CN109908188B - 一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途，该方法包括以下步骤：以桑黄为原料，对桑黄中分离出的全成分进行分析鉴定，将基因组学和生物信息学分析技术结合，以转录组学为基础，对全成分进行药效学分析确定对应功效，根据不同成分各自‑对应的功效，将相同功效和功效互补成分进行筛选并组合。这种以成分‑对应功效‑作用机制为基础进行成分配比的方法，功能定位更明确，功效更强，治疗作用更显著。除用于筛选抗肿瘤成分组合，还可以同时筛选治疗糖尿病，抗肝纤维化等各种功效配方。

Description

一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途

技术领域

本发明涉及药物分析技术领域，且特别涉及一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途。

背景技术

桑黄作为我国传统真菌类中药，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排在第一位的药用菌。其包含多种结构类型的化学成分，包括多糖、黄酮、三萜类、芳香酸、氨基酸等，其中多糖类成分是含量最多的成分；现代药理学实验也表明，桑黄具抗癌、免疫调节、抗肥胖、抗氧化和抗炎等多种药理学活性。研究表明,桑黄菌子实体的热水提取物对小白鼠肉瘤180的抑制率为87％,子实体的水浸液对小白鼠艾氏癌的抑制率为80％。临床研究显示，桑黄多糖可明显改善癌症术后患者的免疫水平,抵抗放、化疗的副作用,协同放、化疗杀死癌细胞,增强疗效。如果桑黄和抗肿瘤药物或放疗并用，更可以减轻诸如丧失食欲、高热、呕吐、脱发等副作用。对经过手术后进行放疗和化疗的患者，服用桑黄则可恢复并强化免疫系统，从而达到防止肿瘤复发或抑制残余肿瘤细胞转移的目的，且无毒无害，长期大剂量服用亦无毒副作用。

除能够提高人体免疫力，减轻抗癌剂副作用，用来辅助肿瘤病人的放化疗外，桑黄对于女性月经不调等妇科疾病也有重要疗效。此外，桑黄及其人工培养菌丝体还可以治疗脂肪肝以及病毒性肝炎引起的肝硬化。脂肪肝与病毒性肝炎引起的肝硬化在我国均为高发性疾病。日本和韩国早已将桑黄微粉胶囊用于临床治疗脂肪肝或肝纤维化等疾病，其疗效十分显著。

目前，国内外桑黄研究较多集中于桑黄深层发酵条件优化和桑黄多糖的提取。关于桑黄保健品或药物的开发，多为直接将桑黄与其他药物或食物配伍进行桑黄保健品或功能性饮料的开发；或以桑黄提取物，例如桑黄菌粉、桑黄发酵液或提取液为主要原料制备各种桑黄口服液、胶囊、片剂，而对于桑黄中明确的有效作用成分及其对应功效报道较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途，该方法解决了现有的桑黄产品的制备过程，将桑黄直接与其他药物或者食品配伍进行研发时，有效作用成分和对应功效不明确的问题，提出一种根据成分-对应功效-作用机制，将相同功效和功效互补成分筛选并组合，制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物。本发明中通过对桑黄中全成分及其对应功效的鉴定，为桑黄药用菌更加深入的开发提供重要参考依据。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法，包括如下步骤：

以桑黄为原料，对桑黄中分离出的全成分进行分析鉴定，将基因组学和生物信息学分析技术结合，以转录组学为基础，对全成分进行药效学分析确定对应功效，根据不同成分各自-对应的功效，将相同功效和功效互补成分进行筛选并组合。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途，因此，本研究拟通过化学及色谱成分分析技术对桑黄进行全组分分析和分离；通过高通量基因检测和生物信息学分析鉴定桑黄中有效作用成分，同时进行细胞学验证，明确其主要对应功效；筛选抗肿瘤活性成分，验证其在增强免疫功能、抑制肿瘤生长方面的作用及机制，为进一步开发以该提取物作为主要成分的抗肿瘤辅助治疗药物奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为桑黄提取的流程图；

图2为不同浓度桑黄成分A抗肿瘤作用经时变化曲线；

图3为不同浓度桑黄成分C抗肿瘤作用经时变化曲线；

图4为不同浓度桑黄成分B抗肿瘤作用经时变化曲线；

图5为不同浓度桑黄成分D抗肿瘤作用经时变化曲线；

图6为肺癌细胞培养过程中倒置相差显微镜采图；

图7为乳腺癌细胞培养过程中倒置相差显微镜采图；

图8为耐药乳腺癌细胞培养过程中倒置相差显微镜采图；

图9为前列腺癌细胞培养过程中倒置相差显微镜采图；

图10为耐药前列腺癌细胞培养过程中倒置相差显微镜采图；

图11为桑黄活性组分对不同肿瘤细胞增殖的抑制作用；

图12为桑黄活性组分对淋巴细胞增殖的影响的倒置相差显微镜采图；

图13为桑黄活性组分激活淋巴细胞对肺癌细胞A549的杀伤作用的倒置相差显微镜采图；

图14为桑黄活性组分对淋巴细胞的促肿瘤杀伤作用；

图15为桑黄活性组分对细胞因子分泌的影响；

图16为不同途径给予桑黄提取物对肿瘤的影响；

图17为不同途径给予桑黄提取物对CD3+、CD8+淋巴细胞含量；

图18为不同途径给予桑黄提取物对CD4+淋巴细胞含量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例提供的一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物及其制法和用途进行具体说明。

