具体实施方式
实施例1.
请参阅图1所示的流程图。以云南产茯苓30公斤,磨成粉后,利用120L酒精(浓度95%)萃取24小时,及过滤分离。再重复前述萃取及固液分离三次。合并滤液,并将其浓缩后得干燥萃取物265.2克。再利用一两相萃取剂(己烷∶95%甲醇=1∶1)对该干燥萃取物进行分配萃取。取出甲醇层并加予浓缩后得到干燥固体246.9克。利用硅胶管柱层析对该干燥固体进行分离,该硅胶管柱填充有该干燥固体重量10~40倍的硅胶,是购自Merck公司,Silica gel 60,70-230 mesh。以二氯甲烷/甲醇混合液作为洗脱液(eluent),依序以96∶4、90∶10、0∶100比例的混合液进行冲洗,洗脱液(eluate)以硅胶薄层层析法(Thin Layer Chromatography)(紫外光灯及碘作检测,展开液为二氯甲烷∶甲醇=96∶4)检测成分,将相同成分合并。
以二氯甲烷-甲醇(96∶4)混合液进行硅胶管柱层析,可得到属PCM部份78克,PCM部份依上述硅胶薄层层析法可明显看到6个迹点。以二氯甲烷∶甲醇(90∶10)及(0∶100)提取液层析合并可得到PCW部份168克。
PCM部份进一步以二氯甲烷∶甲醇(96.5∶3.5)作为洗脱液进行硅胶管柱层析(同上述硅胶管柱),洗脱液依硅胶薄层层析分析结果可合并得到三个部位,分别为K1(Rf=0.64)、PCM-1(含微量K1,K3(Rf=0.55),K5(Rf=0.49))和PCM-2(含K2(Rf=0.30),K4(Rf=0.24),K6(Rf=0.19))。管柱层析所得K1部位(3.5g),进一步经高效液相层析(碳-C18管柱、移动相为甲醇-水(90∶10))纯化可得K1成分3.0g。
PCM-1部位利用相同高效液相层析,以甲醇-水(87∶13)冲洗可得K3,K5及微量K1成分。K3成分利用相同高效液相层析,以甲醇-水(84∶16)冲洗可得K3(1.93g)。K5成分利用相同高效液相层析,以甲醇-水(93∶7)及(91∶9)依序纯化可得K5(47.6mg)。
而PCM-2的成分,利用相同高效液相层析法,以甲醇-水(87∶13)冲洗可得K6微量成分(K6a+K6b),K4微量成分(K4a+K4b),K2成分及K4成分。后二者K2成分及K4成分利用相同高效液相层析,以甲醇-水(84∶16)冲洗分别得K2(6.2g)及K4(0.55g)。
K6微量成分则利用相同高效液相层析以MeCN-H2O(68∶32)纯化得到K6a(21.4mg)及K6b(90.7mg);K4微量成分则利用相同高效液相层析以甲醇-水(76∶24)纯化分离得到K4a(66.0mg)及K4b(86.8mg)。
上述的K1至K6化合物,其分析数据如下:
K1:混合物,EI-MS:主成分,528[M]+;微量成分,526[M]+
K1(主成分):13C-NMR(δc):35.4(c-1),24.5(c-2),80.6(c-3),38.0(c-4),50.7(c-5),18.4(c-6),26.8(c-7),135.0(c-8),134.4(c-9),37.2(c-10),20.9(c-11),29.7(c-12),48.8(c-13),46.3(c-14),43.6(c-15),26.6(c-16),57.3(c-17),17.8(c-18),19.2(c-19),48.6(c-20),178.6(c-21),31.6(c-22),33.2(c-23),156.1(c-24),34.1(c-25),22.0(c-26),21.9(c-27),28.0(c-28),16.8(c-29),25.4(c-30),107.0(c-31),21.1(CH3COO-),170.5(CH3COO-)
K1(微量成分):13C-NMR(δc):35.6(c-1),24.5(c-2),80.6(c-3),37.8(c-4),49.7(c-5),23.1(c-6),120.6(c-7),142.8(c-8),145.8(c-9),37.6(c-10),117.0(c-11),36.3(c-12),49.4(c-13),45.1(c-14),44.4(c-15),76.4(c-16),57.6(c-17),17.6(c-18),22.8(c-19),48.4(c-20),178.5(c-21),31.4(c-22),33.2(c-25),156.0(c-24),34.1(c-25),22.0(c-26),21.9(c-27),28.2(c-28),17.1(c-29),26.5(c-30),107.0(c-31),21.1(CH3COO-),170.4(CH3COO-)
K2:混合物,EI-MS:主成分,486[M]-;微量成分,484[M]+
K2(主成分):13C-NMR(δc):36.6(c-1),29.1(c-2),78.5(c-3),40.0(c-4),51.4(c-5),19.2(c-6),27.4(c-7),135.4(c-8),135.3(c-9),37.9(c-10),21.4(c-11),30.2(c-12),49.3(c-13),46.7(c-14),44.2(c-15),77.1(c-16),57.8(c-17),18.2(c-18),19.8(c-19),49.2(c-20),179.4(c-21),32.1(c-22),33.7(c-23),156.5(c-24),34.6(c-25),22.5(c-26),22.4(c-27),29.1(c-28),16.8(c-29),25.9(c-30),107.5(c-31)
K2(微量成分):13C-NMR(δc):36.7(c-1),29.1(c-2),78.5(c-3),40.0(c-4),49.8(c-5),24.3(c-6),121.2(c-7),143.3(c-8),145.2(c-9),38.0(c-10),118.1(c-11),37.2(c-12),45.5(c-13),49.1(c-14),44.8(c-15),76.8(c-16),58.0(c-17),18.1(c-18),22.9(c-19),48.0(c-20),179.4(c-21),31.9(c-22),33.7(c-23),156.5(c-24),34.6(c-25),22.9(c-26),22.4(c-27),29.1(c-28),16.8(c-29),26.8(c-30),107.5(c-31)
K3:mp:278-280℃
[α]D 24+3(c 0.6,Pyridine)
