다. 악액질 증상은 환자의 작용 능력과 삶의 질을 감소시키고, 발기 상태를 떨어뜨리고 약물 내성을 감소시킨다. 악액질의 수준은 환자의 생존 시간과 반비례하며, 주로 나쁜 예후를 의미한다. 최근에, 노화 및 불구와 관련된 질환들은 건강 관리에 중요한 문제가 되었다.

식욕 감퇴(식욕 손실의 의학적 용어)는 여러 악성 질환들의 악화 상태이고 암, 전염성 질환, 만성적 기관 고장 및 외상을 가진 환자들에서 종종 발견된다. 식욕 감퇴는 칼로리 흡수 감소와 영양 장애를 유발할 것이기 때문에 심각한 증상이다. 식욕 감퇴의 증상들은 임신 기간 및 후각의 감소, 조기 포만감, 배고픔 감소 및 완전한 음식 혐오를 포함하며 구역질 및 구토가 일부 경우에 발견될 수 있다. 식욕 감퇴의 이유들은 잘 알려져 있지 않고 효과적인 치료를 위해 사용할 수 있는 선택사항이 제한적이다. 일부 연구는 호르몬, 사회적 인자 및 생리학적 인자의 조합은 이런 증상의 개시와 진행에 대한 중요한 인자일 수 있다는 것을 언급하였다.

악액질 개시와 종양 크기, 질환 단계, 악성 질환의 형태와 기간 사이에 일치하는 상관관계가 주로 실제로 암과 관련이 있다는 것은 분명하지 않다. 암 악액질은 주로 칼로리 흡수의 감소, 휴식대사량의 증가 및 단백질, 지방 및 탄수화물의 대사 변화와 주로 관련이 있다. 예를 들어, 탄수화물들의 일부 현저한 이상은 전체 글루코오스 변환의 증가, 당신생(glyconeogenesis)의 증가, 내당능장애(glucose impaired tolerance )및 고혈당을 포함한다. 현저한 이상은 주로 지방 용매의 증가, 유리 지방산과 글리세롤의 변환 증가, 고지혈증 및 지단백 분해효소 활성의 감소가 발견된다. 악액질-관련 체중 감소는 체지방 저장 감소에 의해 유발될 뿐만 아니라 신체 전체 단백질 양 감소 및 전반적 골격근 소모와 관련이 있다는 것이 중요하다. 단백질 전환의 증가와 아미노산 산화의 손상된 제어는 이런 증상 악화에 대한 중요한 인자들일 수 있다. 또한, 암들에 일치하여 생산된 염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines)(종양 괴사 인자-α(TNF-α), 인터루킨-1, 인터루킨-6 및 γ-인터루킨), 급성 단계 단백질(acute phase protein)(예를 들어, C-반응성 단백질) 및 특이적 프로스타글라딘과 같은 특정 호스트 영향 인자들이 암 악액질과 관련이 있다.

중국 전통 약초 의학에서, 노인은 매일 복령(Poria galenical)을 섭취하며, 이것이 병에 쉽게 걸리지 않는 것뿐만 아니라 노화 지연을 돕고 장수를 도울 것이라고 권해진다.

EP 1535619 A1에서 본 출원의 출원인은 유효 성분으로서 라노스테인 화합물을 함유하는 신체에서 면역성을 강화시키기 위한 약학적 조성물을 개시한다.이 조성물은 면역성을 강화시킬 수 있고 바이러스 감염의 예방 및 치료에 효과적이다. 반면에, 복령 추출물 및 이로부터 정제된 라노스테인은 면역성에 대한 효과를 나타내며 IGE-매개 알레르기(천식)의 예방 및 치료에 효과적이다. 이런 억제 효과는 US 2009 0318399A1 및 WO 2009/155/730 A1에 개시된다. 이런 출원들은 복령 추출물 및 라노스테인들이 면역성을 조절할 수 있다는 것을 나타낸다. US 2009/0247496-A1 및 WO 2009/124420 A1에서 본 발명의 출원인은 복령 추출물 및 이로부터 정제된 라노스테인들은 인간 장에 효과를 가지며 영양물의 흡수: 글루코스, 아미노산들 및 비타민들(엽산)의 흡수를 향상시킨다.

따라서, 복령 추출물 성분, 특히 라노스테인 화합물들은 영양학 및 면역학과 관련된 악액질을 개선하고 치료하는 것을 도울 수 있다. 본 발명에서, 복령 추출물 성분 및 라노스테인 화합물들이 악액질에 대한 치료 효과가 있는지 없는지는 인간 폐암 세포들을 이식한 생쥐들로 실험들을 수행함으로써 평가되었고, 인간 폐암 세포가 이식된 생쥐들은 정상 생쥐들과 비교하여 점진적인 체중 감소 없이 정상 식욕을 갖는지 정상 체중을 갖는지에 대해 관찰되었다.