本发明实施例提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法，包括如下步骤：

以桑黄为原料，对桑黄中分离出的全成分进行分析鉴定，将基因组学和生物信息学分析技术结合，以转录组学为基础，对全成分进行药效学分析确定对应功效，根据不同成分各自-对应的功效，将相同功效和功效互补成分进行筛选并组合。

本发明实施例提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法，包括如下步骤：以桑黄为原料，首先对于桑黄进行分离提取得到桑黄提取的全成分，然后，利用基因组学和生物信息学分析技术，以转录组学为基础，对桑黄中分离出的全成分进行药效学和机制分析，再次，根据不同成分各自-对应的功效，将相同功效和功效互补成分进行筛选并组合。该方法以此药效物质成分为基础开发的产品，功能定位更明确，功效更强，治疗作用更显著。以准确全面的成分分析为基础开发研制的食品饮料将具有更明确的适宜人群范围，且以已知功效的活性成分配伍制备保健品相比直接将桑黄与其他药物食物混合制备复方制剂，也将具备更确切的功能定位和更高疗效；分离获得的有效单体化合物更可进一步进行药品的研发和创制。

因此，本发明拟通过化学及色谱成分分析技术对桑黄进行全组分分析和分离；通过高通量基因检测和生物信息学分析鉴定桑黄中有效作用成分，并明确其主要对应功效；筛选抗肿瘤活性成分，验证其在增强免疫功能、抑制肿瘤生长方面的作用及机制，为进一步开发以该提取物作为主要成分的抗肿瘤辅助治疗药物奠定基础。同时，对桑黄中全成分及其对应功效的鉴定，也将为桑黄药用菌更加深入的开发提供重要参考依据。

在一些实施方式中，桑黄中分离出的全成分根据提取方法及分离纯化方法的不同分为A组、B组、C组以及D组共四组，

A组通过水提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖，

B组通过水提醇洗获得，主要成分包括：二氢鼠李素，咖啡酸，原儿茶醛，芫花素，山奈素，7-甲基圣草素，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇，桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，

C组通过醇提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，岩藻糖，树胶醛糖和糖醛酸，

D组通过醇提醇洗获得，主要成分包括：桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，二氢山奈酚，7-甲氧基二氢茨非素，原儿茶醛，7-甲基柚皮素，二氢鼠李素，咖啡酸，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇。

在一些实施方式中，桑黄中分离出的全成分通过超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术和UNIFI筛查平台的联合进行分离鉴定。

在一些实施方式中，桑黄中分离出的全成分的对应功效通过以下方法确定：分别以不同浓度的成分A、成分B、成分C和成分D处理人乳腺癌MCF7细胞，通过高通量基因检测技术进行转录组学检测，对获得的差异表达基因进行生物信息学计算，分析桑黄中主要药效作用成分，并进行细胞学验证，确定桑黄中分离出的全成分的对应功效。

本发明实施例提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法，桑黄中分离出的全成分的对应功效通过以下方法确定：分别加入不同浓度的A组、B组、C组以及D组，检测各组细胞的转录组(全表达基因谱)。以未加药的乳腺癌MCF7细胞作为对照，比对分析差异表达基因(表达量变化的基因)。进一步对差异表达基因进行功能、聚类及涉及信号通路分析，预测各组分可能作用功效及作用机制。

可见，对于桑黄中提取得到的全成分进行分析，该分析过程中，利用基因组学和生物信息学分析技术，以转录组学为基础，对获得的差异表达基因进行生物信息学计算，同时加以细胞学验证，确定桑黄中分离出的全成分的对应功效。上述分析过程中，不仅利用基因分析过程中表现出的生物信息得出全成分的对应功效，而且利用细胞学进行验证，能够更加充分合理的确定出桑黄中全成分的对应功效。完全不同于现有的将制备得到桑黄产品进行分析，本发明中的分析过程能够为以此药效物质成分为基础开发的产品提供更加明确的功能定位，功效更强，治疗作用更显著。

在一些实施方式中，将相同功效和功效互补成分筛选并组合得到一种组合物，组合物包括：成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分的质量比为1:1、1:2、1:4和1:8，优选的，质量比为1:4。

在一些实施方式中，成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分的质量比为1:4时，组合物中各组分的质量比为：甘露糖：桑黄黄酮A：异桑黄黄酮A：原儿茶醛：咖啡酸：(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇＝0.2-0.4:0.9-1.1:1.1-1.3:0.7-0.9:0.9-1.1：0.1-0.3。