EI-MS m/z:482[M]+,13C-NMR(δc):37.5(c-1),35.7(c-2),216.7(c-3),48.3(c-4),51.8(c-5),24.6(c-6),121.4(c-7),143.5(c-8),145.4(c-9),38.2(c-10),118.3(c-11),36.9(c-12),45.7(c-13),50.0(c-14),44.9(c-15),77.2(c-16),58.1(c-17),18.3(c-18),22.7(c-19),49.2(c-20),179.6(c-21),32.0(c-22),33.8(c-23),156.7(c-24),34.8(c-25),22.7(c-26),22.6(c-27),26.3(c-28),23.1(c-29),27.1(c-30),107.8(c-31)
K4:mp:>300℃
[α]D 24+18(c 0.5,Pyridine)
EI-MS m/z:484[M]+,13C-NMR(δc):31.4(c-1),27.4(c-2),76.0(c-3),38.6(c-4),44.5(c-5),24.2(c-6),122.0(c-7),143.5(c-8),147.4(c-9),38.6(c-10),116.9(c-11),37.0(c-12),45.9(c-13),50.2(c-14),45.1(c-15),77.3(c-16),58.2(c-17),18.4(c-18),23.7(c-19),49.3(c-20),179.8(c-21).32.1(c-22),33.9(c-23),156.7(c-24),34.9(c-25),22.8(c-26),22.6(c-27),29.9(c-28),23.9(c-29),27.3(c-30),107.9(c-31)
K4a:mp:284-287℃
[α]D 24+44(c 0.5,Pyridine)
EI-MS m/z:498[M]+,13C-NMR(δc):35.9(c-1),37.1(c-2),217.3(c-3),53.5(c-4),43.9(c-5),24.5(c-6),121.5(c-7),143.7(c-8),144.9(c-9),37.9(c-10),119.0(c-11),36.9(c-12),45.9(c-13),50.0(c-14),45.0(c-15),77.3(c-16),58.2(c-17),18.5(c-18),23.3(c-19),49.4(c-20),179.9(c-21),32.2(c-22),34.1(c-23),157.0(c-24),34.9(c-25),22.8(c-26),22.7(c-27),19.4(c-28),67.5(c-29),26.9(c-30),107.8(c-31)
K4b:mp:230-232℃
[α]D 24+38(c0.5,Pyridine)
EI-MS m/z:542[M]+,13C-NMR(δc):36.6(c-1),25.0(c-2),82.1(c-3),39.4(c-4),56.7(c-5),68.9(c-6),129.2(c-7),142.1(c-8),145.8(c-9),39.2(c-10),117.9(c-11),36.9(c-12),45.8(c-13),49.9(c-14),44.9(c-15),77.3(c-16),58.1(c-17),18.4(c-18),24.8(c-19),49.3(c-20),179.9(c-21),32.1(c-22),33.9(c-23).156.7(c-24),34.9(c-25),22.8(c-26),22.7(c-27),31.9(c-28),18.1(c-29),27.1(c-30),107.9(c-31),22.0(CH3COO-),172.0(CH3COO-)
K5:mp:274-275℃
[α]D 24+10(c 0.5,Pyridine)
EI-MS m/z:454[M]+,13C-NMR(δc):36.8(c-1),29.6(c-2),79.0(c-3),38.6(c-4),50.6(c-5),24.3(c-6),122.1(c-7),143.6(c-8),147.3(c-9),37.2(c-10),117.5(c-11),34.1(c-12),45.0(c-13),51.3(c-14),30.8(c-15),28.1(c-16),48.9(c-17),17.4(c-18),23.7(c-19),49.9(c-20),179.9(c-21),32.4(c-22),27.5(c-23),124.3(c-24),132.7(c-25),26.6(c-26),18.6(c-27),29.2(c-28),17.1(c-29),26.7(c-30)
K6a:mp:248-250℃
[α]D 24+63(c 0.4,Pyridine)
EI-MS m/z:498[M]+,13C-NMR(δc):37.1(c-1),35.0(c-2),219.0(c-3),48.4(c-4),57.0(c-5),68.0(c-6),128.6(c-7),141.8(c-8),144.2(c-9),38.3(c-10),120.2(c-11),36.6(c-12),45.8(c-13),49.7(c-14),44.8(c-15),77.2(c-16),58.1(c-17),18.4(c-18),22.7(c-19),49.4(c-20),179.6(c-21),32.1(c-22),33.9(c-23),156.8(c-24),34.9(c-25),22.8(c-26),22.7(c-27),31.5(c-28),24.5(c-269),26.6(c-30),107.9(c-31)
K6b:mp:267-270℃
[α]D 24+68(c 0.3,Pyridine)
EI-MS m/z:516[M]+,13C-NMR(δc):34.4(c-1),29.4(c-2),74.1(c-3),42.6(c-4),87.7(c-5),133.1(c-6),134.7(c-7),79.6(c-8),145.8(c-9),42.1(c-10),120.7(c-11),36.8(c-12),49.1(c-13),48.7(c-14),42.7(c-15),76.8(c-16),57.6(c-17),19.0(c-18),29.3(c-19),49.1(c-20),179.6(c-21),32.2(c-22),33.9(c-23),156.8(c-24),34.9(c-25),22.9(c-26),22.7(c-27),25.1(c-28),20.3(c-29),20.8(c-30),107.9(c-31)
上述的K1至K6化合物,其结构如下:
K1:R2=OCOCH3,主成分 K1:R2=OCOCH3,微量成分
K2:R2=OH,主成分 K2:R2=OH,微量成分
K3:R6=CH3 R5=H K4:R2=α-OH R5=H
K4a:R6=CH2OH R5=H K4b:R2=β-OCOCH3 R5=OH
K6a:R6=CH3 R5=OH
K6b K5
实施例2.