본 발명의 주요 목적은 소모성 질환(악액질 및 식욕 감퇴), 특히 암에 의해 유발된 악액질의 예방 또는 치료의 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 소모성 질환(악액질 및 식욕 감퇴), 특히 암에 의해 유발된 악액질의 예방 또는 치료에서 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로부터 제조된 복령 추출물의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 소모성 질환(악액질 및 식욕 감퇴), 특히 암에 의해 유발된 악액질의 예방 또는 치료에서 라노스테인의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 포유류에서 소모성 질환(악액질 및 식욕 감퇴)의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에서, 다음 화학식(I)을 가진 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용도를 개시한다:

(I)

여기서, R₁은 H 또는 -CH₃이고; R₂는 -OCOCH₃, =O, 또는 -OH이고; R₃는 -H 또는 -OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a이고, 여기서 R_a는 -H 또는 -OH, 또는 -CH=C(CH₃)R_b, 여기서 R_b는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이고; R₅는 -H 또는 -OH이고, R₆는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이다.

바람직하게는, 라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가진다:

또는

.

바람직하게는, 상기 의약은 1-60%의 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 상기 의약은 활성 성분으로서 분리된 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

바람직하게는, 상기 의약은 경구로 투여된다.

바람직하게는, 상기 의약은 라노스테인 화합물(I)의 원료로서 복령 추출물을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 복령 추출물은, 복령 추출물의 중량을 기초로, 1-60%의 라노스테인 화합물(I)을 포함하며 세코라노스테인(secolanostane)이 실질적으로 없다.

바람직하게는, 상기 복령 추출물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다:

a) 물, 메탄올, 에탄올 또는 이의 혼합 용매에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 대사 산물들, 발효 생성물들 또는 균핵(sclerotium)을 추출하는 단계;

b) 단계 a)로부터의 얻은 액체 추출물을 농축하는 단계;

c) 단계 b)로부터 농축된 물질을 실리카겔 컬럼에 주입하는 단계;

d) 낮은 극성을 가진 용출액으로 실리카겔 컬럼을 용출하고 결과로 얻은 용출물을 수집하는 단계; 및

e) 농축 용출물을 형성하기 위해 용출물을 농축하는 단계.

바람직하게는, 단계 e)로부터의 농축 용출물은 다이클로로메테인 : 메탄올 = 96 : 4의 혼합 용매에 의해 성장되고 자외선 램프 및 요오드 증기에 의해 탐지되는 박층 크로마토그래피에 따라 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진다.

바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 95% 에탄올을 사용하여 수행된다.

바람직하게는, 단계 a)의 추출하는 단계는 물을 끓임으로써 대사산물들, 발효 생성물들 또는 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)의 균핵을 추출하는 단계; 염기를 pH 값이 9-11일 때까지 얻은 추출 수용액에 첨가하는 단계; 염기성 수용액을 회수하는 단계; 침전물을 형성하기 위해 산을 pH 값이 4-6이 될 때까지 염기성 수용액에 첨가하는 단계; 침전물을 회수하는 단계; 침전물을 에탄올로 추출하는 단계; 및 액체 추출물을 회수하는 단계를 포함한다.

바람직하게는, 단계 b)로부터 얻은 농축 물질은 1:1의 부피 비로 메탄올과 n-헥세인을 함유하는 2상 용매로 추가로 추출하고, 메탄올 층은 2상 용매 추출 혼합물로부터 분리하고 메탄올 층은 농축되어 농축물을 형성하며, 이 농축물은 단계 c)에서 실리카겔 컬럼에 대한 원료로 사용된다.

바람직하게는, 단계 d)의 낮은 극성의 용출물은 96.5:3.5의 부피 비로 다이클로로메테인 및 메탄올을 함유하는 혼합 용매이다.

바람직하게는, 상기 복령 추출물은 5-35%의 라노스테인 화합물(I)을 포함한다.

바람직하게는, 의약은, 예를 들어, 글루코오스, 아미노산, 비타민 또는 이의 조합인 영양물을 더 포함한다.

바람직하게는, 포유류는 인간이다.

바람직하게는, 본 발명의 소모성 질환은 악액질이고; 더욱 바람직하게는, 악액질은, 폐암, 위암, 췌장암, 직장암, 유방암, 구강암 또는 비인두암과 같은 암에 의해 유발된다.

바람직하게는, 본 발명의 소모성 질환은 암, 식욕 감퇴, 노화, 신체손상 또는 화상에 의해 유발된다.

바람직하게는, 본 발명의 의약의 복용량은 인간에게 투여하기 위한 활성 성분으로서 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 적어도 8.4mg/day의 양이다.

바람직하게는, 본 발명의 의약은 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 더 포함한다.

본 발명은 암 한자들에서 식욕 감퇴, 체중의 심각한 감소를 치료하기 위해 화학식(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 상기 복령 추출물을 사용한다. 암 이외에, 악액질-관련 질환은 AIDS, 노화, 류마티스 관절염, 폐결핵, 섬유 낭종, 크론병, 전염성 질환 등에 의해 유발된 악액질을 포함한다. 수술 또는 화학요법 또는 방사선요법을 받은 암 환자들에 의해 유발된 소모성 상태를 향상시키기 위해 영영 보충제(아미노산, 글루코오스 및 비타민)를 갖는 것이 필요하다. 본 발명의 활성 성분은 분유, 드링크 또는 영양 보충을 위한 식품 속에 첨가될 수 있다. 또한, 의료용을 위해서, 활성 성분은 정제, 캡슐, 과립, 증류주, 주사액 등으로 제제화될 수 있다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