本发明实施例还提供一种根据上述的制备方法制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物。

本发明实施例提供一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法，对桑黄抗肿瘤有效组分提取物的组合采用以下的步骤：在前述的桑黄全成分的分析的基础上，根据各个成分-药效之间的关系，选择成分组合：甘露糖，桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，原儿茶醛，咖啡酸和(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇作为抗肿瘤活性成分组合。正交实验验证配比为甘露糖：桑黄黄酮A：异桑黄黄酮A：原儿茶醛：咖啡酸：(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇＝0.2-0.4:0.9-1.1:1.1-1.3:0.7-0.9:0.9-1.1：0.1-0.3。此活性组分既可直接诱导肿瘤细胞凋亡，又可提高宿主免疫能力间接杀伤肿瘤。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的桑黄抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用。根据前述的分析，此活性组分既可直接诱导肿瘤细胞凋亡，又可提高宿主免疫能力间接杀伤肿瘤。因此，可以将上述的桑黄抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

在一些实施方式中，桑黄抗肿瘤有效组分提取物用于抑制肿瘤生长，并促进淋巴细胞增长，肿瘤选自肝癌肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、耐药乳腺癌肿瘤、前列腺癌肿瘤、耐药前列腺癌肿瘤以及结肠癌肿瘤中的至少一种优选的，肿瘤为肝癌肿瘤以及结肠癌肿瘤中的至少一种。

在一些实施方式中，桑黄抗肿瘤有效组分提取物的最低有效剂量为50μg/ml。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

一、UPLC-Q-TOF MSE技术结合UNIFI数据库对桑黄全化学成分的快速分析

桑黄中包含多种结构类型的化学成分，包括多糖、黄酮、三萜类、芳香酸、氨基酸等，其中多糖类成分是含量最多的成分；现代药理学实验也表明，桑黄具有多种药理学活性，包括抗癌、免疫调节、抗肥胖、抗氧化和抗炎等。目前针对桑黄化学成分的研究，仍以传统的提取、分离、纯化为主，费时费力，缺乏整体研究。而且一直以来对桑黄多糖的药理作用研究比较多，但是对桑黄子实体中小分子化合物的研究报道相对较少。因此，对桑黄中进行全成分鉴定，对桑黄药用菌进行更加深入的化学成分和药理作用研究，有重要的理论和实际意义。

超高效液相色谱与飞行时间质谱联用(UPLC-Q-TOF-MSE)已经成为天然药物中活性成分快速分离和鉴定的有力手段。而UNIFI是一个简单、高效、全面的平台，数据库中包括600多种中药中发现的6000多种化合物信息，能够将数据采集、峰提取、分子式确定、数据库检索及生成报告相结合，对化学成分进行快速、全面地定性分析。将UPLC-Q-TOF-MSE与UNIFI平台相结合，已经被应用到传统中药及复方中化学成分的快速鉴定中。

本研究利用UNIFI数据处理系统和MassLynx 4.1软件对桑黄的化学成分进行快速、全面的筛查分析，在桑黄中检测到59个化合物，7个苯丙素类，7个甾体，6个三萜，5个黄酮，4个二萜，5个酚类。为进一步阐明药效物质基础、全面的质量控制提供依据。

二、桑黄化学成分的分离和鉴定

桑黄化学成分的获得，包括以下步骤：

取500g桑黄，粉碎，过100目筛。加10倍量水，95℃热水回流提取三次，合并提取液得到水提成分。过滤后剩余部分继续用80％乙醇提取，5倍量乙醇，80℃下提取三次，合并提取液，回收乙醇，得乙醇提取部分。

水提、醇提部分分别上正相硅胶层析柱，以蒸馏水洗涤得水提水洗(A组)、醇提水洗(C组)成分；以90％乙醇洗涤得水提醇洗(B组)和醇提醇洗(D组)。

结合桑黄全化学成分的分析、分离和鉴定，确定各组主要成分。

桑黄化学成分的分离和鉴定，包括以下步骤：

参见附图1，采用如图1中的流程进行桑黄化学成分分离，共得到22个化合物，将分离得到的22个化合物，分别通过¹HNMR、¹³HNMR及标准品对照法进行结构鉴定。得到此22种化合物分别为：二氢鼠李素(1)，圣草素(2)，鼠李素(3)，7-甲氧基二氢茨非素(4)，二氢山奈酚(5)，7-甲基圣草素(6)，7-甲基柚皮素(7)，桑黄黄酮A(8)，异桑黄黄酮A(9)，芫花素(10)，山奈素(11)，原儿茶醛(12)，原儿茶酸(13)，原儿茶酸甲酷(14)，4-(3,4-二轻苯基)-3-丁烯-2-酮(15)，咖啡酸(16)，hispolon(17)，(22E,24R)-6β-乙氧基-麦角甾-7,22-二烯-2β,5α-醇(18)，(22E,24S)-6β-乙氧基-麦角-7-烯-2β,5α-二醇(19)，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇(20)，(22E,24)-麦角甾-7,9(21)和22-三烯-3β,5α,6α-三醇(22)。

根据提取方法及分离纯化方法的不同，将获得成分分为A、B、C、D四组:

A组通过水提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，葡萄糖，阿拉伯糖，

B组通过水提醇洗获得，主要成分包括：二氢鼠李素，咖啡酸，原儿茶醛，芫花素，山奈素，7-甲基圣草素，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇，桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，