将2公斤与实施例1相同的云南茯苓粉末,以中国公开号为1008183的方法,参阅图2可得萃取物6.0克。重复实施例1步骤对6.0g萃取物进一步以二氯甲烷-甲醇(96∶4)混合液作为洗脱液进行硅胶管柱层析,可得到属PCM-E部份2.0g。以二氯甲烷∶甲醇(90∶10)及(0∶100)混合液进行冲洗,合并可得到PCW-E部份2.3g。
对照结果
将实施例2的PCM-E及PCW-E,以40mg/kg/day口服(喂食)给予动物,分别检测此二部位成分对动物脾脏细胞(免疫细胞)生长是否有促进作用或者产生抑制作用,如促进细胞增生显示有利于免疫反应,如抑制细胞增生不利于免疫反应,即对细胞产生毒性作用。
经由下述免疫学研究方法,取得(动物)离体脾脏细胞,培养5天,再以MTT assay检测(参考下述免疫学研究方法),比较细胞生长情形。
结果如表一所示,喂食PCM-E的小鼠,在第三天及第四天其脾脏细胞有增加情形,在统计上与控制组无显著差异;不过喂食PCW-E的小鼠,其脾脏细胞培养三天及四天后,活细胞数显著低于控制组,显示PCW-E有细胞毒性,减少存活细胞数。
因此,可说明含羊毛甾烷(lanostane)的低极性部位,不具脾脏细胞毒性作用,相反的是有脾脏细胞增加情形:而含开环羊毛甾烷(secolanostane)的高极性部位(Rf<0.1)则为对脾脏细胞有毒性作用。亦即,已知方法所得到的茯苓萃取物含有对脾脏细胞具毒性的极性部位(PCW-E)。
表一脾脏细胞生长情形-PCM、PCW、PCM-E、PCW-E的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组PCM-EPCW-E | 4040 |
0.608±0.042*0.890±0.1950.245±0.072* |
0.777±0.1410.857±0.1370.451±0.020** |
0.515±0.0550.449±0.0830.344±0.132 |
a:表中数据为5次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05,**表示P<0.01
由以上实施例及对照例的结果,可证实以下事项:
1.茯苓的有效成分为含有羊毛甾烷(lanostane)类化合物的低极性部位,得用来提升人体的免疫效果。
2.有效成分和毒性成分(开环羊毛甾烷或其它极性大的分子),可借助硅胶薄层层析法鉴定及以硅胶管柱层析法分离。
3.以本发明的制备方法制得的低极性部位(PCM)含有羊毛甾烷类化合物的,且去除开环羊毛甾烷类毒性成分,因此提升免疫力效果及安全性显著增强,远优于传统已知萃取法所萃取出的茯苓萃取物。
4.上述动物实验是经由口服吸收后,再检验对于脾脏细胞的作用,与传统利用体外细胞试验有不同意义。因体外细胞实验避开药物吸收,体内分布和代谢对药物的影响,无法反应药物真正作用,因此,体内实验意义较体外所显示意义更为可信赖。
由于免疫反应为一复杂过程,本发明的萃取物及层析纯化物,是依据免疫试验按照下列几项研究而测得具免疫功能:
1.由动物的血清中得知抗体变化情形。
2.利用脾脏细胞(含免疫细胞)测定
(1)淋巴球增加(或减少);
(2)淋巴球类族群变化;
(3)自然杀手细胞活性;
(4)抗体的分泌;及
(5)细胞激素的分泌。
3.腹腔巨噬细胞吞噬力。
如实施例1所示,本发明经硅胶管柱层析及高效液相层析,可分离或纯化出云南产茯苓的羊毛甾烷类成分,K1、K2、K3、K4、K4a、K4b、K5、K6a及K6b(其中K1及K2因化合物性质,虽使用高效液相层析仍无法分离其内的微量成分),将硅胶层析的K1及高效液相层析所得的K2、K3及K4进行免疫增强研究(如免疫学研究项下),由表二至表十实验结果,显示K1、K2、K3及K4化合物在实验最低浓度(2.5mg/kg或5mg/kg)下,就能对免疫细胞(T细胞/B细胞),出现免疫增强作用。
据此,可确认茯苓的有效成分,是羊毛甾烷类成分,其中PCM及主要成分K1、K2、K3、K4均具有加强免疫细胞的效能。
研究方法:(免疫学研究)
实验动物
BALB/c小白鼠:6-8周大,雄性,购自国家动物中心,饲养于国立台湾师范大学生物系动物房,饲养环境采用标准无特殊病源动物(SPF)、独立吹尘式无菌动物笼架(Individual Ventilation Cage System,IVC),所饲养动物所用的饮水、木屑及饲料皆经高温高压灭菌处理,温度保持在24~26℃,湿度保持在30~70%,照明使用定时器以确保规律的光照周期,以一天12小时日12小时夜循环,饲料购自台大动物中心(粗蛋白23.5%以上;粗脂肪4.5%以上;粗纤维6%以下;水份12%以下;灰份9%以上),饲养两周后,即进行实验。
动物处理
动物被分成4组(或3组),喂食给药1毫升的萃取物或纯化成分,4天药物剂量范围如为PCM则剂量为10、40、80mg/kg/day,如为纯化物K1及K2,剂量为上述4分之一,即2.5、5、10、20mg/kg/day,对照控制组则不给药而以等体积无菌水取代,老鼠在第五天牺牲后,收集其血清及脾脏细胞作研究材料,血清部份则测其抗体,即IgG、IgM和IgA、脾脏细胞则被置入10公分直径的培养皿,然后于37℃下培养3小时,去除附着性细胞,非附着性细胞包括T、B、NK等细胞,收集后按下列各项实验指示处理。
药物处理
茯苓成分加入无菌水,使用超音波处理使成悬浮状溶液。
分离脾脏淋巴球
经断颈及70%酒精喷洒消毒后,先以23G needle心脏抽血,待凝血后,离心分离出血清备用,再用剪刀剪开其皮肤及腹膜,取出脾脏。脾脏取出后,打开胸腔,直接由心脏取血,制备血清,以备进一步实验。另准备一盛有10ml RPMI-1640细胞培养液的培养皿,其中放入细胞研磨器,将脾脏置于细网上以研磨器磨碎,使细胞分离而悬浮于培养液中。如此收集到的脾脏细胞自培养皿吸出,装入50ml离心管中,放置离心机,以1300rpm离心10分钟。加1ml cold RBC lysing buffer(EDTA-NH4Cl)处理10分钟,以去除红血球。离心清洗三次后,将细胞移至培养皿中,于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2、100%饱和湿度)放置三小时,使附着性细胞附着于培养皿上,随后收集非附着性细胞,其中主要含脾脏淋巴球。