도 1은 실시예 7의 제 1 검사에서 각 그룹 생쥐들에서 생쥐의 체중 변화를 도시하며, +는 블랭크 그룹(blank group)을 나타내고; 검은 원은 대조군 그룹을 나타내고; 마름모, 정사각형 및 삼각형은 각각 약물 투여 그룹 PC-A, PC-B 및 PC-C를 나타내며, 생쥐들은 체중(kg)당 각각 17.6mg, 8.8mg 및 4.4mg의 양으로 라노스테인을 투여받았다.
도 2는 실시예 7의 제 2 검사에서 각 그룹 생쥐들에서 생쥐의 체중 변화를 도시하며, 마름모는 블랭크 그룹을 나타내고; 정사각형은 대조군 그룹을 나타내고; 삼각형은 약물 투여 그룹 PC-D를 나타내며, 생쥐들은 체중(kg)당 8.8mg의 양으로 라노스테인을 투여받았다.
도 3은 실시예 7의 제 2 검사에서 각 그룹 생쥐들에서 생쥐의 음식 섭취 변화를 도시하며, 마름모는 블랭크 그룹을 나타내고; 정사각형은 대조군 그룹을 나타내고; 원은 약물 투여 그룹 PC-D를 나타내며, 생쥐들은 체중(kg)당 8.8mg의 양으로 라노스테인을 투여받았다.
도 4는 22일에 실시예 7의 제 1 검사에서 각 그룹에서 생쥐들의 혈액 알부민 농도를 도시한다.
도 5는 22일에 실시예 7의 제 2 검사에서 각 그룹에서 생쥐들의 혈액 알부민 농도를 도시한다.
도 6은 임상 의사에 의해 PG-SGA 분석법(Patient-Generated Subjective Global Assessment)에 따라 평가된 실시예 8의 그룹 I 암 환자들(화학요법 + 하나의 복령 추출물 캡슐)의 전체 영양 상태의 평가를 도시한다.
도 7은 임상 의사에 의해 PG-SGA 분석법(Patient-Generated Subjective Global Assessment)에 따라 평가된 실시예 8의 그룹 II 암 환자들(화학요법 + 두 개의 복령 추출물 캡슐)의 전체 영양 상태의 평가를 도시한다.
도 8은 임상 의사에 의해 PG-SGA 분석법에 따라 평가된 실시예 8의 대조군 그룹 암 환자들(화학요법)의 전체 영양 상태의 평가를 도시한다.

악액질은 피곤 상태에 있는 인간 신체를 의미하며 악액질을 일으키는 원인들은 여러 이론이 있으나, 이런 매커니즘이 확실하지는 않다. 암의 경우, 암 세포들 방출 인자들 또는 암 세포들에 대한 신체의 면역 반응은 직접 또는 간접적으로 다양한 인자들의 방출을 일으켜서, 식욕 감퇴를 일으키고, 신체에서 내분비 시스템과 면역 시스템의 변화를 유발하여, 환자들이 음식 섭취를 싫어하고 따라서 근육들에서 지방과 단백질들이 점진적으로 감소하여, 점진적인 신체 피로 및 체중 감소의 현상을 유도한다고 지금까지 알려져 있다.

악액질-관련 질환들은 암, 전염성 질환(폐결핵, AIDS), 자가면역질환(류마티스 관절염), 노화, 섬유 낭종 및 크론병을 포함한다. 암 환자들의 약 70%가 이런 증상을 나타낼 것이고 위암과 췌장암을 가진 환자들에서 더욱 자주 발견될 것이다. 말기 암 상태에서는, 어떤 종류의 암이든 약 80%의 암 환자들이 악액질을 나타낼 것이다. 치료에 사용된 영양물을 증가시키기 위해 음식 섭취를 증가시키거나 또는 튜브를 통한 식사 제공 또는 정맥 주사를 통한 다른 방법에 의해서도, 환자의 체중의 감소를 막거나 종료시키는 방법은 없다. 호르몬성 식욕 강화제(메지스트롤, 메드로옥시프로게스테론 아세테이트)는 주로 치료에 사용되나, 어떤 사람은 이것이 체중의 일시적 증가만을 일으키고(물과 지방만 증가), 신체 근육의 증가가 없고 활성 능력과 신체 능력에 대한 개선이 없는 것을 지적하였다. 반대로, 혈전, 부종, 출혈 및 고혈압 등과 같은 일부 약물 부작용들이 발견된다.

본 발명에 개시된 포유류들(예를 들어, 인간)에 의한 영양물 섭취를 향상시키는 복령의 추출물은 미정제 추출물을 얻기 위한 종래의 추출 방법에 의해 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)을 추출하는 단계, 크로마토그래피에 의해 미정제 추출물을 낮은 극성 부분의 라노스테인(96:4의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로) 및 높은 극성 부분의 세코라노세테인(90:10 및 0:100의 다이클로로메테인:메탄올의 용출액으로)으로 분리하는 단계를 포함하는, US2004/0229852A1에 개시된 것과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있고, 라노스테인 부분은, 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용매에 의해 전개될 때, 적어도 0.1의 크로마토그래피 값, Rf를 가진 박층 크로마토그래피에 의해 탐지되며, Rf는 세코라노스테인 부분의 경우 0.1 미만이다. 여러 라노스테인은 라노스테인 부분을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출시킴으로써 라노스테인 부분과 분리되며, 사용된 용출액은 97:3 내지 95:5이다.

