CN1163259C - 用于改善造血功能的茯苓提取物,含它们的药物组合物及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于改善造血功能的茯苓提取物，含它们的药物组合物及制备方法。

Description

用于改善造血功能的茯苓 提取物，含它们的药物组合物及制备方法

本发明涉及用于改善造血功能的茯苓提取物，含它们的药物组合物及制备方法。

茯苓作为药物使用已有很长的历史，药用茯苓是多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos[Schw]Wolf)的干燥菌核中的白茯苓部分。中国医药著作中记载茯苓具有渗湿利水、安心宁神、易脾和胃等功效。

现已从白茯苓中分离出的一组羊毛甾烷三萜烯类化合物，它们有共同的母核和不同的取代基团。从茯苓提取物中已分出茯苓酸、猪苓酸-C、3-β-羟基羊毛甾烷-7，9(11)，24-三烯-21-羧酸、3-酮-6-乙氧基-7，11-去氢茯苓酸、乙酰茯苓酸、去氢-茯苓酸、以及3-酮-6，16-α-二羟基羊毛甾烷-7，9(11)，24(31)-三烯-21-羧酸等多种成分，见李静，黎红，许津中国药学杂志1997，32(7)：401；许先栋，许津，张致平中国药物化学杂志1994，4(1)：23；Takaaki，Tai et al.Phytochemistry1992，31(7)：2548；兼松明子，名取信策Yakugaku Zasshi 1970，90(4)：475；Valisollalao，J.et al Bull Soc Chim Fr。1980，II 473；Cort LA，et al J Chem Soc 1954，3713；Takaaki Tai et alPhytochemistry 1993，32(5)：1239；Takaaki Tai et al Phytochemistry1991，30(8)：2796。

本发明人现已发现茯苓提取物可以诱生多种集落刺激因子(CSFs)，CSFs是一组细胞调节因子，其功能是调控骨髓干细胞的增殖与分化，因此，茯苓提取物具有促进和调节干细胞增生和分化的能力，从而改善机体的造血功能。

本发明目的是寻找并开发茯苓的新的医药用途。

本发明第一方面涉及用于改善造血功能的茯苓提取物。

本发明再一方面涉及用于改善造血功能的药物组合物，其包括茯苓提取物及药用载体或赋形剂。

本发明还涉及茯苓提取物在制备用于改善造血功能的药物中用途。

本发明进一步涉及制备茯苓提取物的方法，其包括：

i)将茯苓粉碎，然后用选自醇、酮、酯或卤代烷的有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，

ii)将i)提取物减压除去溶剂，所得残余物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，

iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶于醇，过滤除去不溶物，减压除去醇，得纯化的茯苓的提取物，如需要或必要，将所得纯化的茯苓提取物悬浮于水中，用碱调节茯苓提取物的水悬浮液pH至10-11，过滤除去不溶物，滤液用酸调节至3以下，得进一步纯化的茯苓提取物；

或将ii)中茯苓提取物悬浮于水中，用碱调节该水悬浮液pH至10以上，过滤，往滤液中加入选自酯，卤化烷，芳香烃或醚的有机溶剂，用酸酸化有机相pH至3以下，减压蒸干有机相，得进一步纯化的茯苓提取物。

本发明还涉及改善造血动能的方法，其包括将有效量的本发明茯苓提取物给予需改善造血功能的患者。

根据本发明，本发明中所用的茯苓是白茯苓。

根据本发明，本发明所用术语“醇”举例讲可是甲醇，乙醇或丙酮等。

根据本发明，本发明所用术语“酮”举例讲可是丙酮或丁酮等。

根据本发明，本发明所用术语“酯”举例讲可以是乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸丁酯或乙酯戊酯等。

根据本发明，本发明所用术语“卤代烷”举例讲可以是二氯甲烷或三氯甲烷等。

根据本发明，本发明所用术语“芳香烃”举例讲可以是苯或甲苯等。

根据本发明，本发明所用术语“醚”举例讲可以是乙醚等。

根据本发明，本发明所用术语“碱”举例讲可以是碱金属或碱土金属氢氧化物或碳酸盐或的碳酸氢盐如NaOH，KOH，K₂CO₃或Na₂CO₃等。

根据本发明，本发明所用术语“酸”举例讲可以是无机酸或有机酸如盐酸，硫酸，磷酸，乙酸等。

根据本发明，本发明所用术语“患者”举例讲可以是哺乳动物，尤其是人。

根据本发明，本发明茯苓提取物易溶于95％乙醇。本发明茯苓提取物的乙醇溶液(100μg/ml)在200-700mm进行紫外全波长扫描，于241-243nm和235-236处显示出特异吸收峰(见图1)，在252mm处有肩。在1％茯苓提取物的乙醇溶液，茯苓提取物的消光值[A](λ242nm)＝149。

更具体讲，本发明的茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯类化合物，优选至少85重量％，更优选至少95重量％。