MTT法
MTT法是分析细胞存活数或活性常用方法,基本原理是利用活细胞中粒线体的氧化还原酵素对受质作用,产生颜色的变化,再进一步测定其吸光值((Mosmann,J.Immunol.Method.,65,55-63(1983))。详细方法如下:
将分离好的脾脏淋巴球调成5×106cell/ml,置入96well的培养盘中,每well加100μl。一个sample加5个格,并每个well加入1μl ConA(1mg/ml)(Sigma,MO.USA),最后置于37℃、5%CO2、100%饱和湿度培养箱中培养,于第三天、第四天及第五天以MTT法测试
方法如下:先加入MTT试剂(3-「4,5-dimethylthiazol-2-yl」-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)(Sigma,MO.USA)20μl后,放在培养箱中作用4小时。4小时后取出培养盘,每个格加入acid-isopropanol(0.04N HCl in isopropanol)120μl,充分混合以溶解培养底部深蓝色结晶。再置于培养箱20分钟,20分钟后以ELISA测读仪(波长570nm)读取吸光值,以分析细胞存活数。
酵素免疫分析法测定免疫球蛋白
本研究采用sandwich ELISA方法,简述如下:将分离好的脾脏淋巴细胞悬浮在含10%胎牛血清,2mM glutamine,100u/mlPenicillin/Streptomycin及5ug/ml脂多醣(LPS)的RPMI 1640培养基中(称为完全培养基),调成5×105cell/ml,细胞随后置入24-well的培养盘中,每格加入1ml,在37℃、5%CO2、100%饱和湿度中培养5天,然后收集上清液作ELISA测试。
1.测IgG:
首先将goat anti-Mouse IgG+A+M(H+L)(Zymed,CA USA),1mg/ml稀释成1/1000加入96格的ELISA plate(Nunc,Denmark),每格加入100μl,放在4℃中隔夜,翌日,拿出plate用0.05%PBS-Tween20洗三次,吸干。以1%PBS-gelatin进行blocking,每格加入100μl,放在37℃下作用60分钟。将血清样品用RPMI 1640稀释十万倍(1/105),而培养脾脏细胞的上清液样品则不稀释。IgG标准液序列稀释为:0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0.0078、0.0039、0μg/ml等各浓度。取出放在37℃培养箱中的plate,以0.05%PBS-Tween20清洗三次并吸干,随后分别加入待测样品及标准液各100μl,在37℃培养箱中作用二小时。拿出ELISA plate,续用0.05%PBS-Tween20清洗三次并吸干后,再加入goat anti-mouseIgG-HRP(稀释1/1000)每格加入100μl,续于37℃中作用60分钟,最后再用0.05%PBS-Tween20洗三次,并加入100μl的受质(0.1%O-phenylenediamine;0.1M citrate buffer,pH 4.5;0.03%H2O2),于室温中作用30分钟。最后用ELISA reader(主波长490nm,辅波长630nm)读O.D.值。参考标准曲线,算出各待测样品所含IgG的浓度。
2.测IgM:
IgM的测试方法与IgG相似,血清样品用RPMI 1640稀释一万倍(1/104),上清液样品则不稀释。IgM标准液序列稀释为:1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156、0μg/ml等各浓度。二次抗体使用goatanti-mouse IgM-HRP(稀释1/1000)。
3.测IgA:
IgA测试方法与IgG相似,ELISA plate附上sheep anti-mouse IgA(稀释成1/1000),血清样品用RPMI 1640稀释一万倍(1/104),上清液样品则不稀释。IgA标准液序列稀释为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0μg/ml等各浓度。二次抗体使用goat anti-mouse IgA-HRP(稀释1/1000)。
酵素免疫分析法测定细胞激素(IL-10及IFN-γ)
将分离好的脾脏淋巴细胞以完全培养基调成1×106cell/ml,不过以ConA(1μg/ml)取代LPS,随后细胞置入24-well培养盘中,每格加入1ml,在37℃、5%CO2,100%饱和湿度下培养3天,第3天取上清液测IL-10及IFN-γ。
1.测IL-10
以Cyto Set ELISA kit(R&D Systems,MN,USA)测定之,方法简述如下:以抗mIL-10单株抗体为一次抗体附在ELISA plate上,每格加入100ul的mIL-10标准品浓度由500pg/ml序列稀释至15.6pg/ml或待测样品,37℃中作用20分钟后,以冲洗液冲洗五次,每格再加入100ul的biotinylated conjugated anti-IL-10(二次抗体),37℃中作用20分钟,以冲洗液冲洗五次,每格再加入100μl的HRP conjugatedstreptoavidin,37℃中作用20min后,以冲洗液冲洗五次,每格再加入50μl的substrate solution(含H2O2及tetramethylbenezidine;TMB),以ELISA Reader(450nm)测O.D值,再以标准曲线求样品的IL-10浓度。
2.测IFN-γ
以Cyto Set ELISA kit(R&D Systems,MN,USA)测试方法与mlL-10相似,ELISA plate附上以抗m IFN-γ单株抗体(一次抗体),二次抗体为biotinylated conjugated anti-IFN-γ,标准品浓度由600pg/ml序列稀释至18.8pg/ml。
T细胞CD4
+
及CD8
+
次族群分析