다음 실시예들은 본 발명을 더욱 상세하게 기술하기 위해 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는데 사용되지 않아야 한다.

본 명세서에서 언급한 백분율과 다른 양은 달리 나타내지 않는 한 중량이다. 백분율은 전체 100%에 대해 사용된 임의의 범위로부터 선택된다.

실시예 1

연난(Yunnan)에서 자란 26kg의 복령을 260리터의 75% 수성 알콜 용액으로 가열하면서 추출하였다. 추출을 3회 반복하였다. 결과로 얻은 세 추출 용액을 혼합하고 진공 농축하여 225.2g의 추출물을 얻었다. 추출물에 대해 정량 분석을 뒤이어 수행하여, 76.27mg의 라노스테인이 추출물의 각 그램당 발견될 수 있다고 나타내었고, 여기서 K1(파침산(pachymic acid))이 33.4mg을 차지하였고; K1-1(디하이드로파침산)이 9.59mg을 차지하였고; K2-1(투물로스산(tumulosic acid))이 19.01mg을 차지하였고; K2-2(디하이드로투물로스산)이 6.75mg을 차지하였고; K3(폴리포렌산 C)이 5.06mg을 차지하였고 K4(3-에피디하이드로투물로스산)가 2.46mg을 차지하였다.

실시예 2

실시예 1의 125g의 알콜 추출물을 1.3리터의 다이클로로메테인으로 6회 추가로 세척하였고; 결과로 얻은 추출 용액을 혼합하고 농축하여 22.26g의 추출물을 얻었다. 다이클로로메테인 추출물을 가열된 95% 알콜에 용해하고 냉각한 후 여과하고 불용성 물질들을 버렸다. 알콜 농도가 45%에 도달할 때까지 소량의 물을 여과물에 첨가하여 침전하였고; 이를 통해 17.4g의 침전물을 원심분리하여 얻었다. 침전물에 대한 뒤이은 정량적 분석들은 침전물의 각 그램이 264.78mg의 라노스테인으로 구성되었다는 것으로 나타내었고, 여기서 K1-1이 159.7mg을 차지하였고; K1-2가 56.96mg을 차지하였고; K2-1이 24.43mg을 차지하였고; K2-2가 8.8mg을 차지하였고; K3가 9.84mg을 차지하였고 K4가 5.05mg을 차지하였다. 실리카겔에 의한 박층 크로마토그래피(TLC)의 방법은 침전물이 어떠한 세코라노스테인을 포함하지 않았다는 것을 확인하는데 사용하였다.

실시예 3

100kg의 복령을 3시간 동안 800kg의 물로 끓인 후 50℃로 냉각시키기 위해 방치하고 이의 pH 값을 5N NaOH 용액을 사용하여 pH 11로 조절하고 결과로 얻은 용액을 3시간 동안 교반하였다. 원심분리기를 사용하여 액체를 고체로부터 분리하고 800kg의 물을 분리된 고체에 첨가하였다. 상기 절차를 반복하였고, pH 값을 NaOH로 pH 11로 조절하는 단계, 교반하는 단계 및 원심분리로 고체를 제거하는 단계를 포함하였다. 두 개의 결과로 얻은 액체를 혼합하고 50℃에서 100kg의 용액으로 진공 농축하였고 pH 값을 3N HCl를 사용하여 pH 6.5로 조절하여 침전물을 생성하였다. 상기 침전물을 용액으로부터 분리하고, 뒤이어 40L H₂O로 세척하고 원심분리하여 침전물을 얻었다; 침전물을 8L의 물로 분사 건조하여 380g의 분말을 얻었다. 그 후, 분말을 4L의 알콜을 사용하여 3회 추출하였고 추출 용액들을 혼합하고 농축하여 238.9g의 알콜 추출물을 얻었다. 238.9g의 알콜 추출물은 TLC 분석에 의해 세코라노스테인 화합물들을 함유하지 않는 것으로 입증되었고 HPLC 분리하여, 추출물의 그램당 2l4mg의 K2, 23mg의 K3, 24mg의 K4 및 4.52mg의 K1을 나타내었다. 다시 말하면, 추출물의 각 그램은 대략 265mg의 라소스테인 화합물을 가진다.

분말은 4L의 50% 수성 알콜 용액을 사용하여 추출하였고 50% 수성 알콜 용액을 제거하여 불용성 분말을 얻었다; 추출을 3회 반복하여 50% 수성 알콜 용액에 불용성인 물질 245.7g을 얻었다. 불용성 물질은 TLC 분석에 의해 세코라노스테인 화합물을 갖지 않는 것으로 확인되었고 HPLC에 의해 분리되고 정제되어 추출물의 각 그램당 214mg의 K3, 23mg의 K3, 24mg의 K4 및 4.52mg의 K1를 얻었고, 이는 추출물의 각 그램당 대략 261mg의 라노스테인 화합물과 동일하다.