C组通过醇提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，岩藻糖，树胶醛糖和糖醛酸，

D组通过醇提醇洗获得，主要成分包括：桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，二氢山奈酚，7-甲氧基二氢茨非素，原儿茶醛，7-甲基柚皮素，二氢鼠李素，咖啡酸，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇。

三、基于基因转录组学的桑黄活性成分分析

1.基因分析

分别以不同浓度桑黄成分A、成分B、成分C和成分D处理人乳腺癌MCF7细胞，通过高通量基因检测技术进行转录组学检测，对获得的差异表达基因进行生物信息学计算，分析桑黄中主要药效作用成分，并明确其主要对应功效。其中，基因分析的过程如下：分别以不同浓度桑黄成分A、成分B、成分C和成分D处理人乳腺癌MCF7细胞，高通量基因检测转录组，和没加药的MCF7细胞组进行对比，筛选表达变化的基因，再对差异表达基因进行生物信息学分析，分析内容主要包括差异基因主要参与了哪些生物进程，发挥了哪些功能，调控了哪些信号通路，以下是分析得到的结果：

桑黄成分A处理细胞：差异表达基因较少，主要发挥肿瘤坏死因子及其受体，胰岛素样生长因子及其受体，以及蛋白激酶等分子功能，参与了细胞生长，信号通路传递、细胞凋亡等生物学过程。推测其在抗肿瘤过程中发挥直接杀伤作用。

桑黄成分B处理细胞：不同浓度成分处理细胞基因表达谱均产生显著变化，对这些基因进行GO分析，发现差异表达基因发挥了黏着斑、细胞基质粘附连接、细胞囊泡、细胞周缘、初级溶酶体、ATP酶等分子功能，参与细胞粘附、细胞与基质的粘附识别、类固醇合成、分子伴侣结合、蛋白错误折叠、未折叠蛋白反应、泛素蛋白连接等生物学过程。在此基础上分析差异表达基因KEGG通路，可能参与的相关的信号途径包括：内质网蛋白加工处理通路、P53信号通路、细胞衰老通路、雌激素信号通路、Wnt信号通路、IL-17信号通路、抗原加工提呈通路，以及动脉粥样硬化、炎症性疾病、病原菌感染等疾病相关通路。

结合差异表达基因的功能、生物学过程和已发表文献，该过程中的关键基因主要发挥了抗氧化应激、抗衰老和免疫调控作用。

桑黄成分C处理细胞：差异表达基因较少，主要为肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子受体，染色体失活基因，参与了细胞凋亡过程。

桑黄成分D处理细胞：不同浓度成分处理细胞基因表达谱均产生显著变化，对这些基因进行GO分析，发现差异表达基因发挥了黏着斑、细胞基质粘附连接、细胞膜、细胞外基质、细胞蛋白骨架等分子功能，参与细胞粘附、细胞与基质的粘附识别、分子伴侣结合、蛋白错误折叠、未折叠蛋白反应等生物学过程。在此基础上分析差异表达基因KEGG通路，可能参与的相关的信号途径包括：内质网蛋白加工处理通路、P53信号通路、细胞衰老通路、自噬通路、抗原加工提呈通路，以及动脉粥样硬化、类风湿性关节炎等疾病相关通路。

结合差异表达基因的功能、生物学过程和已发表文献，该过程中的关键基因主要发挥了抗氧化应激、抗衰老、调节血脂血糖和免疫调控作用。

2.细胞学验证

根据上述基因分析结果，检测桑黄各成分对乳腺癌细胞MCF7的作用。

参见附图2，附图2为不同浓度桑黄成分A抗肿瘤作用经时变化曲线，从左至右的曲线中，桑黄成分A的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、0μg/mL、0μg/mL(DMSO加入量占总溶液质量的千分之一)。

参见附图3，附图3为不同浓度桑黄成分C抗肿瘤作用经时变化曲线，从左至右的曲线中，桑黄成分C的浓度分别为50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL、3.13μg/mL、1.56μg/mL、0.78μg/mL、0μg/mL、0μg/mL(DMSO加入量占总溶液质量的千分之一)。

参见附图4，附图4为不同浓度桑黄成分B抗肿瘤作用经时变化曲线，从左至右的曲线中，桑黄成分B的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、0μg/mL(DMSO加入量占总溶液质量的千分之一)。

参见附图5，附图5为不同浓度桑黄成分D抗肿瘤作用经时变化曲线，从左至右的曲线中，桑黄成分D的浓度分别为100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、0μg/mL(DMSO加入量占总溶液质量的千分之一)。

由以上附图2-5中可以看出：本发明中肿瘤细胞增殖抑制实验结果显示：水溶性成分(成分A和成分C)具有明显的抑制肿瘤细胞增殖作用，抑制作用未随药物浓度降低而降低，但抑制作用曲线随药物浓度的降低右移，即起效时间后移。成分A的最低作用浓度为6.25μg/mL，成分C的最低作用浓度为0.78μg/mL。醇溶性成分(成分B和成分D)则无明显抑制肿瘤作用，100μg/mL的成分B和成分D亦未表现出肿瘤抑制活性。