将已经收集好的脾脏淋巴球放入Falcon tube,将细胞调成1×106cell/ml,加入各1μl的Phycoerythin(PE)-conjugated anti-mouse CD4、Fluorescein isothiocyanate(FITC)-conjugated anti-mouse CD8,在室温避光环境下作用15分钟后,加入3ml无菌冷却的PBS,以1300rpm离心10分钟,离心后吸除上清液,均匀打散细胞,加入0.5ml含1.0%paraformaldehyde的冷却PBS,并轻微地振荡混合,随即用流式细胞仪(Flow cytometry;Becton Dickinson FACS,Sam,CA)进行萤光阳性细胞比例分析。
自然杀手细胞活性分析
为了测定动物的自然杀手细胞活性,须先培养自然杀手细胞的目标细胞(YAC-1细胞株),将生长良好的YAC-1细胞株配制成1×105cell/ml加入2μl DiOC18(绿色萤光标示目标细胞),于二氧化碳于培养箱中培养20分钟。20分钟后,取200μl YAC-1(Target cells)及200μl分离好的脾脏淋巴球(Effector cells),配成T∶E比例分别为1∶50、1∶25、1∶12.5的细胞混合液,另一管只加YAC-1当作负控制组,细胞混合液放入二氧化碳培养箱放置2小时,2小时后加入50μl Propidium Iodide(红色萤光,渗入死亡细胞中,标示细胞核),置于冰浴中10分钟,在4℃避光环境下立即用流式细胞仪分析。
吞噬细胞活性分析
先制备老鼠腹腔巨噬细胞,方法如下:老鼠牺牲前三天以腹腔注射10%2.5ml proteose peptone,三天后断颈将老鼠致死,用剪刀把腹腔表皮剪开,打入3.0ml无胎牛血清的DMEM,用镊子轻拍腹腔约3分钟后,用空针取出腹腔液,以DMEM加至10ml,即以1300rpm离心10分钟,收集的腹腔细胞调成1×107/ml。
一个sample准备二根falcon tube,各加入100μl巨噬细胞悬浮液,放置冰上10分钟,随后加入100μl FITC-conjugated Escherichiacoli(K-12)5×107cells/ml,两管中一管放置冰上15分钟(负控制组),另一管放置37℃15分钟,作用结束后各加入100μl trypan blue混合均匀,以cold PBS 3ml于1300rpm离心5分钟,如此将细胞清洗两次后,加入500μl 1%paraformaldehyde,即可用流式细胞仪分析,有吞噬E.coli的巨噬细胞发出黄绿色萤光。
统计方式
以Mann-Whitney Rank Sum Test,分析服药组与控制组之间的关系,P值≤0.05视为显著差异。
研究结果:
(1)脾脏细胞生长情形-PCM、K1、K2、K3及K4的作用
如表二所示,口服PCM、K1、K2、K3及K4的小鼠脾脏细胞与控制组(喂食无菌水)相较结果:服用PCM 40mg/kg/day的小鼠在培养第三天后,活细胞显著多于控制组。而K1、K3及K4服用5mg/kg/day以上,K2服用10mg/kg/day以上在培养第三天,活细胞显著多于控制组。
表二~1脾脏细胞生长情形-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 | 5 |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
0.359±0.076a0.453±0.0280.551±0.040*0.475±0.0830.497±0.0800.642±0.078**0.743±0.083**0.634±0.048**0.533±0.069*0.489±0.0870.928±0.078***0.655±0.075** |
0.481±0.0440.398±0.0570.401±0.0310.410±0.0830.533±0.0700.652±0.0770.733±0.035***0.571±0.0910.460±0.0520.480±0.0720.931±0.065***0.605±0.072 |
0.414±0.0670.301±0.0590.445±0.0550.447±0.0750.584±0.060*0.469±0.0540.562±0.025*0.452±0.0490.414±0.0540.527±0.0620.585±0.011*0.530±0.057 |
a:表中数据为MTT测试所获得的570nm波长吸光值(O.D.);数据为10次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
表二~2脾脏细胞生长情形-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
0.373±0.0701.154±0.172***1.020±0.090***1.103±0.081***0.949±0.101**1.198±0.101***1.233±0.040*** |
0.404±0.0330.841±0.160*0.900±0.193**1.068±0.132***0.981±0.087***1.273±0.147***1.263±0.041*** |
0.431±0.0440.864±0.1940.957±0.200*0.943±0.159**0.862±0.085**1.177±0.078***1.061±0.124*** |
a:表中数据为MTT测试所获得的570nm波长吸光值(O.D.);数据为6次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
(2)血清中免疫球蛋白浓度变化-PCM、K1、K2、K3及K4的作用如表三所示,口服40mg/kg/day以上的PCM显著提升小鼠血清中IgG的浓度,而喂食K1、K2及K45mg/kg/day以上的血清IgG浓度显著高于控制组;相反的,喂食5mg/kg/day以上的K3则IgG血清浓度显著低于控制组。喂食PCM 40mg/kg/day、K1 10mg/kg/day、K22.5mg/kg/day、K3 5mg/kg/day及K4 5mg/kg/day以上的血清IgM浓度显著高于控制组。口服80mg/kg/day的PCM显著抑低小鼠血清中IgA的浓度。然而,K1 10mg/kg/day则显著提高IgA浓度,K2、K3及K4于所测试浓度下对IgA并无影响。