실시예 4

복령 분말은 30kg의 중국산 복령(Poria cocos (Schw) Wolf)으로 제조하였다. 복령 분말을 24시간 동안 120L 95% 알콜로 추출하였다. 혼합물을 여과하여 여과물을 얻었다. 잔류물을 추가 3주기 동안 추출하고 여과하였다. 여과물들을 혼합하고 농축하여 265.2g의 건조 분말을 얻었다. 건조 추출물을 2상 추출제(n-헥세인: 95% 메탄올 = 1:1)로 분배 추출하였고 메탄올 층을 제거하고, 농축하여 246.9g의 건조 고체를 얻었다. 건조 고체의 분리는 건조 고체의 중량의 10-40배 실리카겔을 채운 실리카겔 컬럼에 의해 수행하였다. 70-230 메쉬의 지름을 가진 실리카겔은 머크사에 의해 제조되었고 실리카겔 60의 기초를 가진다. 컬럼은 다음 용출액: 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액; 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10의 혼합 용액 및 순수 메탄올로 용출되었다. 용출액들은 박층 크로마토그래피(TLC)로 검사하였고, 자외선 램프와 요오드 증기가 탐지를 위해 사용되었고 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액은 전개액으로 사용되었다. TLC에서 유사한 구성물질을 가진 용출액들을 혼합하였다.

용출은 다이클로로메테인:메탄올 = 96:4의 혼합 용액으로 수행하여 78g의 양으로 PCM 부분을 얻었다. PCM은 박층 크로마토그래피에서 6개 추적점(trace points)을 나타내었다. 다이클로로메테인:메탄올 = 90:10 및 순수 에탄올의 용출액으로 수행된 용출로부터 얻은 용출액들을 혼합하여 168g의 PCW 부분을 얻었다.

PCM 부분은 다이클로로메테인:메탄올 = 96.5:3.5의 용출액과 동일한 실리카겔 컬럼에 의해 추가로 분리되어 K1(K1-1 및 K1-2), K2(K2-1 및 K2-2), K3, K4, K4a, K4b, K5, K6a 및 K6b의 정제된 라노스테인 성분들을 얻었다. 분리 단계와 확인 분석 데이터의 추가 상세내용은 US2004/0229852 A1에서 발견할 수 있다.

상기 K1 내지 K6b 화합물은 다음 구조를 가진다:

K1-1:R2 = OCOCH3(파침산) K1-2:R2 = OCOCH3(소량)

K2-1:R2 = OH(투물로스산) (디하이드로파침산)

K2-2:R2 = OH(소량)

(디하이드로투물로스산)

K3:R6 = CH3, R5 = H K4:R2 = α-OH, R5 = H

(폴리포렌산) (3-에피디하이드로투물로스산)

K4a:R6 = CH2OH, R5 = H K4b:R2 = β-OCOCH3, R5 = OH

K6a: R6 = CH3, R5 = OH

K6b K5

PCM 부분으로부터 분리된 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b의 양은 아래 표에 나열된다. PCM 부분은 대략 15중량%의 라노스테인 화합물 K1 내지 K6b를 함유한다.

K1	K2	K3	K4	K4a	K4b	K5	K6a	K6b
3.0g	6.2g	1.93g	0.55g	66mg	86.8mg	47.6mg	21.4mg	90.7mg

실시예 5

실시예 4에서 제조된 PCM 부분을 가진 캡슐들은 다음 조성물을 기초로 제조하였다:

성분들	캡슐 당	30,000 캡슐 당
실시예 4에서 제조된 PCM(대략 15중량%의 K1-K6 화합물 함유)	11.2mg	336.0g
소듐 실리코알루미네이트	5.0mg	150.0g
감자 전분	378.8mg	11,364.0g
마그네슘 스테아레이트	5.0mg	150.0g
전체	400mg	12,000.0g

PCM 부분 및 소듐 실리코알루미네이트는 #80 메쉬를 사용하여 걸러내었고 감자 전분은 #60 메쉬를 사용하여 걸러내었고 마그네슘 스테아레이트는 #40 메쉬를 사용하여 걸러내었다. 뒤이어, 상기 성분들을 혼합기에 골고루 혼합하고 결과로 얻은 혼합물을 No. 1 빈 캡슐에 채웠다. 각 캡슐은 대략 1.68mg(0.42중량%)의 유효 성분 K1-K6를 함유한다.

실시예 6

실시예 2 및 3에서 제조한 복령 추출물을 표 3에 나타낸 대로 복령 추출물의 투여 후 암을 앓고 있는 동물들의 혈청에서 체중, 음식 섭취 및 단백질 수준 및 암에 의해 유발된 악액질을 가진 환자들의 전체 영양 상태의 변화를 평가하기 위한 검사 재료로서 물질로 제제화하였다.

표 3. 검사 재료에 함유된 복령 추출물의 복용량

물질	복령 추출물^*	라노스테인의 동물 복용량	상응하는 인간 복용량
PC-A	실시예 2	17.6mg/kg	33.6mg/kg
PC-B	실시예 2	8.8mg/kg	16.8mg/kg
PC-C	실시예 2	4.4mg/kg	8.4mg/kg
PC-D	실시예 3	8.8mg/kg	16.8mg/kg

^*복령 추출물은 26%의 라노스테인 화합물들을 함유한다.

실시예 7

이 실시예는 암에 의해 유발된 악액질을 치료하기 위한 표 3에 도시된 물질들을 사용하는 동물 검사이다. 인간 암 세포 이식된 생쥐들을 사용하여 복령 추출물이 악액질에 치료 효과가 있는지 없는지를 분명하게 하였다. 인간 암 세포 이식된 생쥐들 및 정상 생쥐들의 체중, 음식 섭취 및 혈청 알부민 수준의 변화를 관찰하여 암 악액질에 대한 약물 치료 효과를 평가하였다.