根据上述基因分析结果，检测桑黄各成分对人外周血淋巴细胞的作用。由于淋巴细胞是不贴壁细胞，未采用无标记细胞分析仪检测，以加药24h后进行细胞计数，和未加药的相比较。结果显示：加入成分A和成分C的淋巴细胞数量无明显变化，没有促进细胞增殖也没有杀伤，因此只抑制肿瘤对淋巴细胞无毒副作用。加入成分B和D的淋巴细胞培养24h后数量增加，所以成分B和D对肿瘤没有直接抑制作用，但是可以促进淋巴细胞增殖。

以上通过分别检测桑黄各成分对乳腺癌细胞MCF7和人外周血淋巴细胞的作用。可以看出：传统抗肿瘤药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常细胞，尤其对造血系统损伤引起的骨髓抑制是化疗最常见副作用，而本发明中的水溶性成分(成分A和成分C)对淋巴细胞无明显影响，即抑制肿瘤细胞的同时对淋巴细胞无毒副作用。而醇溶性成分(成分B和成分D)对肿瘤细胞无抑制作用，但可显著促进淋巴细胞的增殖，对细胞起到保护性作用，这也与表达基因分析结果相一致。

四、桑黄抗肿瘤活性成分组成的选择

根据基因分析结果，成分A和成分C主要和细胞凋亡相关，在基因分析部分给出结果，成分A和成分C调控变化的基因主要涉及肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子受体，参与细胞凋亡过程，因此，成分A和成分C是桑黄抗肿瘤作用的主要活性成分，而成分B和成分D主要涉及氧化应激等细胞保护性作用。细胞增殖实验也表明成分A和成分C可抑制肿瘤细胞生长，成分B和成分D可促进淋巴细胞增殖。

桑黄主要可从2个方面发挥抗肿瘤作用，即桑黄抗肿瘤可以直接杀伤，并且可以通过提高免疫功能，通过免疫系统间接杀伤肿瘤：通过提高宿主免疫功能间接抑制或杀灭肿瘤细胞，以及通过诱导肿瘤细胞分化或凋亡、影响癌基因表达等发挥直接抗肿瘤作用，因此考虑成分A、B和成分C、D组合作为桑黄抗肿瘤主要活性成分。

根据药物抑制曲线，成分A的最低作用浓度为6.25μg/mL，成分C的最低作用浓度为0.78μg/mL，但起效时间较迟，因此可选择作用浓度5-10μg/mL，综合比较成分C可以小于等于成分A的作用剂量发挥同样抑制效果。将成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分混合，质量比例分别设为1:1,1:2,1:4和1:8，抗肿瘤实验结果显示随比例增加活性增加，但是1:4和1:8活性增加不明显，根据提取纯化的成本产出比，选择成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分以1:4比例组合作为抗肿瘤活性成分。该比例的组合物中各组分的质量比为：甘露糖：桑黄黄酮A：异桑黄黄酮A：原儿茶醛：咖啡酸：(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇＝0.2-0.4:0.9-1.1:1.1-1.3:0.7-0.9:0.9-1.1：0.1-0.3。此活性组分既可直接诱导肿瘤细胞凋亡，又可提高宿主免疫能力间接杀伤肿瘤，因此抗肿瘤能力高于单独成分C，有效浓度更远远低于文献报道的1-100mg/ml多糖作用浓度。

五、桑黄活性组分体外抗肿瘤作用研究

分别培养人肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌细胞至对数生长期，接种于96孔细胞培养板后，加入桑黄活性组分(50μg/ml)，作用24h后倒置相差显微镜观察细胞形态变化，以下100×为显微镜的放大倍数。

参见附图6，为细胞培养过程中倒置相差显微镜采图，左图为肺癌细胞A549(100×)，右图为桑黄提取物作用A549(100×)24h后，

参见附图7，为细胞培养过程中倒置相差显微镜采图，左图为乳腺癌细胞MCF-7(100×)，右图为桑黄提取物作用MCF-7(100×)24h后，

参见附图8，为细胞培养过程中倒置相差显微镜采图，左图为耐药乳腺癌细胞MCF-ADR(100×)，右图为桑黄提取物作用MCF-ADR(100×)24h后，

参见附图9，为细胞培养过程中倒置相差显微镜采图，左图为前列腺癌细胞LNCaP(100×)，右图为桑黄提取物作用LNCaP(100×)24h后，

参见附图10，为细胞培养过程中倒置相差显微镜采图，左图为耐药前列腺癌细胞LNCaP-C4(100×)，右图为桑黄提取物作用LNCaP-C4(100×)24h后，

结果可见，桑黄提取物对各种肿瘤均有增殖抑制作用，各癌细胞在桑黄提取物作用下形态、数量均出现了较明显改变。与正常组比较，实验组癌细胞胞体皱缩，失去折光性；伪足变短或消失，细胞间互相聚集形成的细胞团瓦解、分裂；细胞数量明显减少。

参见附图11，CCK法检测各孔吸光度值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率＝(对照组A值–实验组A值)/对照组A值×100％，结果可见，与对照组相比，提取物对各种肿瘤均有抑制作用(p<0.05)，其中，对于肝癌、结肠癌等消化道肿瘤细胞作用最为显著(p<0.01)。