本发明因此还涉及含有作为活性成份的有效剂量的茯苓提取物以及常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1-90重量％的茯苓提取物。药物组合物可根据本领域已知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将茯苓提取物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。

本发明的茯苓提取物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。给药剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、脂质体、透皮剂、口含片、栓剂、冻干粉针剂等。可以是普通制剂、缓释制剂、控释制剂及各种微粒给药系统。为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高岭土、滑石粉等；粘合剂如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂，如琼脂粉、干燥淀粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。为了将给药单元制成栓剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高级醇、高级醇的酯、明胶、半合成甘油酯等。为了将给药单元制成胶囊，将有效成分茯苓提取物与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明明胶囊或软胶囊中。也可将有效成分茯苓提取物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。为了将给药单元制成注射用制剂，如溶液剂、乳剂、冻干粉针剂和混悬剂，可以使用本领域常用的所有稀释剂，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，为了制备等渗注射液，可以向注射用制剂中添加适量的氯化钠、葡萄糖或甘油，此外，还可以添加常规的助溶剂、缓冲剂、pH调节剂等。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或其它材料。

本发明茯苓提取物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，所用的具体化合物，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。

下面的实施例及生物活性实验用来进一步说明本发明，但这并不意味着对本发明的任何限制。

实施例1茯苓提取物的制备

1kg茯苓粉，用10L 80％乙醇分三次提取，每次均在室温下搅拌两小时，抽滤，合并三次滤液，减压蒸去乙醇，水溶液酸化到pH3以下，茯苓提取品即沉淀出来，过滤，收集沉淀。得5g茯苓粗提品，其中羊毛甾烷三萜烯类化合物含量80％。

将上面所得茯苓粗提品溶于95％乙醇中，过滤，除去不溶物，减压蒸去乙醇，得到第一步纯化的茯苓提取物。将第一次纯化的茯苓提取物按100mg/ml的量溶于1M的NaOH中，用水稀释10倍，过滤，除去不溶物，用6N HCl调节pH到3以下，茯苓提取物沉淀出来，抽滤，滤饼用水洗至中性。在真空干燥箱中抽干，研成粉末，得4g茯苓提取品，其中羊毛甾烷三萜烯类化合物含量＞85％。

生物活性：

本发明茯苓提取物对小鼠受γ射线照射所导致的损伤的恢复

昆明小鼠，雌性，体重22-26克。茯苓提取物(以下简称F)以125mg/kg剂量给予小鼠，用蒸馏水配制。

实验动物随机分成三组：正常对照组，单纯照射组，上述茯苓提取物剂量组。每组10只动物，实验重复一次。

实验动物Co[60]γ线全身一次性照射，剂量率为1.86-1.84伦/分，总剂量7.5Gy。照射后立即灌胃给药，每天一次，连续六天。对照组给生理盐水。各组动物于照射后第七天称体重，测外周血细胞数，称脾重，计算脾脏表面宏观脾结节数，取股骨测定骨髓DNA含量。结果见表1。

表1茯苓提取物对小鼠受γ射线照射所导致的损伤的恢复

组别          白细胞  血小板  脾脏系数  CFU-S  骨髓DNA

单纯照射组    1       1       1         1      1

F125mg/kg     1.8     1.4     1.5       12.4   1.6

注：上表给药组的数值均为单纯照射组的倍数。

CFU-S：脾结节数

茯苓提取物对狗注射环磷酰胺(CY)所导致的损伤的保护作用实验使用北京地区家狗，雄性，年龄1-2岁，体重12-16公斤。

茯苓提取物按小鼠的最好有效剂量，用体表面积换算成狗的给药剂量，剂量为19.86mg/kg。

实验分组：单纯环磷酰胺组(简称CY)，上述茯苓提取物剂量组。8只狗，适应性饲养2周左右，按体重随机分组，每组四只。给药前称体重，测外周血红、白细胞，血小板，网织红细胞两次。狗静脉注射环磷酰胺(5mg/kg)，每日一次，连续5天。茯苓提取物在第一次注射环磷酰胺的同时口服给药，连续7天，每天一次。实验动物观察期为21天。实验结果：

临床症状及动物存活情况

给药后单纯环磷酰胺组4只动物于7-13天均出现一次性食欲变差，而给茯苓提取物剂量组4只动物没有出现食欲变差现象。单纯环磷酰胺组给药后有2只动物于5-11天体温升高，给予茯苓提取物的动物均未出现体温升高现象。因此临床症状表明茯苓提取物能减轻动物化疗引起的临床反应。

血液成分的变化

单纯环磷酰胺组给药后外周血白细胞总数呈进行性减少，第11天降至最低值。此后缓慢上升，至药后21天接近正常的70％。以19.86mg/kg剂量给予的茯苓提取物对粒细胞有非常显著的保护作用，同时对于淋巴细胞和血小板，茯苓提取物也有保护作用。对于网织细胞，给药组明显高于对照组，茯苓提取物在药后第5、7天都呈上升趋势。结果见表2。