실험 동물들

CB-17 SCID 생쥐(6-8주)들을 국립 타이완 대학(타이완, 타이페이)의 실험 동물 센터로부터 얻었다. 동물들을 25±2℃의 실온, 40-70%의 습도, 밝음과 어두움의 12시간 변화하에서, 물을 제한하지 않고 스테인리스 강 우리에 가뒀다. 동물들은 구입한 후 우리에서 적응기간을 가졌고 동물 체중을 무작위로 계량하였다. 유사한 체중을 가진 동물들을 무작위 수로 동일한 그룹으로 분류하였고 통계 분석에 의해 그룹들 사이에 체중의 현저한 차이가 없다는 것을 확인하였다.

인간 폐암 균주 H460의 배양

H460 균주를 액체 질소 용기로부터 제거하고 37℃ 수조에서 해동하였다. 10% FBS가 공급된 8mL의 DMEM 배지를 선택하고 10분 동안 1200rpm에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고 상청액에 세포들을 첨가하였다. 세포들을 원하는 세포 양에 도달할 때까지 37℃에서 5% CO₂로 배양 오븐에서 배양하였다.

생쥐 속으로 폐암 균주 H460의 동소 이식(Orthotopic transplantation)

생쥐들을 펜토바비탈을 사용하여 깊게 마취하였고 No.29 게이지 0.5mL 인슐린 바늘을 사용하여 0.01mL의 H460 세포주(1x10⁶/ml)를 생쥐의 흉강 속에 이식하였다. 회복시키기 위해 생쥐들을 세포 이식 이후 원래 우리 속에 두었다.

약물 제조

실시예 2에서 제조된 복령 추출물을 67.7mg 계량하고, 살균수를 10mL까지 첨가한 후 초음파 처리를 수행하여 물에 현탁된 추출물을 만들었고 PC-A 물질이라고 이름 붙였다. 5mL PC-A 물질에 10mL까지 살균수를 첨가하여 PC-B를 얻었고; 5mL PC-B 물질에 10mL까지 살균수를 첨가하여 PC-C 물질을 얻었다. 표 3에 도시된 복용량이 될 때까지 튜브 공급을 통해서 생쥐들의 체중에 따라 생쥐에게, 0.25cc 물질/25gm의 체중을 투여하였다. 검사를 2회 수행하였다. 블랭크 그룹의 생쥐들에게 증류수를 공급하였다(H460 대신에 배양 PBS를 사용하여 생쥐의 흉강 속에 주입하였다). 증류수를 사용하여 대조군 그룹의 폐암 생쥐에게 공급하였다. 공급은 No.18(5cm 길이) 강 튜브에 연결된 주사기(1cc)를 사용하여 수행하였다. 튜브 공급이 수행되었을 때, 왼손을 사용하여 생쥐 구강을 열고, 공급용 강 튜브를 위에 조심스럽게 찌른 후 물질 또는 증류수를 튜브를 통해 공급하고, 각 투여에 대한 부피를 0.3cc로 제한하였다.

제 1 검사에서, 전체 5 그룹(한 블랭크 그룹, 한 대조군 그룹 및 세 투여 그룹), 그룹 당 9마리 생쥐가 있었다. 실시예 2의 복령 추출물을 사용하여 제조된 물질 PC-A, PC-B 및 PC-C를 세 투여 그룹의 폐암 생쥐 속에 투여하였고, 각 그룹의 생쥐들에게 표 3에 도시된 대로, 체중(kg) 당 라노스테인 17.6mg, 8.8mg 및 4.4mg을 투여하였다.

제 2 검사에서, 전체 3 그룹(한 블랭크 그룹, 한 대조군 그룹 및 한 투여 그룹), 그룹 당 3마리 생쥐가 있었다. 실시예 3의 복령 추출물을 사용하여 제조된 물질 PC-D를 투여 그룹의 폐암 생쥐 속에 투여하였고, 각 생쥐들은 표 3에 도시된 대로, 체중(kg) 당 라노스테인 8.8mg을 투여하였다.

혈청 알부민 샘플의 수집

전혈을 눈의 양끝으로부터 22일에 채취하고 1시간 동안 실온에서 보관하였다. 3,000rpm에서 2회 원심분리 후, 혈청을 수집하고 나중에 혈청 알부민의 내용 분석을 할 때까지 -20℃로 저장하였다.

혈청 알부민의 농도 측정

생쥐 알부민 ELISA 키트(Bethyl Laboratories Inc., Texas, US)를 사용하여 분석을 수행하였다. 항-생쥐 알부민을 TBS로 10회 희석하고 이를 사용하여 100㎕/well을 가진 미세적정판을 덮었다. 판을 1시간 동안 실온에서 배양하고 TBST로 3회 세척한 후 차단을 위해 1% BSA 200㎕/well로 세척하였다. 1시간 동안 실온에서 배양한 후, 판을 TBST로 3회 세척하였다. 샘플들 또는 표준들을 첨가하고, 판을 1시간 동안 실온에서 배양한 후, TBST로 5회 세척하였다. 100㎕/well의 염소 항-생쥐 알부민-HRP 접합 희석액(1% BSA 및 0.05% Tween 20을 함유하는 TBS로 10,000배 희석)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 배양하였다. TBST로 5회 세척한 후, 100㎕의 기질 TMB(3,3'-5,5'-테트라메틸 벤지딘)를 첨가하고 15분 동안 암실과 실온에서 반응시켰다. 100㎕/well의 2N HCl을 첨가하여 반응을 냉각시켰다. A_450nm에서 흡수율을 측정하였다.