以下表1为桑黄提取物对各种肿瘤的抑瘤率计算数据，其中，抑瘤率＝(对照组A值–实验组A值)/对照组A值×100％。

表1

由以上表1可以看出：桑黄提取物对各种肿瘤均有抑制作用，其中，对于肝癌、结肠癌等消化道肿瘤细胞的抑制作用最为显著。

桑黄活性组分促淋巴细胞增殖作用

分别以培养淋巴细胞的常规生长因子IL-2和桑黄活性组分作用于淋巴细胞，24h后镜下观察淋巴细胞生长状况。

参见附图12，第一行左图为淋巴细胞组(100×)，右图为生长因子作用淋巴细胞组(100×)，第二行左图为桑黄提取物作用淋巴细胞组(100×)，右图为生长因子与提取物联合作用淋巴细胞组(100×)。

结果显示，与正常组对比，生长因子组、桑黄组、联合培养组淋巴细胞数量均出现升高。CCK法检测各孔吸光度值，计算细胞增殖活性，显示生长因子组、桑黄组和联合作用组增殖均显著高于对照组(p＜0.01)，且联合作用组高于单独作用组(p＜0.01)。

以下表2为分别以生长因子和桑黄活性组分作用于淋巴细胞，24h后计算得到的淋巴细胞的增值率。

表2

由表2可见，传统化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时也会杀伤正常细胞，尤其对造血系统损伤引起的骨髓抑制是化疗最常见副作用。而桑黄活性组分作用24小时后，不但未对人外周血单个核细胞造成损伤，反而显著促进细胞生长。桑黄活性组分促细胞增殖作用甚至高于生长因子，单独的桑黄提取物促进细胞增殖达135％，与生长因子联用增殖率达194％。

桑黄活性组分激活淋巴细胞杀伤肿瘤作用

分离人外周血单个核细胞，以生长因子激活PBMC后，进行肿瘤杀伤实验。检测PBMC作用肿瘤细胞后培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)释放，明确淋巴细胞：肿瘤细胞最佳杀伤效靶比为10:1-20:1。

人外周血PBMC细胞，分别加入生长因子和桑黄活性组分激活，24h后以效靶比10:1和20:1加入肺癌A549细胞，继续培养24h后检测上清中LDH含量，比较激活PBMC对肿瘤的杀伤作用。

参见附图13，附图13中，第一行左图为肺癌细胞A549(100×)，右图为淋巴细胞10:1作用A549(100×)，

第二行左图为生长因子组淋巴细胞10:1作用A549(100×)，右图为桑黄组淋巴细胞10:1作用A549(100×)，

第三行左图为淋巴细胞20:1作用A549(100×)，右图为生长因子组淋巴细胞20:1作用A549(100×)，

第四行为桑黄组淋巴细胞20:1作用A549(100×)。

结果可见，未被激活的淋巴细胞对肺癌细胞无明显杀伤作用；生长因子激活的淋巴细胞杀伤部分肺癌细胞；而桑黄活性组分激活的淋巴细胞几乎将肺癌细胞全部杀死。结果表明桑黄活性组分除促进淋巴细胞增殖，使淋巴细胞数量增加外，更可进一步激活淋巴细胞，增强其杀伤肿瘤细胞能力。

参见附图14，结果可见，桑黄活性组分对淋巴细胞有促肿瘤杀伤作用。

桑黄活性组分对细胞因子分泌的影响

分离人外周血单个核细胞，分别加入生长因子和桑黄活性组分激活，24h后用试剂盒分别检测培养上清中干扰素、TNF-α、IL-2、颗粒酶、穿孔素等含量。

参见附图15，结果可见，与对照组相比，桑黄激活的淋巴细胞干扰素、肿瘤坏死因子分泌增加，而生长因子激活的淋巴细胞IL-2、颗粒酶和穿孔素分泌稍高。提示桑黄提取物激活免疫细胞肿瘤杀伤作用的机制可能与IFN-γ、TNF-α作用相关。

综合上述肿瘤抑制研究、淋巴细胞增殖和杀伤作用研究以及细胞因子分泌变化研究，结果表明，桑黄活性组分具有显著的增强免疫功能、抑制肿瘤生长功能。

六、桑黄活性组分在体抗肿瘤作用研究

1.荷瘤动物的制备

①培养小鼠结肠癌细胞CT26至对数生长期，胰酶消化后以生理盐水制成细胞悬液，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml

