CN1172677C - 黄芪甲苷在制备药物组合物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种中药黄芪提取物黄芪甲苷，及其制备方法。包括制备黄芪浓缩液、黄芪精制液、分离黄芪甲苷；同时提供此提取物可作为药物原料制成片剂、注射剂、缓释剂、胶囊和复方制剂；还涉及提取物在治疗病毒性心肌炎中的用途。

Description

黄芪甲苷在制备药物组合物中的应用

本发明涉及中药黄芪提取物黄芪甲苷的药物用途，具体涉及黄芪甲苷在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。

病毒性心肌炎是临床常见心脏疾病，常危及病人生命安全，需及早发现、早日治疗。中药黄芪作为常用治疗药，其全药应用于临床治疗，已取得较好效果，但目前治疗用黄芪注射液，因外界各种因素影响，其质量不易控制，易产生沉淀，而影响治疗效果，寻找一种质量稳定、价格适宜、治疗效果好的中药治疗剂，一直是临床医生和药师的愿望。

黄芪甲苷(astragaloside IV)是自中药黄芪中提取、分离的

单体化合物，其化合结构式如下：

分子式  C₄₁H₆₈O₁₄

晶型    无色针状结晶

熔点    309-310℃

溶解度  甲醇稍溶，乙酸乙酯、丙酮及水几乎不溶，乙醇加热溶解，冷后析出。红外光谱(KBr)cm^-1 3510，3388，2950，2870，1650，1458，1380，1367，1070，1047，1020，895

本发明的目的是提供黄芪甲苷单体化合物作为药物制剂的原料。

本发明的另一目的是提供黄芪甲苷的新用途，即在制备防治病毒性疾病药物制剂的用途。涉及黄芪甲苷作为制备预防和治疗柯萨奇病毒性心肌炎药物组合物的应用。

本发明通过下述方法和步骤制备黄芪甲苷：

(1)制备黄芪浓缩液

取黄芪药材，去除杂质后，切片，加10倍量的水，浸泡30分钟后煎煮1.5小时，过滤，保留第一次煎煮液，药渣再加8倍量的水煎煮1小时，过滤，保留第二次煎煮液，药渣再加8倍量的水煎煮1小时，过滤，保留第三次煎煮液，然后合并三次煎煮液，常压浓缩至每毫升相当于含2克黄芪生药的浓缩液。

(2)制备黄芪精制液

将上述黄芪浓缩液加入乙醇至含醇量为70％，搅拌后于2-10℃条件下放置48-72小时，过滤，去除沉淀，滤液回收乙醇并浓缩至每毫升相当于含2克黄芪生药的浓缩液，再加入乙醇至含醇量为80％，搅拌后于2-10℃条件下放置48-72小时，过滤，去除沉淀，滤液回收乙醇并浓缩至稠浸膏，加稠浸膏量的6-7倍的蒸溜水，搅拌均匀，于2-10℃条件下放置12小时，滤除沉淀，滤液加适量活性碳煮沸30分钟，冷至室温，于2-10℃条件下放置12小时，滤除活性碳和沉淀，滤液用NAOH调PH为

7.5，制得黄芪精制液。

(3)分离黄芪甲苷

将上述黄芪精制液，用等量正丁醇提取3次，合并3次提取液得正丁醇提取液，回收溶媒，制得黄芪正丁醇浸膏。

将上述正丁醇浸膏，用少量甲醇溶解，加入层析用硅胶，搅匀，水浴上挥干甲醇，制得呈流动状的黄芪正丁醇浸膏与硅胶的混合物。

将其加入到硅胶柱顶部，以硅胶簿层层析检视，用氯仿/甲醇梯度洗脱，簿层层析检视，合并有黄芪甲苷的部分，回收溶媒，析出白色固体物。将白色固体物用甲醇重结晶，放置，析出无色针状结晶黄芪甲苷。

本发明黄芪甲苷可作为药物原料制成片剂、注射剂、缓释剂、胶囊以及复方制剂。

本发明黄芪甲苷经动物实验，结果证实对小鼠柯萨奇B₃病毒性心肌炎有治疗作用，能减少心肌炎面积，减轻VMC小鼠心肌炎坏死程度改善心功能。对CVB₃感染的心肌细胞具有良好的保护作用。有抗柯萨奇病毒作用。