表三~1血清免疫球蛋白浓度-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
免疫球蛋白浓度(mg/ml) |
IgG |
IgM |
IgA |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
1.81±0.19a2.38±0.284.36±0.88*4.53±0.92*1.57±0.322.83±0.41*3.00±0.53**3.74±0.62**1.69±0.242.95±0.17**3.75±0.54***5.11±0.72*** |
0.90±0.181.31±0.131.96±0.18***2.07±0.21***1.27±0.221.38±0.243.27±0.47***1.46±0.272.82±0.41***3.46±0.61***2.58±0.38***5.13±0.95*** |
3.67±0.543.40±0.252.54±0.282.26±0.26*3.51±0.334.03±0.476.57±0.71**3.79±0.352.85±0.362.81±0.284.33±0.335.02±0.65 |
a:表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05,**表示P<0.01;***表示P<0.001
表三~2血清免疫球蛋白浓度-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
免疫球蛋白浓度(mg/ml) |
IgG |
IgM |
IgA |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
1.80±0.111.32±0.09**1.28±0.13**1.14±0.11**3.75±0.18***4.33±0.29***4.18±0.25*** |
1.11±0.131.63±0.11**1.53±0.14*1.53±0.13*2.65±0.21**2.86±0.16**2.36±0.16** |
3.15±0.483.65±0.263.81±0.463.55±0.373.33±0.133.39±0.253.54±0.12 |
a:表中数据为6次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05,**表示P<0.01;***表示P<0.001
(3)离体培养下,脾脏细胞分泌抗体的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用
3-1:离体培养下,脾脏细胞分泌IgG的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用,如表四所示,口服40mg/kg/day PCM小鼠脾脏细胞培养三天后,IgG分泌有显著增加,而K1 5mg/kg/day以上及K2 10mg/kg/day以上则IgG分泌有显著增加,相反的,K3 5mg/kg/day以上IgG分泌有显著抑制,而K4 5mg/kg/day以上,培养至第五天,IgG分泌有显著增加。
表四~1脾脏细胞分泌IgG(ng/ml)的能力-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
7.40±1.07a4.24±0.6916.37±3.11*10.84±3.4219.65±5.7341.53±8.68***38.43±11.09***59.53±13.04***8.32±2.535.97±2.7012.95±2.17*25.93±10.15* |
10.00±1.426.00±0.97*17.42±3.418.67±3.3319.88±5.2632.94±8.84***30.01±7.40***65.55±17.30***15.32±3.6710.48±3.7711.94±2.2427.41±10.98* |
11.21±1.316.46±0.94*13.67±3.739.20±3.1813.34±3.6633.27±6.14**34.49±8.27***70.58±20.47***9.02±2.3413.34±3.8317.97±2.07**22.82±5.96* |
a:表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
表四~2脾脏细胞分泌IgG(ng/ml)的能力-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
7.17±0.893.85±0.73**3.18±0.55**6.12±0.7012.55±3.086.54±1.4321.23±3.19** |
12.04±0.463.43±0.40**3.16±0.62**7.10±1.39*12.99±0.8615.15±5.1619.11±4.23 |
9.55±0.774.46±0.95**3.48±0.43**8.56±1.3418.29±0.92**22.59±5.35*22.56±3.84* |
a:表中数据为6次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05;**表示P<0.01;
3-2:离体培养下,脾脏细胞分泌IgM的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用如表五所示,口服40mg/kg/day以上的PCM,10mg/kg/day以上的K1及K3,2.5mg/kg/day以上的K2,5mg/kg/day以上的K4小鼠脾脏细胞,从培养第三天起,其IgM的分泌量皆显著高于控制组。
表五~1脾脏细胞分泌IgM(ng/ml)的能力-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