②取体重18-22g，SPF级Balb/c小鼠70只，每只0.2ml细胞悬液接种于小鼠右侧腋窝下方。24h后选择状态良好的小鼠随机分为7组：

生理盐水对照组；

桑黄提取物高剂量(250μg/ml)灌胃组；

桑黄提取物中剂量(50μg/ml)灌胃组；

桑黄提取物低剂量(10μg/ml)灌胃组；

桑黄提取物高剂量(250μg/ml)腹腔注射组；

桑黄提取物中剂量(50μg/ml)腹腔注射组；

桑黄提取物低剂量(10μg/ml)腹腔注射组

2.荷瘤动物给药及结果采集

①造模后第2天开始给药。按照分组剂量分别进行腹腔注射和灌胃给药，连续给药30d。每天观察各组小鼠活动状态，进食情况。

②停药后的第二天处死动物，剥离瘤块，观察，拍照，测量直径，计算肿瘤体积。

③小鼠处死后取脾脏，提取淋巴细胞，流式细胞术检测CD3、CD4、CD8阳性淋巴细胞的含量。

结果显示：桑黄提取物分别以灌胃和腹腔注射方式连续给药30d，可见给药组小鼠一般状态良好，无体重降低、厌食反应，活动灵敏，精神状态佳。

给药30d后处死小鼠，剥离肿瘤。

参见附图16，附图中第一行为生理盐水灌胃组，第二行为桑黄提取物注射组，第三行为桑黄提取物灌胃组。

结果可见，生理盐水灌胃对照组肿瘤增殖显著，伴有恶臭，瘤块形状不规则，表面多粗糙，有大量血管增生；给予桑黄活性组分灌胃和腹腔注射组组可见肿瘤生长被抑制，肿瘤表面较光滑无坏死。尤其中剂量给药组，肿瘤生长速度、恶化程度明显低于对照组。

以下表3为不同途径给予桑黄提取物对肿瘤体积的影响：

表3

由表3可见，以生理盐水对照组，提取物腹腔注射组和提取物灌胃组对于瘤块体积的减少均有明显的作用，尤其是提取物腹腔注射组的瘤块体积减少的更多。

桑黄活性组分的在体免疫调节作用

给药30d后，处死小鼠取脾脏，流式细胞术检测CD3+、CD4+、CD8+淋巴细胞含量。

参见附图17，附图中第一行的左图为生理盐水组，右图为桑黄提取物高剂量灌胃组，第二行的左图为桑黄提取物中剂量灌胃组，右图为桑黄提取物低剂量灌胃组，第三行的左图为桑黄提取物高剂量腹腔注射组，右图为桑黄提取物中剂量腹腔注射组，第四行为桑黄提取物低剂量腹腔注射组，

结果可见，桑黄提取物可以激活淋巴细胞CD3+、CD4+增长。

参见附图18，附图中第一行的左图为生理盐水组，右图为桑黄提取物高剂量灌胃组，第二行的左图为桑黄提取物中剂量灌胃组，右图为桑黄提取物低剂量灌胃组，第三行的左图为桑黄提取物高剂量腹腔注射组，右图为桑黄提取物中剂量腹腔注射组，第四行为桑黄提取物低剂量腹腔注射组，

结果可见，桑黄提取物可以激活淋巴细胞CD8+增长。

以下表4为不同给药组荷瘤鼠脾脏各亚型淋巴细胞含量。

表4

由表4可见，对照组(生理盐水灌胃)淋巴细胞未被激活，CD3+淋巴细胞仅为3.26％，而给予桑黄提取物高、中、低剂量灌胃和腹腔注射组激活淋巴细胞均达60％左右，其中CD8+杀伤性淋巴细胞含量分别达到13.78％、17.78％、16.33％、25.37％、18.82％和19.29％；辅助性CD4+淋巴细胞含量分别为45.79％、43.2％、50.84％、41.45％、45.85％和49.61％。显著促进了淋巴细胞分化，增强了免疫功能。

以上在体实验研究结果表明桑黄活性成分可显著增强荷瘤动物免疫功能、抑制肿瘤生长，且对实验动物无毒副作用。且根据现有研究报道，常见真菌多糖在体抑制肿瘤剂量多大于1mg/ml(1-100mg/ml)，而桑黄活性组分在中低剂量(50μg/ml)下即产生了显著抑瘤作用，与其他常见真菌多糖相比，桑黄活性组分产生有效调节免疫、抗肿瘤作用的剂量降低了几十倍至上百倍。

与现有技术相比，本发明实施例具有以下有益效果：

1.目前报道的关于桑黄保健品或药物的开发，仅是直接将桑黄与其他药物或食物配伍进行桑黄保健品或功能性饮料的开发；或以桑黄提取物，例如桑黄菌粉、桑黄发酵液或提取液、桑黄多糖为主要原料制备的各种桑黄口服液、胶囊、片剂保健品或药物。而本研究通过化学及色谱成分分析手段筛选出桑黄中有效作用成分，并明确其作用功效及配伍，进而开发以该提取物作为主要成分的食品、保健品和药品。

2.本发明实施例中采用UPLC-Q-TOF-MSE技术结合UNIFI数据分析平台，应用HPLC、NMR、MS等现代色谱技术对桑黄全组分进行分析、分离，应用转录组检测技术分析明确各组分对应功效，将质谱等现代分离技术与基因组学和生物信息学分析技术结合，对桑黄中全化学成分组成、对应功效和作用机制进行全面分析探讨，为桑黄来源产品的质量控制和药效物质基础的阐明提供了科学依据，也为桑黄药用菌更加深入的开发提供重要参考依据。以此药效物质成分为基础开发的产品，功能定位更明确，功效更强，治疗作用更显著。以准确全面的成分分析为基础开发研制的食品饮料将具有更明确的适宜人群范围，且以已知功效的活性成分配伍制备保健品相比直接将桑黄与其他药物食物混合制备复方制剂，也将具备更确切的功能定位和更高疗效；分离获得的有效单体化合物更可进一步进行药品的研发和创制。