本发明的动物实验方法与结果如下：

一、黄芪甲苷治疗小鼠柯萨奇B₃病毒性心肌炎的实验研究及其对颗粒酶B表达的影响

(一)药物来源及给药途径

黄芪甲苷，由中山医院药剂科分离提纯，为无色针状结晶，不溶于水，将黄芪甲苷加入到5％羧甲基纤维素钠(CMC)水溶液中，浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml，黄芪注射液(上海福达制药有限公司提供，每支4g/2ml)，自小鼠腹腔注射病毒日起，灌胃给药，每日1次，每次0.1ml，正常及病毒对照组小鼠灌胃给0.1ml的5％羧甲基纤维素钠水溶液。

(二)实验动物及分组

清洁级4周龄BALB/c雄性小鼠120只，分为正常对照组、正常+黄芪组，正常+黄芪甲苷组；病毒对照组，病毒+黄芪(黄芪注射液0.2g)组，病毒+黄芪甲苷0.1mg、0.2mg、0.4mg组。

(三)观察药物毒性作用

将正常+黄芪(黄芪注射液0.2g)组、正常+黄芪甲苷(0.4mg)组小鼠与正常对照组小鼠进行比较，观察其一般情况、有无死亡，一周后杀死，取心脏，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚4μm，行HE染色观察心肌有无病变。

(四)建立小鼠柯萨奇B₃病毒性心肌炎模型

1、病毒：柯萨奇B₃病毒，Nancy株，本实验室提供，Vero细胞增殖后，测病毒滴度为10¹⁰TCID₅₀。

2、实验动物；清洁级雄性4周龄BALB/C小鼠，由上海医科大学实验动物中心提供。

3、动物模型制备：实验组小鼠腹腔接种0.1ml含10⁵ TCID₅₀柯萨奇B3病毒的Eagle’液；对照组小鼠，每只腹腔接种0.1ml不含病毒的Eagle’液。观察小鼠进食、毛色、活动及有无死亡，接种后第7天，处死存活小鼠，取其心脏，行常规病理检查、原位杂交和免疫组化检查。

(五)观察药物疗效

比较治疗组与非治疗组小鼠的死亡率、患病率，心肌病理变化，病理结果定量分析，比较各组心肌炎变面积百分比。

(六)免疫组化法检测小鼠心肌中颗粒酶B的表达

结果：

(一)药物毒性作用显示正常+黄芪组、正常+黄芪甲苷0.4mg组小鼠与正常对照组相似，一般情况均良好，小鼠无死亡，心肌病理检查未见病变。

(二)小鼠心肌炎病变情况，病毒感染组小鼠较正常组小鼠一般情况差，少食少动，部分小鼠死亡。心脏病理检查示不同程度的心肌炎症改变。

        表1为小鼠心肌病变面积的比较

分组                                       小鼠序号

                 1     2      3    4     5     6     7     8    9     10

病毒对照         1     0.5    40   1     15    70    30    3    60

病毒+黄芪        3     5      0    30    10    1     50    8

病毒+黄芪甲苷    25    1      0    1     55    3     7

0.1mg

病毒+黄芪甲苷    0     10     6    10    3     20    1     1.5  1

0.2mg

病毒+黄芪甲苷    4     0      15   1     1     4     8     0    0     6

0.4mg

结果显示未治疗组小鼠心肌病变较重者构成比较大，心肌病变较轻者构成比较小。黄芪甲苷0.2mg、黄芪甲苷0.4mg治疗组心肌病变较未治疗组轻，p＜0.05。

              表2：小鼠心肌病变面积频数分布表

                          病变面积    (％)    75-100    合计

分组             0-25     25-50       50-75

病毒对照         5        2           2       0         9

病毒+黄芪        6        1           1       0         8

病毒+黄芪甲苷    5        1           1       0         7

0.1mg

病毒+黄芪甲苷    9        0           0       0         9

0.2mg

病毒+黄芪甲苷    10       0           0       0         10

0.4mg

表2可见治疗组小鼠心肌病变面积有下降的趋势，特别是黄芪甲苷0.2mg治疗组和黄芪甲苷0.4mg治疗组，存活小鼠的心肌病变面积均＜25％。将心肌病变面积25％为分界线，分别计算各组心肌病变轻重构成比。黄芪甲苷0.2mg治疗组心肌病变轻重构成比为9/0，与病毒对照组5/4相比，有显著性差异，p＝0.04。黄芪甲苷0.4mg治疗组心肌病变轻重构成比为10/0，与病毒对照组5/4相比，有显著性差异，p＝0.03，其余各组心肌病变面积轻重构成比与病毒对照组相比无显著性差异。