138.27±42.55*184.37±36.35375.07±13.6***328.96±24.46***181.30±34.26223.32±51.46356.52±28.8***267.18±58.97378.0±55.5***457.81±87.3**540.23±68.8***837.1±114.5*** |
171.10±39.90251.78±37.64352.16±17.60***322.79±23.76*201.03±33.98233.67±31.32362.17±31.1**280.79±32.08*479.8±60.9***507.62±91.9**512.47±84.20***695.2±144.7** |
184.29±30.97273.91±33.30323.52±13.70***296.89±12.42**190.20±38.67249.35±38.32527.33±41.00***320.44±41.39*254.4±30.8334.75±48.7*550.54±50.10***591.5±108.4*** |
a:表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;
*表示P<0.05;**表示P<0.01;***表示P<0.001
表五~2脾脏细胞分泌IgM(ng/ml)的能力-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
121.91±34.35222.42±42.83287.66±44.44*372.14±69.48*463.65±76.41***514.45±70.30***747.6±128.42*** |
200.75±32.77214.45±28.51294.30±30.68*519.53±52.63***688.17±85.78***733.58±95.70***746.50±157.76*** |
219.30±18.60277.52±101.63309.51±30.88*606.44±88.10**649.89±70.09***807.32±104.21***857.49±92.19*** |
a:表中数据为6次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05;**表示P<0.01;
***表示P<0.001
3-3:离体培养下,脾脏细胞分泌IgA的能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用,如表六所示,口服不同剂量的PCM小鼠,脾脏细胞培养三天后,IgA分泌量显著低于控制组;相反的,口服K1 10mg/kg/day,培养第3天至第5天后IgA分泌显著高于控制组,口服K210mg/kg/day以上,IgA分泌显著高于控制组。口服5mg/kg/day K3培养第4天之后,IgA分泌显著低于控制组,口服5mg/kg/day K4培养第5天之后,IgA分泌显著高于控制组
表六~1脾脏细胞分泌IgA(ng/ml)的能力-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
130.48±30.76a50.67±13.28**84.31±8.0936.03±4.10**118.64±19.79148.60±24.55432.11±48.1***145.93±26.52133.90±33.39155.67±18.66239.64±43.1*273.20±54.87* |
144.72±31.0666.09±8.68*94.72±10.6446.16±5.09**94.65±53.54127.93±66.0378.5±196.2***144.08±84.36181.00±47.98142.89±26.86258.20±46.4*211.48±57.82 |
128.56±35.5274.73±15.17125.41±8.5156.05±7.71*108.37±16.01148.81±22.97422.74±76.67**179.0±18.86277.13±101.194.91±12.07260.00±40.93*324.7±153.4** |
a:表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05;**表示P<0.01;
***表示P<0.001
表六~2脾脏细胞分泌IgA(ng/ml)的能力-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
培养天数(天) |
3 |
4 |
5 |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
58.21±12.6332.83±7.0026.57±3.68*43.08±4.0555.56±4.7166.43±5.26119.59±15.08** |
66.92±17.1627.37±5.83*28.97±5.95*43.45±5.9279.51±3.7495.39±10.08101.53±25.08 |
73.41±14.6421.96±4.17**18.87±2.66**30.50±3.60*106.69±7.29*121.97±12.69*133.16±20.09* |
a:表中数据为6次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05;**表示P<0.01;
(4)脾脏细胞分泌TH1型及TH2型细胞激素分泌能力-PCM、K1、K2、K3及K4的作用
TH1型免疫反应主要激发细胞性免疫反应,而TH2型免疫反应主要激发体液(抗体)性免疫反应。如表七所示,本研究检视小鼠口服PCM、K1、K2、K3及K4之后,脾脏细胞分泌TH1型细胞激素(Interferon-γ;IFN-γ)及TH2型细胞激素(Interleukin-10;IL-10)的变化;发现小鼠服用10mg/kg/day及80mg/kg/day的PCM后IFN-γ的分泌显著高于控制组。服用K1及K2 2.5mg/kg/day以上,IFN-γ的分泌显著高于控制组;服用5mg/kg/day及10mg/kg/day的K3 IFN-γ的分泌显著高于控制组;服用20mg/kg/day的K4 IFN-γ的分泌显著高于控制组。IL-10的分泌在服用PCM、K3及K4之后,没有明显的变化,然而,服用K12.5mg/kg/day以上,K2 5mg及20mg/kg/day,则显示明显增加IL-10的分泌。