3.本发明实施例提供了一种新的桑黄药效成分组合物，通过分析可以看出：本发明中的水溶性成分(成分A和成分C)对淋巴细胞无明显影响，即抑制肿瘤细胞的同时对淋巴细胞无毒副作用。而醇溶性成分(成分B和成分D)对肿瘤细胞无抑制作用，但可显著促进淋巴细胞的增殖，对细胞起到保护性作用，这也与表达基因分析结果相一致。

4.将成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分混合，质量比例分别设为1:1,1:2,1:4和1:8，抗肿瘤实验结果显示随比例增加活性增加，但是1:4和1:8活性增加不明显，根据提取纯化的成本产出比，选择成分A+成分C的相同功效成分：成分B+成分D的相同功效成分以1:4比例组合作为抗肿瘤活性成分。该组成成分既可抑制肿瘤生长，又能显著增强免疫功能，且对实验动物无毒副作用。根据现有研究报道，常见真菌多糖在体抑制肿瘤剂量多大于1mg/ml(1-100mg/ml)，而桑黄活性组分仅需50μg/ml，其有效调节免疫、抗肿瘤作用的剂量降低了几十倍至上百倍。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (6)

1.一种桑黄抗肿瘤有效组分提取物，其特征在于，所述桑黄抗肿瘤有效组分提取物通过桑黄抗肿瘤有效组分提取物的制备方法制备得到；

所述制备方法包括如下步骤：

以桑黄为原料，对所述桑黄中分离出的全成分进行分析鉴定，将基因组学和生物信息学分析技术结合，以转录组学为基础，对所述全成分进行药效学分析确定对应功效，根据不同成分各自-对应的功效，将相同功效和功效互补成分进行筛选并组合，其中：

所述桑黄全成分的获得，包括以下步骤：

取500g桑黄，粉碎，过100目筛，加10倍量水，95℃热水回流提取三次，合并提取液得到水提成分，过滤后剩余部分继续用80％乙醇提取，5倍量乙醇，80℃下提取三次，合并提取液，回收乙醇，得乙醇提取部分；水提、醇提部分分别上正相硅胶层析柱，以蒸馏水洗涤得水提水洗组、醇提水洗组；以90％乙醇洗涤得水提醇洗组和醇提醇洗组；

A组即水提水洗组通过水提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，葡萄糖和阿拉伯糖，B组即水提醇洗组通过水提醇洗获得，主要成分包括：二氢鼠李素，咖啡酸，原儿茶醛，芫花素，山奈素，7-甲基圣草素，(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇，桑黄黄酮A和异桑黄黄酮A，C组即醇提水洗组通过醇提水洗获得，主要成分包括：半乳糖，甘露糖，岩藻糖，树胶醛糖和糖醛酸，D组即醇提醇洗组通过醇提醇洗获得，主要成分包括：桑黄黄酮A，异桑黄黄酮A，二氢山奈酚，7-甲氧基二氢茨非素，原儿茶醛，7-甲基柚皮素，二氢鼠李素，咖啡酸，(24R)-麦角甾-7-烯-2β和5α,6α-三醇；

所述桑黄中分离出的全成分通过超高效液相色谱与飞行时间质谱联用技术和UNIFI筛查平台的联合进行分离鉴定；

所述桑黄中分离出的全成分的对应功效通过以下方法确定：分别以不同浓度的所述A组、所述B组、所述C组和所述D组处理人乳腺癌MCF7细胞，通过高通量基因检测技术进行转录组学检测，对获得的差异表达基因进行生物信息学计算，分析桑黄中主要药效作用成分，并进行细胞学验证，确定所述桑黄中分离出的全成分的对应功效；

将所述相同功效和功效互补成分筛选并组合得到一种组合物，所述组合物包括：所述A组+所述C组的相同功效成分：所述B组+所述D组的相同功效成分的质量比为1:4；且所述组合物中各组分的质量比为：甘露糖：桑黄黄酮A：异桑黄黄酮A：原儿茶醛：咖啡酸：(24R)-麦角甾-7-烯-2β,5α,6α-三醇＝0.2-0.4:0.9-1.1:1.1-1.3:0.7-0.9:0.9-1.1：0.1-0.3，所述组合物即为桑黄抗肿瘤有效组分提取物。

2.一种根据权利要求1所述桑黄抗肿瘤有效组分提取物在制备抗肿瘤药物方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述桑黄抗肿瘤有效组分提取物用于抑制肿瘤生长，并促进淋巴细胞增长，所述肿瘤选自肝癌肿瘤、肺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、前列腺癌肿瘤以及结肠癌肿瘤中的至少一种。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自耐药乳腺癌肿瘤以及耐药前列腺癌肿瘤中的至少一种。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌肿瘤以及结肠癌肿瘤中的至少一种。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的应用，其特征在于，所述桑黄抗肿瘤有效组分提取物的最低有效剂量为50μg/ml。

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