(三)免疫组化检查显示颗粒酶B的表达水平与病变面积呈正相关，治疗组(黄芪甲苷0.2mg、黄芪甲苷0.4mg组)心肌病变面积小，颗粒酶B的表达水平也低，无心肌炎病理表现的小鼠心肌中未检出颗粒酶B的表达。

二、黄芪甲苷对小鼠病毒性心肌炎的心功能影响

(1)建立小鼠病毒性心肌炎模型，感染病毒后取VMC小鼠行超声心动图检查，指标有左室缩短分数FS，主动脉血流峰值流速Vp，主动脉流速积分Vi，存活小鼠超声检查后处死行心脏病理检查，观察各心功能指标的动态变化及病理变化。

(2)小鼠VMC模型，分为黄芪甲苷组、黄芪组、空白对照组和正常对照组。注射病毒后第7天，存活的小鼠行超声心动图检查，心脏病理评分。同时ELISA法测定血清肌钙蛋白含量；所有小鼠以病理积分分组，＜1.5为轻症组，≥1.5为重症组，心脏中段石蜡切片进行原位杂交检测病毒RNA，计算光镜下阳性信号占总面积的百分数。

结果：

(1)VMC组死亡小鼠，心功能指标较正常对照组低

(2)VMC组FS、Vp、Vi均较对照-正常组降低，提示病毒感染组心功能减退；不用药的病毒感染组心功能减退明显(p＜0.05)。

(3)病理评分：对照-VMC组坏死面积较大；黄芪甲苷-VMC组坏死较小，炎症浸润为主；黄芪-VMC组病理改变与黄芪甲苷-VMC组类似；不用药组较用药的两组者病变重(p＜0.05)。对照-正常组和黄芪甲苷-正常组无病变，病理积分为0；与前三组相比有显著性差异(p＜0.05)。

结果证实黄芪甲苷能减轻VMC小鼠心肌炎症坏死程度，改善心功能。

三、黄芪甲苷对离体病毒性心肌炎细胞的保护作用

1.选择病毒：选择柯萨奇B组病毒B3型作为感染原。在乳鼠心肌细胞上用Reed法测其50％组织感染率(TCID50)。

2.制备培养心肌细胞：取Sprague-Dawley大鼠(由上海医科大学实验动物部提供)，心室肌用0.1％胰蛋白酶分次消化细胞，所得的细胞悬液纯化培养，生长液用含20％小牛血清的Eagle′s MEM液。

3.观察病毒对培养搏动心肌细胞的感染及形态学变化：将已呈规律搏动的心肌细胞，加入100 TCID50的柯萨奇B3病毒适量，置37℃吸附1小时后，观察其变化。结果显示接种病毒2天后，心肌细胞搏动百分比明显下降。CPE很快自+～4+，细胞明显变园、成堆、有折光并团缩。CPE表示法：+表示＜25％CPE，1+表示25％CPE，2+表示50％CPE，3+表示75&CPE，4+表示近乎100％CPE。

4.药物处理：将制备的培养心肌细胞，分组为：正常对照、病毒对照、病毒+黄芪甲苷共三组，正常组与病毒感染组只加上述生长液，在黄芪处理组加入含0.1mg/ml浓度的生长液；置37℃孵育，在倒置相差显微镜下观察记录。

结果显示出黄芪甲苷对CVB3感染的心肌细胞不论是细胞搏动％、细胞的形态均具有良好的保护作用。

附图说明：

图1为黄芪甲苷对离体病毒性心肌炎细胞的保护作用

Claims (2)

1、黄芪甲苷在制备治疗病毒性心肌炎药物组合物中的应用。

2、按权利要求1所述的应用，其中黄芪甲苷可作为药物原料，制成片剂、注射剂、缓释剂、胶囊或复方制剂。

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