통계 방법

데이터를 평균 ± SD로 나타내었다. 먼저, 일원분산분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹들 사이의 변화를 검사하였다. p<0.05인 경우, 더넷 복수 범위 t-테스트(Dennett's multiple range t-test)를 사용하여 그룹들 사이의 유의 차(significance of difference)를 검사하였고, 각 그룹은 대조군 그룹과 비교하였다.

체중과 음식 섭취의 변화

제 1 및 제 2 검사에서 각 그룹에 있는 생쥐들에 대해 체중과 음식 섭취의 변화가 관찰되었다.

결과들

생쥐들의 체중 변화

제 1 검사에서, 복령 추출물의 튜브 공급 동안 폐암 생쥐들의 체중의 변화는 도 1에 도시된다. 대조군에서 생쥐의 체중은 H460 폐암 세포들의 이식 후 현저하게 감소한다. 폐암 세포 이식된 생쥐들과 비교할 때, 낮은 복용량 복령 추출물 PC-C(4.4mg/kg) 및 PC-B(8.8mg/kg)의 추가 투여는 이들 중에서 어떠한 차이도 만들지 않는다. 즉, 악액질 증상에 대한 개선이 없다. 높은 복용량 그룹(17.6mg/kg의 PC-A)에서, 체중 감소가 현저하게 느려진 것이 관찰된다. 따라서, 복령 추출물은 H460 폐암의 이식에 의해 유발된 체중 감소를 개선한다. 제 2 검사에서, 다른 복령 추출물, 추출물 PC-D(8.8mg/kg)을 사용하는 폐암 생쥐의 체중의 변화들은 도 2에 도시된다. 도 1에 도시된 대로, 체중은 H460 폐암 세포들의 이식 후 대조군 그룹에서 현저하게 감소한다. 단지 적은 체중의 증가가 정상 생쥐(H460 세포들의 이식 없는 블랭크 그룹)에서 관찰된다. 투여 그룹(PC-D 그룹)에 있는 생쥐들은 검사의 시작시와 같이 체중의 변화 없이 유지한다는 것을 발견된다. 따라서, 복령 추출물은 악액질을 치료하는데 사용될 수 있다는 것이 증명되었다.

암을 가진 생쥐들의 음식 섭취의 변화

복령 추출물의 튜브 공급 후 폐암 생쥐의 음식 섭취의 변화들은 도 3에 도시된다. 대조군 그룹에 있는 생쥐들의 음식 섭취는 H460 폐암 세포들의 이식 후 점진적으로 감소한다. 반대로, 복령 추출물 투여 그룹(PC-D 그룹)에 있는 생쥐들은 H460 폐암 세포들의 이식 후, (H460 폐암 세포들의 이식 없는) 블랭크 그룹에 있는 정상 생쥐들과 유사한 음식 섭취의 점진적인 감소를 나타낸다. 이런 두 그룹들 사이에 음식 섭취 차이가 없다. 따라서, 복령 추출물은 악액질에 의해 유발된 손상된 음식 섭취를 개선 또는 치료한다.

폐암 생쥐의 혈청 알부민 함량의 변화

제 1 검사와 제 2 검사에서, 각 그룹에 있는 생쥐들의 혈청 알부민 함량의 변화들은 도 4와 도 5에 도시된다. (H460 이식 없는) 블랭크 그룹과 비교할 때, H460 폐암 세포들이 이식된 대조군 그룹에 있는 생쥐들은 혈청 알부민 함량의 감소하는 경향을 가진다. 복령 추출물 투여 그룹(PC-A, PC-B, PC-C)에서, 혈청 알부민 함량은 라노스테인 복용량이 증가함에 따라 증가하고 현저한 증가는 17.6mg/kg의 라노스테인 복용량을 가진 PC-A 그룹에서 관찰된다. 또한, 현저한 결과는 복령 추출물 투여 그룹 PC-D(8.8mg/kg 복용량)에서 관찰된다.

동물 신체는 폐암 세포들에 대한 염증 반응을 일으키고 이런 반응은 간세포 단백질의 생산을 변화시키고, 일부 단백질들은 생산이 감소하고 일부 단백질들(또는 단백질들의 유도)은 생산이 증가한다. 따라서, 악액질을 평가하는 한 방식은 체중과 음식 섭취의 변화들 이외에 혈청 알부민을 관찰하는 것이다. 혈청 알부민의 감소는 간세포들에서 알부민 생산에 대한 폐암 세포들의 영향을 의미하며, 그 결과 알부민의 혈액으로의 방출은 감소한다. 도 4 및 5에 도시된 대로, 혈액에서 알부민 함량은 악액질을 가진 생쥐들에서 감소하나, 복령 추출물이 투여되고 악액질을 가진 생쥐들에서는 감소하지 않는다. 즉 복령 추출물은 악액질을 치료하는 기능을 가진다.

실시예 8

암에 의해 유발된 악액질의 치료에서 복령 추출물의 인간에서의 임상 연구:

(1) 환자들에서 전체 영양 상태의 개선의 관찰.