表七~1脾脏细胞分泌IFN-γ及IL-10的变化-PCM,K1,K2的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
细胞激素(pg/ml) |
IFN-γ |
IL-10 |
控制组PCMPCMPCMK1K1K1K1K2K2K2K2 | 1040802.5510202.551020 |
254.14±55.68a465.11±26.6**264.79±48.36433.44±31.10**428.7±38.9*673.33±96.73**682.28±73.78**783.97±76.1***414.80±31.3*432.70±50.22*348.45±72.56*457.48±57.60** |
103.91±20.36115.90±17.2977.31±9.31181.97±33.26170.28±13.0*178.76±24.56*176.17±45.24334.7±45.8***135.71±19.89226.48±55.67*135.62±48.15195.27±40.0* |
a:表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05,**表示P<0.01;***表示P<0.001
表七~2脾脏细胞分泌IFN-γ及IL-10的变化-K3,K4的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
细胞激素(pg/ml) |
IFN-γ |
IL-10 |
控制组K3K3K3K4K4K4 | 5102051020 |
124.25±28.15a917.07±130.41*449.74±100.67*176.20±45.96240.45±107.83252.26±103.76292.00±77.77* |
107.80±20.79262.09±108.4186.48±33.2698.74±27.05128.91±45.46197.39±68.73155.91±26.16 |
a:表中数据为6次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05
(5)T淋巴球CD4+8-及CD4-8+次族群的变化
CD4+CD8-T细胞主要是辅助型T细胞(Helper T-cells),而CD4-CD8+主要是胞杀型T细胞(Cytotoxic T-cells)。如表八所示,本研究以不同浓度PCM喂食小鼠后 ,取出脾脏细胞,分离出非附着性细胞,进行免疫萤光测试。结果显示CD4+8-细胞所占的比例有上升趋势,但与控制组相较无显著差异;不过,CD4-8+细胞所占的比例,与控制组比较,有显著增加的现象。由于CD4+8-细胞也有增加的趋势,故CD4/CD8比例没有显著变化。CD4-8+T细胞的增加,与脾脏细胞IFN-γ分泌量增加的现象相吻合,因为CD4-8+T淋巴球是「专一性细胞免疫反应」的主要反应细胞(effector cells)。
表八 T淋巴球次族群的变化-PCM的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
萤光阳性细胞百分比(%) |
CD4 |
CD8 |
CD4/CD8 |
控制组PCMPCMPCM | 104080 |
23.40±2.31a28.67±2.5427.72±0.6629.95±2.75 |
12.50±0.8215.31±0.72*16.67±1.08**16.76±1.29** |
1.871.871.661.79 |
a:表中数据为5次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05,**表示P<0.01
(6)自然杀手细胞活性
自然杀手细胞(Nature killer cells;NK cells)为对抗肿瘤细胞及病毒感染细胞的非专一性胞杀细胞,小鼠口服PCM后,分离非附着性脾脏细胞,测试其所含的NK细胞活性。如表九所示,口服10mg/kg/day的PCM有显著增加NK细胞活性的现象,高于此剂量则没有增强NK活性的现象。IFN-γ为促进NK细胞活化的细胞激素,此数据也与IFN-γ分泌量增加的现象相吻合。
表九自然杀手细胞活性-PCM的作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
Target∶Effector |
1∶12.5 |
1∶25 |
1∶50 |
控制组PCMPCMPCM | 104080 |
16.57±0.61a14.24±2.1818.62±2.6215.54±3.49 |
17.04±1.0620.78±1.2518.20±2.0218.27±2.05 |
16.57±0.6123.12±2.86*20.99±3.5916.35±0.90 |
a:数据为目标细胞(YAC-1)死亡百分比,即propedium iodide阳性反应细胞比例。数据为5次实验的mean±S.E.M,*为P<0.05
(7)腹腔巨噬细胞吞噬能力
巨噬细胞(macrophages)为免疫系统中主要的吞噬细胞之一,负责清除入侵的病原菌及体内坏死的细胞。如表十所示,本研究以PCM喂食小鼠后,分离出腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophages),再以带有萤光之K-12大肠杆菌为目标细胞,观察其吞噬能力。结果显示,口服40及80mg/kg/day的PCM后,腹腔巨噬细胞随着PCM浓度增加,显著增强对大肠杆菌的吞噬能力。
表十腹腔巨噬细胞吞噬作用
成分 |
剂量(mg/kg/day) |
吞噬作用 |
控制组PCMPCMPCM | 104080 |
20.88±3.90a17.08±1.8227.49±3.99*38.22±2.20** |
a:数据为巨噬细胞有吞噬目标细胞占所有巨噬细胞百分比,表中数据为10次实验的Mean±S.E.M;*表示P<0.05,**表示P<0.01