表2茯苓提取物对狗注射环磷酰胺所导致血细胞的损伤的保护作用

组别           粒细胞   淋巴细胞    血小板    网织细胞

单纯给CY组    -61.6    -77.8       -50.3     -96.2

F(19.86mg/kg)    -5.5    -30.0    -30.0    +25.0

注：表中数字为细胞受抑制后各种细胞下降或上升的百分数

茯苓提取物对注射环磷酰胺的狗的骨髓细胞的影响实验第9天取髂骨骨髓培养，涂片，第21天活杀动物取胸骨骨髓进行CFU-GM，CFU-E，BFU-E，CFU-MEG细胞培养，茯苓提取物对于粒单细胞结节数和巨核细胞结节数有明显的保护作用，能提高CFU-GM和CFU-MEG的产率。结果见表3。

表3茯苓提取物对注射环磷酰胺的狗的骨髓细胞的影响

组别           CFU-GM       CFU-MEG    CFU-E    BFU-E

              9天   21天    21天       21天     21天

单纯给CY组    1     1       1          1        1

F(19.86mg/kg) 7.40  1.11    1.94       1.22     1.02

(注：表中数字是给茯苓提取物的动物的骨髓细胞中各种祖细胞为单纯给CY动物的祖细胞的倍数。)

CFU-GM：粒单细胞结节数，CFU-MEG：巨核细胞结节数，

CFU-E：红细胞结节数，BFU-E：网织红细胞结节数。

给药后21天各组活杀狗未见体表及各脏器有明显异常，病理检查结果表明茯苓提取物能明显促进血液细胞的增殖，引起造血细胞再生是多谱系的。

茯苓提取物对LPS激活的巨噬细胞产生的CSFs的影响。

CSFs的诱生实验使用巨噬细胞作为CSFs的产生细胞，首先制备巨噬细胞单层，在细胞培养液中加入脂多糖(10μg/ml)，培养2小时，再加入不同剂量的茯苓提取物，继续培养24小时，收集巨噬细胞的培养液，其中含巨噬细胞产生的CSFs。

另取小鼠骨髓细胞制成悬液，加入上述的巨噬细胞的各组培养液，继续培养4小时，然后每管加入D-[³H]-半乳糖，继续培养20小时，离心分出骨髓细胞，测定细胞中³H-半乳糖的掺入量。在骨髓细胞增殖时，半乳糖参加细胞膜的合成，因此半乳糖的掺入率可以代表细胞的增殖的多少，而细胞的增殖又决定于CSFs的量，因此，半乳糖的参入量与CSFs的量成正比。结果见图2。

Claims (14)

1.用于改善生血功能的茯苓提取物，其特征在于：所述提取物是如下得到的：

i)将茯苓粉碎，然后用选自甲醇或乙醇、丙酮或丁酮、乙酸甲酯或乙酸乙酯或二氯甲烷或三氯甲烷的有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，

ii)将i)提取物减压除去溶剂，所得残余物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，

iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶于醇，过滤除去不溶物，减压除去醇，得纯化的茯苓的提取物，如需要或必要，将所得纯化的茯苓提取物悬浮于水中，用碱调节茯苓提取物的水悬浮液pH至10-11，过滤除去不溶物，滤液用酸调节至3以下，得进一步纯化的茯苓提取物。

2.用于改善造血的药物组合物，其包括权利要求1的茯苓提取物及药用载体或赋形剂。

3.权利要求1的茯苓提取物，其中茯苓是白茯苓。

4.权利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯类化合物。

5.权利要求1的茯苓提取物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三烯萜类化合物。

6.权利要求2的药物组合物，其中茯苓是白茯苓。

7.权利要求2的药物组合物，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷烯类化合物。

8.权利要求2的药物组合物，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷烯类化合物。

9.茯苓提取物用于制备用于改善造血功能的药物的用途。

10.权利要求9的用途，其中茯苓是白茯苓。

11.权利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少70重量％的羊毛甾烷三萜烯类化合物。

12.权利要求9的用途，其中茯苓提取物含至少95重量％的羊毛甾烷三萜烯类化合物。

13.茯苓提取物的制备方法，其包括：

i)将茯苓粉碎，然后用选自甲醇或乙醇、丙酮或丁酮、乙酸甲酯或乙酸乙酯或二氯甲烷或三氯甲烷的有机溶剂或有机溶剂与水的混合物提取，

ii)将i)提取物减压除去溶剂，所得残余物用酸酸化到pH2-3，得茯苓提取物，

iii)如需要，得ii)中茯苓提取物溶于醇，过滤除去不溶物，减压除去醇，得纯化的茯苓的提取物，如需要或必要，将所得纯化的茯苓提取物悬浮于水中，用碱调节茯苓提取物的水悬浮液pH至10-11，过滤除去不溶物，滤液用酸调节至3以下，得进一步纯化的茯苓提取物。

14.权利要求14的方法，其中i)中有机溶剂或有机溶剂与水的混合物为80％乙醇。

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