(2) 환자에서 체중의 증가의 관찰.

(A) 암 환자들과 약물 투여의 그룹화.

지속적으로 체중이 감소하는 15명 암 환자, 위암 3명, 췌장암 3명, 직장암 3명, 유방암 4명, 구강암 1명 및 비인두암 3명을 각 그룹당 5명으로 무작위로 3 그룹으로 나눴다. 그룹 I은 낮은 복용량의 복령 추출물(실시예 3에서 제조된 추출물, 16.8mg/캡슐)을 하루 당 1개 캡슐 투여하였다. 그룹 II는 높은 복용량의 복령 추출물, 하루 당 2개 캡슐을 투여하였다. 그룹 III은 복령 추출물을 투여하지 않고 대조군 그룹으로서 화학요법제를 투여받았다.

(B) 치료 단계

15명 환자들은 6주 동안 화학요법을 받았고, 그룹 I 및 II에서 환자들은 4주 동안 (단지 5 및 6주만 화학요법) 복령 추출물을 투여받았고 체중과 영양 평가는 주마다 기록하였다.

(C) 결과(1):

체중의 증가가 관찰되었고, 체중의 비교는 치료 완료(6주 또는 42일)와 치료 후 1일에 하였고, 결과는 다음과 같다:

그룹	치료방법 (화학요법)	체중 증가	체중 무변화	체중 감소
그룹 I	16.8mg의 복령 추출물 첨가	3	1	1
그룹 II	33.6mg의 복령 추출물 첨가	3	1	1
그룹 III		1	0	4

결과들로부터, 화학요법/복령 추출 그룹들에서 체중의 유지 또는 증가가 그룹 III(복령 추출물 없이 단지 화학요법)보다 뛰어났다는 것을 알게 된다. 체중 감소는 그룹 III에서 관찰되었는데, 즉 체중은 치료 후 1일보다 적었다.

(D) 결과(2): 환자들에서 전체 영양 상태의 개선

환자들의 전체 영양 상태의 개선의 평가는 임상 의사에 의해 사용된 PG-SGA(Patient-Generated Subjective Global Assessment)에 따라 하였다. 그룹 I 내지 III의 환자들은 도 6, 7 및 8에 도시된 대로, (1) 체중 증가 (2) 음식 섭취 증가 (3) 증상 완화 및 (4) 신체적 활동 증가의 전체 점수를 얻는 것으로 평가하였다. 도 6은 그룹 I(화학요법 + 복령 추출물의 한 캡슐)에서 관찰된 결과이고, 도 7은 그룹 II(화학요법 + 복령 추출물의 두 캡슐)에서 관찰된 결과이고 도 8은 그룹 III(대조군, 화학요법)에서 관찰된 결과이다. PG-SGA의 점수가 낮으면 낮을수록, 환자들에서 개선은 더 많으며, 전체 경향은 건강한 쪽으로 진행한다.

이런 치료 결과들로부터, 화학요법제와 함께 복령 추출물이 투여된 그룹들에서 관찰된 건강한/삶의 품질에서 악액질 환자들에 대한 개선은 화학요법 그룹에서 관찰된 것보다 현저하게 우수하며 통계 분석에서 현저한 의미가 있다.

이런 실시예의 결과들에 따라, 복령 추출물과 화학요법제의 조합은 암 환자들의 체중 감소를 막는 반면, 환자들의 전체 영양 상태의 개선에서의 개선은 화학요법만을 받은 환자들보다 현저하게 뛰어나다.

본 발명은 이의 바람직한 실시예들로 기술되었고 기술된 실시예들에 대한 여러 변화와 변형은 청구된 청구항들에서만 제한되는 본 발명의 범위와 취지를 벗어나지 않고 일어날 수 있다.

Claims

하기 화학 구조식 (I)을 가지는 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 활성 성분으로서 포함하는 복령 추출물을 예방 또는 치료 효과량으로 포함하는 암 악액질(cancer cachexia)의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물로서,
복령 추출물은, 복령 추출물의 전체 중량을 기준으로, 1-60%의 하기 화학 구조식 (I)을 가지는 라노스테인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하고, 상기 복령 추출물은 세코라노스테인이 없는 것인 약학적 조성물:
화학식 (I)

상기 식에서,
R₁은 H 또는 -CH₃이고; R₂는 -OCOCH₃, =O, 또는 -OH이고; R₃는 -H 또는 -OH이고; R₄는 -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a이고, 여기서 R_a는 -H 또는 -OH, 또는 -CH=C(CH₃)R_b, 여기서 R_b는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이고; R₅는 -H 또는 -OH이고, R₆는 -CH₃ 또는 -CH₂OH이다.
제 1 항에 있어서,
라노스테인 화합물(I)은 다음 화학식을 가지는 것인 약학적 조성물:

또는

.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 경구로 투여되는 것인 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
포유류는 인간인 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 복령 추출물은, 복령 추출물의 전체 중량을 기준으로, 5-35%의 라노스테인 화합물(I)을 포함하는 것인 약학적 조성물.
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 암은 폐암, 위암, 췌장암, 직장암, 유방암, 구강암 또는 비인두암인 것인 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 라노스테인 화합물(I) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 적어도 8.4mg/day의 복용량으로 인간에게 투여되는 것인 약학적 조성물.